BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1. Analisis STR
Pada pertengahan tahun 1990, teknologi berubah meliputi penggunaan
PCR menjadi STR. Reaksi PCR diibaratkan seperti fotokopi molekuler. Hal
tersebut memungkinkan amplifikasi penguraian jumlah DNA yang sangat kecil.
Dengan PCR, kurang dari atau sama dengan 1 ng dapat dianalisis. Sedangkan
dengan lokus STR terpilih memiliki alel yang lebih kecil lagi, antara 100 sampai
400 bp. Resolusi potongan kecil oleh polycrylamide gel electrophoresis (PAGE)
sangat mengalami kemajuan dibandingkan dengan metode sebelumnya yang
menganalisis potongan beberapa kb.7
Tes DNA dilakukan dengan cara mengambil DNA dari kromosom sel
tubuh (autosomal) yang mengandung area STR, suatu area ini tidak memberi kode
untuk melakukan sesuatu. STR inilah yang unik karena berbeda pada setiap orang.
Perbedaannya terletak pada urutan pasangan basa yang dihasilkan pada
pengulangan STR. Pola STR ini diwariskan dari orang tua. Sementara itu,
Federal Bureau of Investigation (FBI) menggunakan satu set dari 13 daerah STR
khusus untuk CODIS. CODIS merupakan program software yang mengoperasikan
database dari profil DNA lokal, daerah dan nasional dari tersangka, bukti tindak
kriminalitas yang belum selesai kasusnya dan orang hilang. Kemungkinan bahwa
dua individu mempunyai 13 loci yang sama pada profil DNAnya adalah sangat
jarang.8

STR merupakan susunan DNA sehingga diturunkan menurut hukum

mendel dari kedua orang tua. Pada setiap lokus STR, setiap anak memiliki dua
buah alel, dimana satu alel berasal dari ibu (DNA maternal) dan alel satunya lagi
berasal dari ayah (DNA paternal). Analisis STR dalam bidang forensik dapat
dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu analisis ayah-anak-ibu (FCM analysis)
dan analisis perbandingan (matching analysis).3
1. Analisis FCM
Pada analisis FCM dilakukan perbandingan alel STR tersangka ayah,
anak, dan ibu, dicari apakah DNA paternal anak ada padanannya atau
tidak dengan salah satu DNA tersangka ayah. Adanya kesesuaian pada
semua lokus STR yang diperiksa menunjukkan bahwa tersangka ayah
adalah ayah biologis dari anak tersebut. Ketempatan kesimpulan ini
diklkulasikan melalui perhitungan paterny index (PI) dengan
memakai data frekuensi alel pada populasi yang sama. PI adalah
suatu angka yang menyatakan berapa kali seorang tersangka ayah
lebih mungkin menjadi ayah biologis dari seorang anak, jika
dibandingkan dengan pria lain yang diambil secara acak dari populasi
yang sama. Ditemukannya ketidaksesuaian DNA paternal anak
dengan DNA tersangka ayah pada dua atau lebih lokus STR yang
diperiksa memastikan bahwa tersangka ayah adalah bukan ayah
biologis dari anak tersebut.3
Aplikasi teknik ini misalkan pada tes DNA paternalitas. Cara
memeriksa tes DNA dilakukan dengan cara mengambil STR dari
anak. Selanjutnya, di laboratorium akan dianalisa urutan untaian STR

ini apakah urutannya sama dengan seseorang yang dijadikan pola dari
seorang anak. Selanjutnya, di laboratorium akan dianalisa urutan
untaian STR ini apakah urutannya sama dengan seseorang yang
dijadikan pola dari seorang anak. Urutan tidak hanya satu-satunya
karena pemeriksaan dilanjutkan dengan melihat nomor kromosom.
Misalnya, hasil pemeriksaan seorang anak ditemukan bahwa pada
kromosom nomor 3 memiliki urutan kode AGACT dengan
pengulangan 2 kali. Bila ayah atau ibu yang mengaku orang tua
kandungnya juga memiliki pengulangan sama pada nomor kromosom
yang sama, maka dapat disimpulkan antara 2 orang itu memiliki
hubungan keluarga. Seseorang dapat dikatakan memiliki hubungan
darah jika memiliki urutan dan pengulangan setidaknya pada 16 STR
yang sama dengan kelurga kandungnya, maka kedua orang yang dicek
memiliki ikatan saudara kandung atau hubungan darah yang dekat.
Jumlah ini cukup kecil dibandingkan dengan keseluruhan ikatan spiral
DNA dalam tubuh kita yang berjumlah miliaran.8
2. Matching analysis
Pada analisis perbandingan dilakukan perbandingan antara dua set
profil DNA dari dua buah sampel. Atas dasar ketentuan bahwa semua
sel dari individu yang sama memiliki profil DNA yang sama, maka
dua sampel yang memiliki profil DNA yang sama pastilah berasal
dari individu yang sama. Analisis ini dilakukan untuk mengacak
sumber bahan biologis berupa cairan maupun bercak (darah, liurm
mani), rambut, jaringan, potongan tubuh, dan lain-lain. Setelah

didapatkan dua profil DNA adalah identik, maka harus dilakukan

matching

probability

(MP),

yang

dikalkulasikan

dengan

menggunakan frekuensi alel yang terdapat pada populasi yang sama.

MP adalah suatu angka yang menyatakan bahwa suatu sampel
tertentu sekian kali lebih mungkin berasal dariseorang individu yang
lain diambil secara acak dalam populasi yang sama. Dengan
demikian, semakian tinggi MP maka semakin meyakinkan bahwa
suatu sampel berasal dari individu tertentu.3
Secara umum analisis PCR berdasarkan profil STR sensitif pada sekitar
250 pg. Namun, pola konsentrasi dalam susunan 0.5-1.0 ng yang biasa dianalisis.
Untuk meningkatkan sensitivitas sampel DNA di bawah ambang ini, perlu
ditingkatkan menjadi 34 putaran. Hal ini memberikan faktor amplifikasi teoritikal
dari 17,179,869,184 dan dapat memenuhi sampel analisis yang hanya memiliki
sangat sedikit jumlah DNA.Pengenalan analisis PCR-based STR adalah inovasi
utama yang memperluas kegunaan profil DNA.8
STR mengandung regio susunan yang berulang panjang antara 1 sampai 6
bp dan memiliki alel yang secara umum panjangnya kurang dari 350 bp. Lokus
STR dikarakteristikan memiliki jumlah yang besar tetapi hanya sekitar 20 yang
biasanya dianalisis dalam kasus forensik. STR yang sering digunakan dalam kasus
forensik memiliki empat atau lima pasangan dasar motif susunan berulang dan
dapat diklasifikasikan sebagai pengulangan sederhana, pengulangan sederhana
dengan pengulangan non-consensus, pengulangan kompleks.9
2. Lokus STR 13 lokus DNA STR

Lokus polymorphic short tandem repeat yang melimpah ruah sepanjang

genom manusia menggambarkan karakterisasi inisial beberapa lokus melalui
metode genotipe PCR-based multipleksing pada awal tahun 90an. Melalui revisi
dan validasi, saat ini ada 13 polymorphic STR (CSF1PO, TH01, TPOX, FGA,
D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,D13S317,D16S539,D18S51,D21S11,

dan

vWA) dan satu lokus penentu jenis kelamin (amelogenin) dapat dipelajari dalam
tiga amplifikasi PCR, menghasilkan 14 lokus profil DNA meskipun ketika hanya
satu menit DNA ditemukan dalam sampel forensik. Karakteristik genetik dalam
lokus ini, seperti lokasi kromosom, pengulangan motif, jarak ukuran pengulangan
biasanya ditemukan berbeda pada setiap orang.10
Beberapa fitur memiliki karakteristik yang jelas pada lokus STR.
Pertama, dua dari 13 lokus STR berlokasi pada kromosom yang berbeda. Dua
lokus STR (CSF1PO dan D5S818) yang berlokasi pada kromosom yang sama
sebenarnya juga berjauhan (CSF1PO berada pada lengan 5q33.3-34 dan D5S818
pada lengan 5q23.3-32). Hal ini berarti bahwa tidak mungkin untuk mengamati
genotipe yang berkolerasi pada lokus ini, kecuali pada populasi yang terisolasi dan
yang memiliki bakat atau sangat terstruktur. Lokasi genom pada lokus ini
menyatakan bahwa genom-genom tersebut tidak mungkin memiliki fungsi utama
yang signifikan. Batasan ukuran alel yang diobservasi pada lokus menyatakan
bahwa lokus tersebut diharapkan merupakan polymorphic yang tinggi meskipun
pada populasi yang terisolrir.10

Tabel 2.1. perkembangan sistem STR

3. Metode Pengambilan Sampel

Menurut Darrel O dkk pada tahun 2016 ada enam metode pengumpulan
sampel, antaralain :
A. Isolasi dan Pengumpulan Sampel
DNA manusia diperoleh dari apusan bukal pipi berdasarkan sebuah
protokol yang disepakati oleh MIT Committee On the Use of Human as
Experimental Subjects (COUHES). Kapas di apuskan di bagian dalam kedua pipi
dan DNA di ekstraksi menggunakan protocol Qiagen QIAamp DNA Investigator
Kit (Qiagen Cat. No 56504).5
B. Pengurutan PGM ( Personal Genome Machine ) menggunakan Ampliseq panel
87957
Apusan bukal diambil menggunakan apusan Bode. Genomik DNA
diisolasi menggunakan Qiagen Investigator Kit dielusi dalam 50 uL LowTE
(0,1 mM EDTA), kemudian dinilai dengan Quant-iT dsDNA High Sensitivity

Assay Kit dari Invitrogen. Panel utama dibuat untuk 182 amplikon dalam dua
kolam. Kemudian di perkuat menggunakan Ion Torrent Ampliseq Kit sesuai
dengan protokol pabrik serta penguatan sekuder dan terakhir dielusi dalam 25
uL, kedua bagian tersebut dibandingkan menggunakan pencernaan FuPa yang
diperpanjang (20 menit untuk setiap langkah), yang dapat meningkatkan
pembacaan melalui region homopolymer. Saampel kemudian dinilai dengan
Quant-iT ( sama seperti di atas) dan didilusi menjadi sejumlah 20pmol yang
disarankan oleh Ion Torrent, menggunakan rata-rata panjang dari 275 pasangan
dasar untuk perhitungannya. Perpustakan Amplikon kemudian digunakan dalam
400bp HiQ Ion One Touch Template PGM Reaction Kit, dilanjutkan dengan
400bp Ion Torrent HiQ PGM Sequencing Kit.5
C. Pengurutan 454 Roche
Apusan bukal diambil menggunakan swab apusan Bode atau Epicenter.
Genomik DNA diisolasi menggunakan Qiagen Investiqator Kit, dielusi dalam
50 uL air, dinilai dengan Quant-iT dsDNA High-Sensitivity Assay (Invitrogen)
dan diperkuat menggunakan AmpliTaq Gold 360 ( Menggunakan biosistem).
Setiap 25 uL reaksi mengandung : 0,8 uLTaq 360 Gold Polymerase (4 unit), 2,5
mM final MgCl2, 200 uM final setiap dNTP (800 uM total) dan 400 nM untuk
setiap primer. Kondisi siklus : 95 C selama 10 menit kemudian 95 C selama 30
detik:, 60 C selama 1 menit:, 72 C selama 1 menit 27 kali:, diikuti10 menit72
C:, 4 C. Pengurutan primer identik denganPowerPlex -16 kecuali untuk lokus
yang di tunjukan pada tabel 2.2. Produk PCR dimurnikan dengan Agencourt
Ampure XP beads. Perubahan pada standar protokol adalah: A digunakan
1,28x volume reaksi dari beads: beads dikeringkan selama 10 menit setelah

pencucian EtOH dan sampel dielusi keluar dari beads dalam 25 uL lowTE (0,2
mM EDTA, 10 mMTris-HCl, pH 8). Sampel kemudian diukur, dikoreksi akhir
dan dA-Tailed menggunakan NEB Next Quick DNA Library Prep Master Mix
Set 454 Kit dari Biolaboratorium New England, dan Roche 454 Rapid Library
Adapter di tambahkan menggunakan NEB Next Adaptor Ligation. Produk yang
diligasi di murnikan Ampure, di ukur kemudian disatukan dalam sebuah rasio
satu molekul per bead. Sisa dari pengurutan disimpulkan seperti yang
ditetapkan dalam Roche 454 Sequencing Method Manual, kecuali memiliki
nilai 1/16 dari yang direkomendasikan.5
Tabel 2.2 Primer yang digunakan dalam menyeimbangkan penguatan lokus STR

D. Pengurutan Sanger
Pengurutan Sanger menetapkan alel-alel baru yang di identifikasi dengan
pengurutan HTS. Amplikon di ligasi ke dalam vektor TOPO pCR2.1 ( nomor
katalog Invitrogen K203001) sesuai dengan petunjuk pabrik kloning individu
dimurnikan dari bakteri menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (nomor
katalog Qiagen 27106) dan diajukan kepada Tufts University Core Facility
untuk pengurutan Sanger Fluresensi.

10

Tabel 2.3. Alelalel STR yang

baru, ditemukan
dengan
pengurutan

E. Profiling STR
CE
Jumlah

DNA

manusia dalam
sampel

DNA

yang
diekstraksi
diukur

dalam

Quantifiler Duo
DNA
Quantification Kit (dengan Biosistem nomor katalog 4387746). Penguatan
menggunakan PromegaPowerplex 16 Kit di lakukan menggunakan 200-500pg
pola dalam Thermocycler Veriti, sesuai dengan petunjuk pabrik. Pemisahan dan
deteksi dilakukan menggunakan ABI 3130 dengan parameter injeksi yang
spesifik

oleh

Promega

untuk

profil

PowerPlex

16,

dan

hasilnya

dianalisismenggunakan Genemapper 3.2.5

F. Bioinformatika
Program Ruby Find_strs.rb dikembangkan untuk menggambarkan profil
STR ganda. Program ini memiliki input berupa data FASTA dari pengurutan

11

DNA, satu data teks Barcode dari sejumlah barcode yang digunakan, dan data
teks primer. Barcode dihubungkan pada kedua ujung setiap urutan untuk
menilai pengurutan pada nama Barcode tanpa adanya kesalahpasangan pada
urutan Barcode. Pengurutan primer di hubungkan pada setiap urutan tanpa
adanya kesalahpasangan. Tiap urutan di bandingkan pada sisi urutan 5 dan 3
untuk menentukan lokus STR. Alel-alel baru dinamakan berdasarkan
rekomendasi penamaan terbaru.5
4. Analisis STR Multipleks
Sistem analisis STR multipleks digunakan untuk mengidentifikasi
spesifik STR. Komunitas forensik telah memilih lokus STR untuk dimasukan
dalam reaksi penggandaan (multipleks) yang berdasarkan beberapa fitur, seperti9:
-

Alel yang berlainan dan dapat dibedakan.

Amplifikasi lokus harus tegas
Perbedaan yang jelas
Ketidakhadiran gen yang berhubungan dengan lokus yang dianalisis
Dapat diamplifikasikan sebagai bagian dari PCR multipleks.
Untuk menurunkan biaya analisis dan konsumsi sampel dan menemukan

hasil sampel yang lebih tinggi, amplifikasi STR dan deteksi tanda ganda (analisis
STR multipleks) menjadi teknik standar pada kebanyakan laboratorium DNA
forensik. STR multipleks lebih sering dilakukan menggunakan fluorescent yang
secara spektral dibedakan dengan label dan atau ukuran hasil PCR yang tidak
tumpang tindih. Amplifikasi multipleks STR pada satu atau dua reaksi PCR
dengan fluorecent yang ditandai sebagai primer dan pengukuran dengan gel atau
pemisahan elektroforesis kapiler dan deteksi fluorescence laser terinduksi menjadi
metode standar oleh laboratorium forensik untuk analisis 13 lokus CODIS STR.

12

Alel STR dari hasil PCR multipleks ini biasanya antara ukuran 100-350 bp dengan
alat komersial yang tersedia.7
Dikarenakan kendala ukuran DNA terbatas spektometri masa, GeneTrace
mengadopsi cara yang lain untuk analisis multipleks pada lokus STR ganda. Poinpoin dirancang sedemikian rupa sehingga rentang ukuran hasil PCR yang tumpang
tindih antara lokus ganda akan memiliki alel yang dapat disisipkan dan diatasi
dalam spektometer massa. Poin-poin PCR lebih dekat pada daerah STR yang
diulang daripada sistem elektoforesis yang biasanya digunakan. Akurasi, presisi,
dan resousi yang tinggi pada spektometri masa tersebut memungkinkan lokus STR
multipleksing untuk sejumlah penanda.7

13