BAB III

METODE PENELITIAN
3.1. Alat dan Bahan
3.1.1. Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat
distilasi air skala laboratorium tipe Clevenger, seperangkat Microwave MASS II
merek (Sineo Microwave Chemistry Technology Co.,Ltd 2450 Mhz) yang
dilengkapi dengan peralatan tipe Clevenger modifikasi, seperangkat instrumen
GCMS-QP2010S SHIMADZU, Spektrofotometer UV-VIS (Genesys 10S UV-VIS
v4.002 2L9N175013), Microplate reader 96 well (Berthold LB-941), neraca
analitik, pipet mikro, inkubator, kertas cakram, cawan petri, vial, Autoclave (All
American Model No. 2X), serta peralatan gelas yang biasa digunakan di
laboratorium kimia sesuai dengan prosedur.
3.1.2. Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades,
metanol, etanol absolut, natrium sulfat (Na2SO4) anhidrat, antibiotik amoxsan,
Nutrient Agar (Merck, VM264950 115), Nutrient Broth (Merck, VM086143 930),
1,1-difenil-1-fikril hidrazil (DPPH), asam askorbat, aluminium foil, dan daun
ruku-ruku (Ocimum basilicum L) yang diperoleh dari daerah Panam, Kota
Pekanbaru, Provinsi Riau.
3.1.3. Bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Gram
positif (Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus) dan bakteri Gram negatif
(Escherichia coli dan Salmonella enteritidis). Bakteri yang digunakan diperoleh
dari koleksi Laboratorium kimia organik Universitas Riau.
3.2. Prosedur Penelitian
3.2.1. Metode Clevenger-hydrodisllation
Sebanyak 100 gram daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L) yang baru
dipetik (segar) dipotong dengan ukuran 1 cm dan dimasukkan ke dalam labu
didih volume 2000 mL, kemudian ditambahkan 1000 mL akuades hingga daun

19

ruku-ruku terendam. Daun ruku-ruku didistilasi selama 5-7 jam suhu pemanas
100 C hingga diperoleh distilat campuran minyak dan air. Minyak yang telah
ditampung dalam alat Clavenger, dipindahkan ke dalam vial dan ditambahkan
Na2SO4 anhidrat untuk mengikat molekul air kemudian dipisahkan, dan disimpan
di dalam lemari es sebelum dipergunakan. Minyak atsiri daun ruku-ruku yang
diperoleh dianalisis dengan GC-MS kemudian dilakukan uji antibakteri dan uji
antioksidan. Kandungan minyak atsiri (%) daun ruku-ruku dihitung dengan
rumus :
Kandungan minyak =

Berat minyak dau n rukuruku diperoleh(gram)

Berat dau n rukuruku ( gram)

100%

3.2.2. Metode microwave-assisted hydrodistillation

Sebanyak 100 gram daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L) segar
dipotong dengan ukuran 1 cm dan dimasukkan ke dalam dalam labu didih
volume 1000 mL dan ditambahkan 500 mL aquades. Kemudian labu dimasukkan
ke dalam microwave yang telah dimodifikasi dan dilakukan didistilasi selama
90 menit pada temperatur 100 C dengan daya 500 Watt. Minyak yang diperoleh
dipindahkan ke dalam vial dan ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk mengikat
molekul air kemudian dipisahkan, dan disimpan di dalam lemari es sebelum
dipergunakan. Minyak atsiri daun ruku-ruku yang diperoleh dianalisis dengan
GC-MS kemudian dilakukan uji antibakteri dan uji antioksidan. Kandungan
minyak atsiri (%) daun ruku-ruku dihitung dengan rumus :
Kandungan minyak

Berat minyak dau n rukuruku diperoleh(gram)

Berat dau n rukuruku ( gram)

100%
3.2.3. Karakterisasi Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)
Minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L) yang diperoleh
diidentifikasi kandungan komponennya menggunakan Gas ChromatographyMass Spectrometry (GC-MS) yang dilakukan di Laboratorium Kimia Organik
FMIPA Universitas Gajah Madah (UGM), Yogyakarta.

20

3.2.4. Uji aktivitas antibakteri

3.2.4.1. Peremajaan bakteri
Peremajaan bakteri bertujuan untuk meremajakan kembali bakteri dari
agar miring ke dalam larutan Nutrien Broth (NB). Media Nutrien Broth (NB) yang
telah dibuat dimasukkan kedalam tabung reaksi masing-masing 9 mL dan
disterilisasi. Jarum ose yang disterilisasi dengan pembakaran digoreskan pada
agar miring yang berisi biakan bakteri dan selanjutnya dicelupkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth (NB). Tabung ditutup dengan kapas
kemudian dinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 24 jam. Optical
Density (OD) dari larutan Nutrien Broth (NB) yang berisi biakan bakteri diukur
menggunakan spektofotometer UV-VIS. Jika absorbansi yang diperoleh lebih dari
0,1 maka perlu dilakukan pengenceran menggunakan air salin (NaCl) 0,85 %.
3.2.4.2. Preparasi sampel dan kontrol
Sampel untuk uji antibakteri yang dipersiapkan terdiri dari minyak atsiri
daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L) dengan variasi konsentrasi (b/v) : 5
mg/mL,

10 mg/mL, 15 mg/mL yang dibuat dengan mengencerkan minyak

atsiri daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L) hasil isolasi menggunakan etanol

absolut. Kontrol positif digunakan amoxsan untuk uji antibakteri yang dibuat
dengan konsentrasi 5 mg/mL. Etanol absolut digunakan sebagai kontrol negatif.
Sebanyak 10 L sampel, kontrol positif dan kontrol negatif diteteskan pada kertas
cakram.
3.2.4.3. Penentuan aktivitas antibakteri
Sebanyak 1 mL larutan Nutrien Broth (NB) yang berisi biakan bakteri
dimasukkan ke dalam 15 mL NA (Nutrient Agar) lalu dihomogenkan (vortex)
sehingga bakteri tersuspensi merata. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam
cawan petri yang telah distrerilisasi dan dibiarkan memadat. Sebanyak 5 lembar
kertas cakram (diameter 6 mm) yang telah ditetesi sampel dan kontrol kemudian
diletakkan pada cawan petri tersebut kemudian diinkubasi di dalam inkubator

21

pada suhu 37 C. Diameter daerah bening di sekitar kertas cakram diukur setelah
inkubasi bakteri selama 24 jam.
3.2.5. Uji aktivitas antioksidan
Sebanyak 2 mg minyak atsiri daun ruku-ruku (Ocimum basilicum L)
dilarutkan dalam 2 mL metanol sehingga diperoleh larutan induk dengan
konsentrasi 1000 g/mL (ppm). Microplate terdiri dari 8 sumur baris (A-H) dan
12 kolom (1-12). Sumur baris A dimasukkan sampel sebanyak 50 L. Sebanyak
50 L metanol dimasukkan pada masing-masing sumur baris B-F. Sumur baris A
dipipet sebanyak 50 L kemudian dimasukkan ke baris B, sumur baris B dipipet
sebanyak 50 L, dimasukkan ke sumur baris C, selanjutnya hingga sumur baris F.
Sumur baris F dipipet sebanyak 50 L dan dibuang. Sehingga diperoleh
konsentrasi (1000, 500, 250, 125, 62.5 dan 31.25 g/mL). Sedangkan sumur baris
G-H diisi dengan metanol sebanyak 50 L, sumur baris A-G ditambah DPPH
sebanyak 80 L dengan konsentrasi 40g/mL. Kemudian diinkubasi selama 30
menit, selanjutnya run sampel dengan Microplate reader, dan data diolah.
Data absorbansi yang diperoleh maka dapat dihitung nilai % inhibisi
dengan menggunakan rumus :
% Inhibisi=

Akontrol - Asampel
100
Akontrol

Keterangan :
A kontrol = Absorbansi tidak mengandung sampel (Absorbansi DPPH)
A sampel = Absorbansi sampel

22