UNIVERSIDADE DO MINHO

Cintica de crescimento
de Saccharomyces
cerevisiae
Laboratrios de Bioprocessos
Catarina Lobo, 52485; Filipa Caldeira, 56442; Maura Guimares.
53823; Pedro Rocha, 53711
Data realizao da actividade: 1/04/2011 e 8/04/2011
Data de entrega do relatrio: 29/04/2011

Este estudo baseou-se na avaliao da cintica de crescimento de

Saccharomyces cerevisiae, em sistema fechado, tendo por base a construo
da curva de crescimento e a determinao dos seus parmetros cinticos.
Para tal, recorreu-se ao mtodo de espectofotometria para, a partir
das

absorvncias

registadas,

determinar

os

parmetros

cinticos.

Similarmente, os mtodos de HPLC e DNS permitiram aferir a concentrao

dos acares redutores, e consequentemente estimar a produtividade de
etanol e o rendimento em biomassa e produto.
O nosso estudo demonstrou que o clculo da taxa especifica de
crescimento mais exacto quando feito atravs da curva de crescimento
expressa em n clulas/mL (0,516h-1). O tempo de duplicao, calculado
pelas curvas de crescimento expressas em clulas/mL e [celular] (g/L),
mostra-se prximo entre si (1,34h-1 e 1,06h-1) mas longe do valor esperado
(2h-1).

ndice

INTRODUO

CRESCIMENTO MICROBIANO
TAXA ESPECIFICA DE CRESCIMENTO:
TEMPO DE DUPLICAO:
RENDIMENTO DE SUBSTRATO EM BIOMASSA:
RENDIMENTO DE SUBSTRATO EM PRODUTOS (ETANOL):
PRODUTIVIDADE EM ETANOL

4
7
7
8
8
8

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

10

CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO

DETERMINAO DA CONCENTRAO EM BIOMASSA

10
11

APRESENTAO DE RESULTADOS

12

CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR

TAXA ESPECFICA DE CRESCIMENTO EXPONENCIAL E TEMPO DE DUPLICAO DAS CLULAS
CURVA DA CONCENTRAO DE SUBSTRATO AO LONGO DO TEMPO:
RENDIMENTOS DE SUBSTRATO EM BIOMASSA E PRODUTO:
PRODUTIVIDADE EM ETANOL:

12
13
15
16
16

DISCUSSO E CONCLUSO

18

ANEXOS

21

EXEMPLOS DE CLCULOS

25

BIBLIOGRAFIA

27

Introduo
Na produo de alimentos recorre-se frequentemente ao uso de
leveduras, nomeadamente na produo de po. Contudo o potencial
destes microrganismos no se resume apenas a esta indstria. Por
exemplo, devido aos problemas energticos que a nossa sociedade
vem a enfrentar, tm-se investigado o uso de leveduras na produo
de etanol, composto este que ser utilizado como combustvel .[1]
De todas as leveduras disponveis, a mais utilizada a
Saccharomyces

cerevisiae,

uma

vez

que

fcil

manipul-la

geneticamente e o seu cultivo em laboratrio acarreta baixos custos.

Laboratorialmente

existem

vrios

aspectos

ter

em

conta

relativamente ao meio em que se ir inocular as leveduras. Os meios

de cultura so muito variados, contudo para o cultivo de leveduras o
meio YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) o mais indicado [2]

Crescimento Microbiano

importante

esclarecer

que,

em microbiologia, o

termo

crescimento relaciona-se com o crescimento populacional e no com o

crescimento celular de um s individuo. Isto acontece, porque os
microrganismos funcionam em colnias e no tanto como seres
individuais. O crescimento populacional uma consequncia de
sucessivas divises celulares dos individuos constituintes. [3]
O crescimento microbiano influenciado por diferentes factores,
como os fsicos, relacionados com a temperatura, pH, presso
osmtica, etc, ou os factores qumicos, como a concentrao de
nutrientes, de gua, oxignio, e outros constituintes [4].
4

Outro fator muito importante no crescimento microbiano est

relacionado com o meio de cultura escolhido. Este deve permitir
determinadas condies como:
- um inculo vivel,
- uma fonte de energia,
- os nutrientes necessrios populao em estudo,
- a no existncia de factores inibidores do crescimento
populacional,
- a preservao dos factores fsico-qumicos favorveis.
Quando estas condies so asseguradas, a partir de um tempo
de latncia caracterstico, a densidade populacional cresce de forma
exponencial, e com a manuteno destas, possvel observar um
crescimento equilibrado, levando a uma taxa caracterstica de
crescimento constante. [3]
No

entanto,

quando

crescimento

microbiano

providenciado num sistema fechado, esta taxa de crescimento

apresenta um comportamento similar ao representado na figura 1.

Figura
Figura1: Grfico representativo da curva de crescimento microbiano em
sistema fechado. [1]

Na figura, vsivel a diviso da curva de crescimento em 6

fases diferentes:
- fase de latncia: durante esta fase, os microrganismos
adaptam-se s novas condioes do meio, estando ainda imaturos e no
capazes de se dividir;
- fase de acelerao: depois da adaptao, o crescismento
microbiano comea a aumentar;
- fase exponencial: nesta fase, o crescimento exponencial,
e a duraao desta fase depende sobretudo da concentrao dos
nutrientes

fundamentais

colnia.

crescimento

nesta

fase

corresponde equao:
-

fase

de

desacelerao:

esta

fase,

consecutiva

exponencial, resulta da diminuio da concentrao dos nutrientes

assim como a acumulao de metabolitos residuais provenientes da
actividade celular que tm actividade inibidora de crescimento;
- fase estacionria: acontece com o esgotamento de vrios
nutrientes essenciais, existindo tanto clulas a dividir-se como clulas
em fase de morte;
- fase de declnio: ocorre quando o nmero de clulas
mortas excede o nmero de clulas em diviso. [3,4]

O controlo do crescimento microbiano importante, uma vez

que permite aferir a reaco celular quando as clulas so expostas a
diferentes condies ambientais ou diferentes meios de cultura. [3]
Por outro lado, permite a formao de colnias sustentveis de
individuos, que so utilizados em estudos a outros nveis, como a
investigao na rea alimentar ou na rea farmacutica.

Para

analisar

cintica

de

crescimento

microbiano,

principalmente na fase exponencial, existem vrios aspectos a ter em

conta:

Taxa especifica de crescimento:

influenciada pelas condies ambientais e permite prever a
evoluo do crescimento microbiano. A velocidade de crescimento
igual concentrao de clulas em cada instante: (Equaes 1 e 2)
Integrando

O parmetro representa a taxa especfica de crescimento. [5]

Tempo de duplicao:
definido como o tempo necessrio para que uma clula se
divida. [6] (Equao 3)

O objectivo de uma determinada indstria pode ser fazer variar

significativamente o ambiente em que se faz crescer as leveduras de
forma a que o metabolismo ocorra na direo desejada. Por exemplo
na formao de fermento de padeiro o objectivo ser converter
substrato em biomassa, e quando se utiliza o fermento na panificao
o objectivo passa a ser a converso de substrato nos produtos,
nomeadamente o CO2.

O clculo dos rendimentos de substrato em biomassa e produto

so tambm muito importantes na anlise do crescimento celular.

Rendimento de substrato em biomassa:

dado pela quantidade de biomassa obtida por unidade de
massa de substrato consumido. (Equao 4)

]]

Rendimento de substrato em produtos (Etanol):

dado pela quantidade de produto obtido por unidade de massa
de substrato consumido. (Equao 5)

Em ambos os rendimentos, ART refere-se aos acares redutores

totais, determinados pelo mtodo DNS, apresentado em anexo.

Produtividade em etanol:
Traduz a produo de etanol que obtida em determinado
processo batch. (Equao 6)
[

Nesta actividade laboratorial efectuou-se o clculo de todos os

parmetros cinticos explicados. Traou-se a curva de crescimento
microbiano assim como de consumo de substrato e de variao do pH.

Procedimento experimental
Curva de crescimento microbiano
Numa parte inicial, transferiu-se assepticamente a subcultura
(previamente preparada) para 180 mL de meio fresco, contendo uma
concentrao de 20 g/L de glucose. Retirou-se assepticamente uma
amostra, relativa ao tempo zero, de 3 mL de cultura e efectuou-se a
medida do pH; a leitura da absorvncia a 660 nm para determinao
da concentrao de clulas; a anlise da concentrao dos acares
redutores pelo mtodo de DNS (aps centrifugao da amostra e
filtrao do sobrenadante) e por fim, quantificau-se a glucose e etanol
usando o mtodo HPLC.
Aps retirada a amostra inicial, o meio em estudo foi colocado
numa incubadora temperatura 30C. Todo o processo de anlise das
amostras foi repetido para os diferentes tempos: 1,5h; 4,5h; 5h; 6,5h;
7,5h e 8,5h.

10

Determinao da concentrao em biomassa

Calibrao da biomassa por peso seco

Pesaram-se 5 membranas estreis.
Seguidamente, foram retiradas trs amostras de 20 mL de um meio
do tipo padro; o meio foi fornecido j preparado. Recorreu-se a um
sistema de filtrao, com o objectivo de filtrar individualmente as trs
diferentes amostras, lavando a biomassa retida no filtro com 15 mL de
gua destilada. De seguida, prepararam-se dois brancos, filtrando 20
mL de gua destilada de cada vez. Colocaram-se as membranas sobre
uma folha de alumnio, dentro de uma placa de Petri e procedeu-se
secagem numa estufa a 80C at peso constante. Por fim, pesaram-se
as membranas.

Calibrao da biomassa por contagem de clulas

Com a suspenso de clulas procedeu-se a uma leitura
preliminar no espectofotmetro para conferir a necessidade de
efectuar diluies das vrias amostras, uma vez que na construo da
curva padro os valores das densidades pticas a 620 nm variam
entre 0,2 e 0,8. Assim, aps efectuadas as respectivas diluies, leu-se
o valor de absorvncia e efectuou-se a contagem de clulas recorrendo
a uma cmara de Neubaeur.

11

Apresentao de resultados
Curva de crescimento celular
Neste ponto, so apresentados dois grficos (figuras 2 e 3)
decorrentes dos estudos do crescimento cellular. Estes dois grficos
diferem apenas nas unidades do eixo das ordenadas, sendo um
apresentado em concentrao celular (g/L) e o outro em clulas/mL.
No eixo das abcissas figura o tempo de incubao, em horas.
1.2

[celular] (g/L)

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

10

tempo (h)

Figura 2: Curva de crescimento celular, em sistema fechado, com unidades em

ordenadas em peso seco (g/L).

2.50E+07

n clulas/mL

2.00E+07
1.50E+07
1.00E+07
5.00E+06
0.00E+00
0

4
6
tempo (h)

10

Figura 3: Curva de crescimento celular, em sistema fechado, com unidades em

ordenadas em nmero de clulas por mL.

12

Taxa especfica de crescimento exponencial e tempo de duplicao das

clulas

Calculado atravs da curva n clulas/mL vs tempo:

Este clculo tem por base a equao 2 do presente relatrio.
Para se obter o parmetro X0, ajustou-se uma linha de tendncia
exponencial aos dados de crescimento celular referentes apenas fase
exponencial, uma vez que nesta fase que se avalia a cintica de
crescimento.[7] O ajuste exponencial est representado no grfico da
figura 4.

2.50E+07

n clulas /mL

2.00E+07

y = 210718e0.516x
R = 0.9745

1.50E+07
1.00E+07
5.00E+06
0.00E+00
0

10

tempo (h)
Figura 4: Representao do ajustamento fase exponencial da curva de crescimento,
assim como da sua equao caracteristica.

Em que o valor de X0 advm da equao retirada do grfico da

figura 4: 2,1*105 clulas/mL; assim como = 0,516 h-1.
De acordo com a equao 3, o tempo de duplicao de 1,34 h-1.

13

Calculado atravs da curva [celular] (g/L) vs tempo:

O procedimento similar ao atrs descrito mas tendo em conta
a curva do grfico da figura 5.
1.2

[celular] (g/L)

1
y = 0.004e0.655x
R = 0.9874

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

10

tempo (h)
Figura 5: Representao do ajustamento fase exponencial da curva de crescimento,
assim como da sua equao caracteristica.

Assim, X0 = 0,004 g/L e = 0,655 h-1, Consequentemente, o

tempo de duplicao de 1,06h-1.

14

Curva da concentrao de substrato ao longo do tempo:

A curva de consumo de substrato (glucose) foi traada tendo em
considerao os dados obtidos da concentrao de glucose, pelo
mtodo HPLC, e os dados obtidos da concentrao de acares
redutores, pelo mtodo DNS. Foram analisadas 3 amostras, mostrando
apenas a alterao da concentrao de glucose ao fim de 5; 7,5 e 8,5
horas de incubao.
20
18
[glucose] (g/L)

16
14
12
10

HPLC

DNS

6
4
2
0
0

4
6
tempo (h)

10

Figura 5: Curva de consumo de substrato ao longo do tempo de incubao: dados

obtidos pelos mtodos HPLC e DNS.

15

Rendimentos de substrato em biomassa e produto:

Os valores referentes ao rendimento de substrato em biomassa e
em produto encontram-se na tabela 1.
Tabela 1: Valores de rendimento de substrato em biomassa e em produto.

rendimento de substrato
em biomassa (gclulas/gaucares red)
em produto (getanol/gaucaresred)

0,06223
0,17611

Produtividade em etanol:
O valor da produtividade em etanol, obtido atravs da equao
6, foi de 0,336 (g/L h).
A curva de variao da concentrao de etanol ao longo do
tempo de incubao encontra-se representada na figura 6.
3

[etanol] (g/L)

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

10

tempo (h)

16

Curva de variao do pH:

A curva de variao do pH do meio de reaco ao longo do
tempo de incubao apresenta-se na figura 7.
8
7
6

pH

5
4
3
2
1
0
0

10

tempo (h)
Figura 7: Curva de variao do pH externo ao longo do tempo de incubao, em
sistema fechado.

17

Discusso e concluso
De acordo com as figuras 2 e 3 apresentadas, durante o
tempo de incubao analisado (8,5 horas) possivel distinguir
2

fases

de

exponencial

crescimento
(visveis

nas

celular:

fase

de

duas

curvas).

latncia

No

se

fase

consegue

observar a fase estacionria nem a fase de decaimento porque

o

tempo

de

incubao

analisado

nao

foi

suficiente

para

recolher dados referentes s fases mencionadas. Os valores da

taxa especfica de crescimento calculados atravs dos dados
de crescimento celular presentes nas equaes contidas nas
figuras 4 e 5 deveriam ser semelhantes, uma vez que apenas
se altera as grandezas dos dados utilizados, mas no as
condioes

de

reao.

Neste

caso,

os

valores

diferem

de

aproximadamente 0,1 h - 1 . Esta diferena pode ser facilmente

explicada pelo erro associado a cada valor, proveniente do
ajuste exponencial antecedente. Comparando com o valor 0,5
h - 1 , referido na literatura [8] conclui-se que os valores obtidos
no se encontram muito longe deste, significando que os
mtodos utilizados para recolher e analisar os dados de
crescimento celular foram apropriados e precisos. O tempo de
duplicao calculado, tambm ele pelas duas mesmas vias que
a taxa especfica de crescimento, encontra -se prximo entre si
(1,34 h -1 e 1,06 h - 1 ), demonstrando preciso, mas diferente do
valor esperado, 2 h - 1 . [literature onde fui buscar isto]

18

A curva de concentrao de substrato ao longo do tempo

evidenca um decrscimo da concentrao de glucose, o que
vai de encontro ao esperado, uma vez que a glucose est a ser
consumida pelas levedura Saccharomyces cerevisiae, para que
esta cresca. Ambas as curvas presentes na figura 5 decrescem
ao longo do tempo mas nota-se que os valores retirados da
anlise concentrao de glucose feita pelo mtodo HPLC so
ligeiramente superiores aos valores obtidos pelo mtodo DNS.
A razo desta diferena advm do facto de o mtodo de
anlise HPLC quantificar a presena de acares redutores,
contendo

estes,

glucose,

frutose

outros

componentes,

enquanto que o mtodo DNS analisa apenas a quantidade de

glucose

presente

no

meio.

Assim

sen do,

para

analisar

quantidade de substrato presente no meio ao longo do tempo

de incubao mais exato o uso do mtodo DNS.
A figura 6 mostra o aumento progressivo da concentrao de
etanol medida que as clulas crescem, chegando a um valor mximo
de produo de etanol (2,85 g/L). Comparativamente a um outro
estudo da produtividade de etanol pela levedura Saccharomyces
cerevisiae [7], este valor inferior (aproximadamente 4 g/L aps 8
horas de incubao), pelo que se considera que a produtividade obtida
seja inferior ao normal.
A curva de variao do pH ao longo do tempo de incubao
mostra que o valor de pH variou entre valores prximos de 7 e
prximos de 5. O esperado seria variar apenas entre 5 e 6 mas no se
considera que esta diferena seja significativa ou que interfira no
significado ou preciso dos restantes valores analisados.
A produtividade em etanol foi menor do que aquela esperada
segundo a bibliografia consultada [9], facto que pode ser explicado
com o relativo curto espao de tempo em que o nosso estudo
decorreu. Considerando que o valor obtido resultado de um
19

depsito dos resduos, neste caso o etanol, que mais visivel na fase
de desacelerao, fase que, como anteriormente dito, no foi
verificada na nossa curva de crescimento.
Se considerarmos a equao estequiomtrica que relaciona a
glucose com o etanol:

Temos que para 180 g de glucose devero dar origem a 50 de etanol;

numa razo de 3 simples, para 18,28 g/L de glucose teremos 5,078
g/L de etanol. Ora o nosso valor de concentrao de etanol foi de
cerca 2,85g/L. Mas para o intervalo de tempo considerado temos que
nem toda a glucose foi consumida. Como [glucose] = 12,0264 g/L
que d origem a [etanol] = 2,2463 g/L, temos que o valor realmente
esperado para a concentrao de etanol era de apenas 3,4141 g/L.
Como vsivel, este valor bem mais prximo do obtido, e a
diferena com o inicialmente esperado pode ser explicada com a
noo que o rendimento de uma reaco qumica real nunca ser de 1,
e tambm com o facto de, mais uma vez, a reaco no poder ser
considerada concluda uma vez que o consumo de glucose no foi
total.
O mesmo raciocnio pode ser tido em conta quando analisamos
o rendimento em biomassa.

20

Anexos
Nas

seguintes

calibraao

figuras

da biomassa,

apresentam-se

construidas

as

curvas

a partir dos

de

valores

obtidos na leitura de contagem de clulas e na pesagem dos

filtros, assim como da leitura da absorvncia correspondente a
cada amostra.

9.00E+06

(n clulas/mL)

8.00E+06
7.00E+06
6.00E+06
5.00E+06
4.00E+06
3.00E+06
2.00E+06
1.00E+06
0.00E+00
0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs

peso seco (g/L)

Figura 7: Curva de calibrao da biomassa por contagem de clulas

0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs
Figura 8: Curva de calibrao da biomassa pelo peso seco.

21

A tabela seguinte revela a quantidade de acares redutores nas

amostras retiradas ao longo do tempo de incubao, bem como a
absorvncia registada. A concentrao em acares redutores foi
calculada atravs da recta de calibrao apresentada de seguida. O
mtodo de anlise foi DNS.
Tabela2: Valores de absorvncia e respectiva concentrao de acares redutores das
amostras estudadas, retiradas ao longo do tempo.

amostra

t3(5h)

t5(7,5h)

t6(8,5h)

[glucose]
18,279
13,751
6,252
(g/L)
[etanol]
0,607
1,680
2,854
(g/L)
A tabela 3 contm as concentraes das 3 amostras
analisadas pelo mtodo HPLC, exprimidas em teor de glucose e
etanol. As 3 amostras analisadas foram retiradas ao fim de 5h;
7,5h e 8,5h de incubao.

Equao da recta : y = (0,27180,1937)x - (0,01080,0809)

Tabela 3: Concentraes das 3 amostras em glucose e etanol

tempo

Abs 1

Abs 2

Abs mdia

0
1
2
3
4
5
6

0,343
0,334
0,59
0,765
0,373
0,461
0,45

0,318
0,314
0,609
0,787
0,348
0,461
0,497

0,331
0,324
0,599
0,776
0,361
0,461
0,474

[acares
redutores] (g/L)
25,114
24,636
22,454
17,369
20,491
17,358
8,909

22

As figuras 9 e 10 apresentam as curvas de calibrao

usadas para calcular o teor em glucose e etanol apresentado
na tabela 3.

7000
6000

rea (mV*s)

5000
4000
3000
2000
1000
0
0.000

5.000

10.000 15.000 20.000 25.000 30.000

[etanol] (g/L)

Figura 9: Curva de calibrao do etanol

7000
6000

rea (mV*s)

5000
4000
3000
2000
1000
0
0.000

5.000
10.000
[glucose] (g/L)

15.000

Figura 10: Curva de calibrao do glucose.

23

A tabela seguinte resume as equaes de todas as rectas de calibrao

usadas nesta actividade laboratorial, bem como os erros associados.

Tabela 4: Equaes das rectas de calibrao e respectivos erros associados

curva
Etanol

equao da recta

erro no declive

erro na ordenada na origem

A=245,2*[etanol]+2,0458

12,31

143,83

glucose

A=585,73*[glucose]+263,56

74,40

351,11

Peso seco

PS=0,6797*Abs-0,0625

N clulas

nC=9E+06*Abs+519846

0,12
1,06E+06

0,064
5,69E+05

24

Exemplos de clculos
Extrapolao

dos

valores

de

concentraoo

pelas

curvas de calibrao
Todas

as

concentraes

apresentadas

ao

longo

do

relatrio foram calculadas a partir das respectivas curvas de

calibrao.
Exemplo:
Utilizando a equao da recta da curva de calibrao da
biomassa por contagem de clulas, temos:
Abs=0.056 (valor da amostra recolhida)
N Clulas (clulas/mL) = 9E+06Abs + 519846
(=)N Clulas (clulas/mL) =9E+06*0,056+519846
(=)N Clulas (clulas/mL) 1,02E+06 (clulas/mL)
Clculo do tempo de duplicao
Calculou-se o tempo de duplicao a partir da seguinte
igualdade:

Exemplo:
=0,516

(=)td=1,343

25

Clculo da produtividade de etanol

A produtividade de etanol foi obtida da seguinte forma:
Produtividadeetanol=C[etanol]etanol/tempo incubao
(=)Produtividadeetanol= 2,854/8,5= 0,336 (g/L)/h

Clculo do rendimento em biomassa

[

]]

Clculo do rendimento em produto

]
[

26

Bibliografia
[1] Yan Lin, Shuzo Tanaka, Ethanol fermentation from biomass
resources: current state and Prospects, Springer-Verlag, 2005
[2]https://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/2241/
1/U1.pdf
[3] Schuller, D.(2009), Guia de Laboratorio Laboratorios
Integrados de Biologia, Universidade do Minho, Departamento de
Biologia, Braga, pg 71
[4] Oliveira, J.R, Crescimento Microbiano, diapositivo 2
[5] http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=233
[6]http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_
content&task=view&id=92&Itemid=196
[7] Shafaghat, H, Najafpour, G.D, et al Growth Kinetics and
Ethanol Productivity of Saccharomyces cerevisiae PTCC24860 on
Various Carbon Sources, 2009.
[8]nebm.ist.utl.pt/repositorio/download/1763/8
[9]http://mundodacana.blogspot.com/2010/08/processo-paraobtencao-de-etanol-partir.html

27