UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

Departamento de Ciencias Celulares y Moleculares

PRCTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUMICA
CF-3150
Cintica enzimtica

Alumna: Rios Mendoza Jesaya lison

Docente: Teresa Barreto

OBJETIVOS:

1. Estudiar la cintica de la enzima fosfatasa alcalina: Determinacin de las constantes

Catalticas Km y Vmx de la enzima.
2. Analizar el efecto de la variacin de pH y temperatura sobre la actividad enzimtica.

INTRODUCCIN
La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y especficos: las enzimas
(1) . Las enzimas son protenas catalizadoras, es decir; sustancias que, sin consumirse
en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. La funcin de las enzimas
consiste en disminuir la energa de activacin de una reaccin con el fin de incrementar
su velocidad de reaccin (2) . Cabe resaltar que su funcin est sometido a condiciones
muy definidas de pH, temperatura, concentracin de sustrato y cofactores. El equilibrio de
una reaccin no se ve afectado por la enzima.
La concentracin de sustrato a la que la velocidad de una reaccin es la mitad de la
velocidad mxima es la constante de Michaelis, Km,(figura 1) que es caracterstica para
cada enzima que acta sobre un sustrato determinado.

Km y V max, constantes que se determinaron en la prctica de laboratorio, tienen

significados para diferentes enzimas. La ecuacin de Michaelis- Menten relaciona la
velocidad inicial con [S] y Vmax a travs de la constante Km. La cintica de MichaelisMenten se denomina tambin cintica del estado estacionario.

El mtodo para estudiar mecanismos de reacciones enzimticas, consiste en la

determinacin de la velocidad de la reaccin y del modo en que esta cambia en
respuesta a cambios en los parmetros experimentales, disciplina que se conoce como
CINTICA ENZIMTICA (1) . La cintica enzimtica se ocupa del estudio de la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variacin (3). Los ensayos
enzimticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clnicos para el
diagnstico de numerosas enfermedades. Un ensayo enzimtico se basa en la actuacin
de la enzima sobre una sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversin en otra
especfica, conocida como producto. Normalmente algn elemento de los que intervienen
en la reaccin absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la reaccin
puede seguirse por espectrofotometra (4).
La enzima FOSFATASA ALCALINA, utilizada en la prctica, es una enzima que cataliza la
hidrlisis del enlace ster fosfrico entre un grupo orgnico y un grupo fosforilo a pH
alcalino, lo que libera fosfato al medio(5). Est presente en rin, hgado, intestino y
hueso. La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el suero indica la
existencia de enfermedades seas degenerativas o bien daos hepticos. Esta enzima,
tambin se utiliza como control de la adecuada pasteurizacin de la leche y crema, dado
que la fosfatasa alcalina se inactiva por calentamiento (3).
En la prctica, para determinar los niveles de la fosfatasa alcalina se utiliz un compuesto
artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al poseer un resto orgnico con un grupo fosfato unido,
puede ser reconocido por la enzima. El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el
p-Nitrofenol, compuesto coloreado que en solucin alcalina absorbe a una longitud de
onda de 405 nm, por lo que su aparicin en el transcurso de la reaccin (figura 2) se
sigui fotomtricamente. Finalmente para detener la reaccin se utiliz NAOH 3N (ul), ya
que el exceso del producto de la reaccin inhibe la actividad enzimtica.

Figura 2 : Reaccin enzimtica

PROCEDIMIENTO:
MATERIALES Y MTODOS:

8 Tubos de ensayo (10ml)

Rejilla de tubos de ensayo
1 pipeta (0-20 L)
1 pipeta (0-100 L)
1 pipeta de (100-1000 L)
HCL 0.5 M
MgCl2 5 mM
p- NFF (1mg/mL)
Fosfatasa alcalina((200L) )
Incubador
Espectrofotmetro
PROCEDIMIENTOS
a) MEDIDA DE LOS PARMETROS CINTICOS

Para medir las propiedades cinticas de la fosfatasa alcalina empleamos

diversas concentraciones de sustrato.
Rotulamos 8 tubos de ensayo y colocamos los reactivos de acuerdo a la tabla
siguiente :

Se agreg la enzima fosfatasa alcalina (200L) en intervalos de 30 segundos

entre uno y otro tubo
Posteriormente se incub las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente
(37C)
Para detener la reaccin se utiliz 200L de NaOH 3N, lo cual fue a aadido en
intervalos de 30 segundos entre uno y otro tubo.
Se incub las muestras nuevamente por 5 minutos a temperatura ambiente.
Despus de los 5 minutos de incubacin, se procedi a leer la absorbancia de los
tubos en el espectrofotmetro versus el blanco 405 nm
Finalmente se anot los resultados para posteriormente realizar las grficas.

b) EFECTO DE LA VARIACIN DE TEMPERATURA

Para medir el efecto de la variacin de temperatura de la fosfatasa alcalina se
emple diversas concentraciones de sustrato.
Rotulamos 8 tubos de ensayo y colocamos los reactivos de acuerdo a la tabla
siguiente :

Para detener la reaccin se agreg la enzima fosfatasa alcalina (5L) en

intervalos de 30 segundos entre uno y otro tubo
Posteriormente se incub las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente
(37C)
Para detener la reaccin se utiliz 200L de NaOH 3N, lo cual fue aaadido en
intervalos de 30 segundos entre uno y otro tubo.
Se incub las muestras nuevamente por 5 minutos a temperatura ambiente.
Despus de los 5 minutos de incubacin, se procedi a leer la absorbancia de los
tubos en el espectrofotmetro versus el blanco 405 nm
Finalmente se anot los resultados para posteriormente realizar las grficas.
c) EFECTO DE LA VARIACIN DEL pH

Para medir el efecto de la variacin del pH de la fosfatasa alcalina se emple

diversas concentraciones de sustrato.

Rotulamos 8 tubos de ensayo y colocamos los reactivos de acuerdo a la tabla
siguiente :

Para detener la reaccin se agreg la enzima fosfatasa alcalina (5L) en

intervalos de 30 segundos entre uno y otro tubo.
Posteriormente se incub las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente
(37C)
Para detener la reaccin se utiliz 200L de NaOH 3N, lo cual fue aadido en
intervalos de 30 segundos entre uno y otro tubo.
Se incub las muestras nuevamente por 5 minutos a temperatura ambiente.
Despus de los 5 minutos de incubacin, se procedi a leer la absorbancia de los
tubos en el espectrofotmetro versus el blanco 405 nm
Finalmente se anot los resultados para posteriormente realizar las grficas.

RESULTADOS:

A: MEDIDA DE LOS PARMETROS CINTICOS

Vol (l)

Variacin A
405 nm

[S] (mM)

Vo
(mol/min)

1/[S]

1/Vo

10

0.044

0.00017246

1.4841x10-6

5798.4375

673772.727

-6

25

0.13

0.00107788

4.3851x10

927.75

228046.154

50

0.15

0.00431151

5.0597x10-6

231.9375

197640

0.00979989

-6

103.083333

140502.37

-5

57.984374

85189.6552

-5

1.7068x10

14.4960938

58588.9328

-5

3.62402344

40225.2374

75

0.211

100
200
400

0.348

0.01724603

0.506

0.0689841

0.737

0.27593641

7.1173x10

1.1739x10
2.486x10

1. Graficar en papel milimetrado segn los resultados obtenidos:

GRFICA [1]:

Grafica 1: Efecto de la concentracin de sustrato sobre la

velocidad: La grfica muestra que al aumentar la [S] la reaccin llega
ms rpido a un estado estacionario en el que la velocidad a la que se
forma el complejo enzima-sustratos (fosfatasa alcalina- p
nitrofenilfosfato) se equilibra con la velocidad a la que se descompone.

Se observa que al aumentar la concentracin de sustrato aumenta la

actividad de la enzima a concentracin fija en el estado estacionario;
este aumento se produce siguiendo una curva hiperblica que tiende a
su mxima velocidad, en el cual prcticamente toda la enzima ha
formado complejo con su sustrato.

GRFICA [2]
1800
1600
1400
1200
1000
1/Vo 800
600
400
200
0

f(x) = 33.52x + 78.4

R = 0.98

1/V
Linear (1/V)
Linear (1/V)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

1/[S]

Grfica 2: Relacin inversa de la concentracin de sustrato sobre

la inversa de la velocidad inicial: El eje Y representa la inversa de la
concetracin de sustrato y el eje x la inversa de la velocidad. La grfica
2 es el doble recproco de la Grafica 1, la cual da una lnea recta. Esta
lnea tiene una pendiente igual a Km/Vmax, la interseccin sobre el eje
1/Vo es 1/Vmax; la interseccin sobre el eje 1/[S] es igual a -1/Km. La
grfica 2 de los dobles recprocos es muy til para analizar la inhibicin
enzimtica.

PREGUNTAS:
- Velocidad vs. Concentracin de Sustrato (v vs [S]) Cmo se denomina
esta grfica? Qu tipo de curva es?

HOJA DE DATOS Y HOJA MILIMETRADA ADJUNTA

La grfica 1 se denomina cintica de Michaelis Menten, ya que la enzima
muestra una dependencia hiperblica de Vo frente a [S].
La curva es una hiprbola rectangular con una asntota en Vmax.

- Determine el Km y Vmx de la fosfatasa alcalina mediante el grfico de

Lineweaver- Burke (1/v vs 1/[S]).

HOJA DE CLCULOS Y HOJA MILIMETRADA ADJUNTA

CUESTIONARIO
a) Cmo se interpreta y qu importancia tiene el valor Km?
El km se interpreta como la constante mi Michaelis. Esta constante puede variar
de una enzima a otra, cabe resaltar que puede ser para diferentes sustratos de
la misma enzima (1) .

El valor Km es importante porque representa la afinidad de la enzima por el

sustrato. Adems, es importante no slo porque es un parmetro, sino tambin
por motivos que, en ocasiones, pueden ser de vital importancia. Por ejemplo,
algunos tipos de leucemia (enfermedad en la que los glbulos blancos prolifera
anormalmente) pueden evitarse por la administracin de una enzima, la
Asparraginasa, que cataliza la reaccin de hidrlisis de la asparagina (Asn) a
cido asprtico (Asp).
Asn + H2O <======> Asp + NH+4
Este descubrimiento condujo a la conclusin de que la Asn presente en la sangre
es un principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el
problema apareci cuando se utilizaron distintas fuentes de asparaginasa,
descubrindose que no todas eran eficientes. Al final se encontr la razn. Estas
enzimas, de diferentes fuentes (animal, vegetal o microbiana), tenan diferente
Km respecto a la Asn. Como la [Asn] en la sangre es muy baja, slo aquellas
enzimas con el valor de Km muy bajo (una mayor afinidad por el sustrato) seran
capaces de provocar la hidrlisis de la Asn. As, se comprob al obtener los
parmetros que la enzima que presentaba menor Km para la Asn era la de una
bacteria (E. coli), y fue la que se utiliz para controlar la enfermedad (6).
b) Qu utilidad tiene la determinacin de los parmetros cinticos de las enzimas?
La utilidad de los parmetros cinticos es para comparar actividades enzimticas,
c) Explique la importancia fisiolgica de la fosfatasa alcalina en los diferentes tejidos
La fosfatasa alcalina es un indicador de enfermedades. Entonces tiene una
importancia fisiolgica significativa en los diferentes tejidos ya que altos niveles
en la sangre indica enfermedades en los huesos, hgado, en el sistema biliar o
enfermedades serias. Niveles bajos son sntomas de un desorden gentico
conocido como la hipofosfatasia, enfermedad hereditaria caracterizada por una
deficiencia de fosfatasa alcalina (7), que resulta en deformidad de los huesos, e
incluso lleva a la muerte si no es tratada (8) .

La fosfatasa alcalina juega un papel importante en la calcificacin de los

cartlagos y de los huesos. Se cree tambin que participa en la reabsorcin de
los huesos removiendo una capa de fosfato que est presente en la superficie de
estos. La fosfatasa tiene su rol en la sntesis de protenas dentro de las clulas.
Tambin lo es en la sntesis del ADN ya que es capaz de hidrolizar tanto al ADN
como al ARN (4) .
B. EFECTO DE LA VARIACIN DE TEMPERATURA
Temperatura C
4
20
37
91

Absorbancia (nm)
0.0938
0.779
2.503
0.995

Velocidad
0.01876
0.1558
0.5006
0.199

GRFICA [3]:
0.6
0.5
0.4

Velocidad 0.3
0.2
0.1
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Temperatura C

Grfica 3: Efecto

de la variacin de pH sobre la actividad

enzimtica
El eje y representa la temperatura en grados centgrados y el eje x la
velocidad medida en microlitros por minuto, se observa que adopta una
forma relativamente igual a una campana, donde el punto mx es a los 37
C con una absorbancia de 2.503. Cabe resaltar que al incrementar la
temperatura la absorcin disminuye considerablemente, tanto que a los 91
C llega a una absorbancia de 0.995 segn nuestros datos.
a) A qu temperatura tiene mayor actividad la enzima? Explique por qu
La enzima tiene mayor actividad enzimtica a la temperatura de 37 C, porque a esta
temperatura la enzima llega a un punto mximo, es decir la actividad cataltica llega a
la temperatura ptima .

C. EFECTO DE A VARIACIN DE pH
a) Grafique en un papel milimetrado Actividad Enzimtica vs. pH
pH
6
7
8
9

Absorbancia (nm)
0.187
0.167
0.227
0.655

Velocidad
0.0374
0.0334
0.0454
0.131

[FIGURA 4] :

0.14
0.12
0.1
0.08

Velocidad

0.06
0.04
0.02
0
5.5

6.5

7.5

8.5

9.5

pH

Grafica 4: Efecto de la variacin de pH sobre la

velocidad del sustrato: El eje y representa el pH y el eje X la
velocidad medida en microlitros por minuto. La grfica muestra que a
medida que se aumenta el pH la absorbancia incrementa. El punto
mnimo se obtuvo a pH 7 con una absorbancia de 0.167 nm. Mientras

que el punto mximo se obtuvo en pH 9 con una absorbancia de

0.655 nm, es decir este es el pH ptimo.

DISCUSIN:

Los resultados obtenidos, se fijan a los objetivos planteados en el desarrollo de la

prctica.
El p-nitrofenilfosfato (sustrato) adquiere color amarillo a pH alcalino por lo que se
cuantifica espectrofotomtricamente a 405 nm (9).
La grfica 1 (Velocidad Vs [S]) tiene una forma de hiprbola, sin embargo hay dos
puntos que salen de la grfica (0.053;0.0018) y (0.162;0.0029) esto pudo deberse a
muchos factores externos como; mal pipeteo o no haber controlado bien el tiempo.
Cabe resaltar que las enzimas que se ajustan a este modelo (HIPERBOLA
RECTANGULAR) se conocen con el nombre de enzimas michaelianas (10).
A bajas concentraciones de sustrato la velocidad inicial es proporcional a dicha
concentracin. Cuando la concentracin de sustrato es muy elevada, la velocidad de
reaccin se aproxima a un lmite superior conocido como velocidad mxima (Vm). El
parmetro Km se denomina constante de Michaelis-Menten y es la concentracin de
sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad mxima.(grfica 1)
La grfica 2 (Lieweaver-Burke) tiene la forma de una recta, representando la grfica
de los dobles recprocos. Segn Davin L. Nelson y Michael M. Cox esta grfica tiene
la gran ventaja de permitir una determinacin mucho ms precisa de la velocidad
mxima, la cual solo puede ser obtenida aproximadamente a partir de una grfica
simple de Vo Vs. [S] (grfica 1) (1).
La grfica de los dobles recprocos de las velocidades de reaccin enzimticas es
muy til para distinguir entre ciertos tipos de mecanismos de reaccin enzimticas y
tambin para analizar la inhibicin enzimtica (11) .
La velocidad de la reaccin (grfica 3) se incrementar al aumentar la temperatura
dentro de un determinado rango, alcanzando un valor mximo a 37C la denominada
temperatura ptima. A valores superiores la actividad disminuye debido a que la
enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de desnaturalizacin y, por lo
tanto, de inactivacin (8) .
La relacin entre la actividad y temperatura viene determinada por la ecuacin de
Arrhenius (2)
La intensidad mxima (grfica 5) de la actividad de la enzima es a pH 9 llegando a
una velocidad de 0.131 microlitros por minuto. Estos datos son coherentes ya que la
enzima fosfatasa alcalina acta en un medio cido entre (pH 8.6 a 9.1) (4) . Segn
los estudios cinticos, los diferentes valores de pH nos proporciona informacin
sobre el mecanismo cataltico de la enzima y la naturaleza de los aminocidos ms
directamente implicados en el proceso cataltico(12) .

CONCLUSINES:
La fosfatasa alcalina tiene una cintica de Michaelis Menten, hiprbola
rectangular. Las constante cataltica Km de la enzima segn nuestro resultados
fue de 0.43 M y la Vmax 0.013 mM/S-1 .

El pH tiene un efecto significativo sobre la actividad enzimtica, ya que, cuando el

pH es ms alto la velocidad de la enzima es mayor y llega a un punto ptimo en el
cual la fosfatasa alcalina acta de manera favorable.

En cuanto a la temperatura, esta tambin tiene gran significancia en la actividad

enzimtica, la temperatura ptima de la fosfatasa alcalina, en el laboratorio, fue de
37 C, mientras que a 91 C disminuyo su actividad, esto debido a su
desnaturalizacin.

FUENTES BIBLIOGRFICAS:
1.
Nelson, David. Cox M. Nelson (2013) Lehninger - Principios de Bioquimica 6ta
edicin. 2013. p. 75188.
2.

Pedroza R. Enzimas. 2014;1124.

3.

Brcena Ruiz JA, Garca Alfonso C, Padilla Pea CA, Martnez Galisteo E, Dez
Dapena J. Caracterizacin cintica de la fosfatasa alcalina. 2013;113.

4.

Cli C, La CA. Fosfatasas Alcalina. 2012;2:418.

5.

Rodrguez JS, Surez ES, Basts RG, Muoz PP, Viets C. Por qu aumentan
las fosfatasas alcalinas? 2016;29(4):2415.

6.

Pavlovsky S. Leucemia. Coleccin Temas Maest. 2010;1(2):30.

7.

Caballero Mora FJ, Martos Moreno G, Garca Esparza E, Argente J.

Hipofosfatasia infantil. An Pediatr. 2012;76(6):3689.

8.

Pablo Falcn. Funcin e Importancia de Lipasa, Fosfatasa y Amilasa. 2012;128.

9.

Christensen HN. CINTICA ENZIMATICA. 1980. 149 p.

10.

Wendy L. Montanchez. EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD DE LA CATALASA | Wendy Montanchez - 2014;

11.

Enzimologa. Inhibidores reversibles. 2002;2:114.

12.

Sergio HO. Efecto del pH en la actividad enzimtica. 2015;1:187.