a. Siapkan MH agar sesuai dengan prosedur, dengan nutrisi yang diperlukan bakteri.
b. Ketebalan media sekitar 4 mm x 0,5 mm (kira-kira 25 mL dalam plate diameter 90 mm,
31 mL dalam plate diameter 100 mm, 71 mL dalam plate diameter 150 mm, 40 mL dalam
plate persegi 100 mm).
c. Permukaan agar harus kering sebelum digunakan.
d. Plate disimpan pad suhua 8-10 C. Jika plate disimpan lebih dari 7 hari, harus disimpan
pada 4-8 C dalam kantong plastik tertutup.
e. Untuk penyimpanan, pengeringan, kondisi penyimpanan dan lama simpan plate harus
ditentukan sebagai bagian dari program jaminan mutu laboratorium.
f. Untuk plate agar MH-F1 disimpan dalam kantong plastik atau wadah tertutup, sebelum
digunakan sebaiknya dikeringkan terlebih dahulu. Hal ini untuk menghindari kelebihan
kelembaban, yang dapat mengakibatkan kesalahan munculnya zona hambat.
Persiapan inokulum
a. Gunakan metode koloni suspensi langsung, McFarland 0,5 kekeruhan standar ,kira-kira
sesuai dengan 1-2 x108 CFU / mL untuk Escherichia coli.
b. Metode koloni suspensi langsung cocok untuk semua organisme, termasuk organisme
yang rewel seperti Haemophilus spp, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae,
-haemolytic dan lainnya streptokokus.
c. Membakukan suspensi inokulum dari McFarland 0,5 standar.
d. Suspensi harus optimal digunakan dalam 15 menit.
Inokulasi plate agar
a. Secara optimal, gunakan suspensi inokulum dalam waktu persiapan 15 menit.
b. Celupkan kapas steril ke dalam suspensi dan membuang kelebihan cairan dengan
memutar swab pada bagian dalam wadah. Hal ini penting untuk membuang kelebihan
cairan dari kapas untuk menghindari over-inokulasi, terutama untuk organisme Gramnegatif.
c. Sebarkan inokulum secara merata di seluruh permukaan agar oleh swabbing dalam tiga
arah atau dengan menggunakan plat rotator otomatis.
d. letakkan disk dalam waktu 15 menit.
Penerapan disk antimikroba
a. Isi disk sesuai yang diperlukan.
b. Simpan disk tepat pada permukaan lempeng agar yang telah diinokulasi dan dikeringkan.
c. Jumlah disk di plate harus dibatasi untuk menghindari tumpang tindih zona dan
interferensi antara mikroba. Yang terpenting adalah diameter zona dapat diukur secara
tepat.
d. Kemampuan disk akan hilang ataupun diameter zona berkurang disebabkan oleh
kesalahan berikut :
Penyimpanan disk, termasuk dialat, dalam wadah tertutup dengan pengering dan
terlindung dari cahaya (beberapa agen, termasuk metronidazole, kloramfenikol
dan fluoroquinolones, yang tidak aktif oleh kontak yang terlalu lama terhadap
cahaya).
Penyimpanan disk yang pada suhu -20 C, jika hal ini tidak mungkin,
penyimpanan disk pada suhu <8 C.
Penyimpanan perlengkapan disk pada suhu <8 C.
Untuk mencegah kondensasi, memungkinkan untuk menghangatkan disk pada
suhu kamar sebelum membuka kontainer.
Buang disk yang telah kadaluwarsa.
Inkubasi plate
a. Membalikkan plate dan menginkubasi dalam 15 menit setelah aplikasi disk.
b. Susun plate di inkubator mempengaruhi hasil karena pemanasan yang tidak merata plate.
Efisiensi inkubator bervariasi dan karena itu kontrol inkubasi, termasuk nomor yang
sesuai plate di tumpukan, harus ditentukan sebagai bagian dari program jaminan mutu
laboratorium.
c. Inkubasi plate dalam kondisi ditunjukkan pada Tabel 3 (gambar 1).
d. Plate dapat diperiksa setelah inkubasi 16-20 jam, tetapi plate untuk isolate yang rentan
muncul setelah diinkubasi selama 24 jam.
Pemeriksaan plate setelah inkubasi
a. Hasil yang bagus harus menghasilkan pertumbuhan.
b. Pertumbuhan harus merata di atas plate untuk mencapai keseragaman yang melingkar
(non-bergerigi) zona inhibisi.
c. Jika koloni individu dapat dilihat, inokulum terlalu terang, tes harus diulang.
d. Periksa zona hambat berdasarkan QC yang ada.
Pengukuran zona dan interpretasi dari kerentanan
a. Zona yang terbentuk dibaca pada titik inhibisi dan dinilai oleh mata telanjang dengan
posisi plate sekitar 30 cm dari mata.
b. Baca plate dari belakang dengan cahaya yang maksimal serta di latar belakang gelap.
c. Ukur diameter zona inhibisi ke milimeter terdekat dengan penggaris, calliper atau
pembaca zona otomatis.
d. Menafsirkan diameter zona dengan mengacu breakpoint table (gambar 2).
Kontrol kualitas
a. Gunakan strain kontrol yang telah ditentukan (tabel 4) untuk memantau kinerja tes.
b. Penyimpanan pada botol kaca pada suhu -70 C di kaldu gliserol. Organisme non-kritis
dapat disimpan pada -20 C.
c. Setiap minggu subkultur dari botol digunakan untuk media non-selektif yang sesuai dan
memeriksa kemurnian.
d. Gunakan strain kontrol kualitas rutin dianjurkan untuk memantau kinerja tes. tes kontrol
harus diatur dan diperiksa setiap hari, setidaknya untuk antibiotik yang merupakan bagian
dari panel rutin.
e. Strain kontrol harus diuji setiap hari sampai kinerja terbukti memuaskan (tidak lebih dari
1 dalam 20 tes di luar batas kendali), di mana frekuensi pengujian tahap dapat dikurangi
menjadi sekali seminggu. Jika standar kinerja tidak terpenuhi, penyebabnya harus
diselidiki.
f. Selain pengujian QC rutin, menguji setiap batch baru dari Mueller-Hinton agar untuk
memastikan bahwa semua zona berada dalam jangkauan. disk aminoglikosida dapat
menunjukkan variasi kation divalent yang diterima, tigecycline dapat menunjukkan
variasi magnesium, trimethoprim-sulfamethoxazole akan muncul saat ada masalah
dengan timin, eritromisin dapat menunjukkann pH yang tidak dapat diterima.
Gambar 2. Breakpoint
QC untuk diameter zona hambat, MIC, serta konsentrasi antibiotic dalam disk pada beberapa
bakteri