APLIKASI BIOINFORMATIKA PADA PRODUKSI ALGINAT

Pendahuluan (dari jurnal 2)

Pada jurnal Insight into the Binding of The Wild Type and Mutated Alginate
Lyase (AlyVI) with Its Substrate: A Computational and Experimental Study, dibahas
tentang aplikasi ilmu bioinformatika dalam mempelajari dan mendesain model baru
untuk pembuatan alginate lyase. Alginate lyase adalah enzim yang berfungsi untuk
memecah ikatan antar alginate. Bioinformatika sebagai disiplin ilmu yang berkaitan
dengan studi secara komputasional akan memiliki peran sebagai modeler atau
predictor untuk pembuatan sebuah protein baru.
Alginate lyase digunakan dalam produksi protoplas alga, dan juga untuk
mempelajai struktur alginate dengan tujuan memproduksi produk-produk alginate
dengan fungsi tertentu. Sekuens dari alginate lyase telah memudahkan dalam
menganalisis fungsi-fungsi struktur dari alginate lyase tersebut. Alginat lyase dapat
memisahkan eksopolisakarida (EPS) dari permukaan Pseudomonas yang berlendir.
Alginat sendiri memiliki peran cukup penting dalam menstabilisasi biofilm
yang terbentuk oleh Pseudomonas aeruginosa dan beberapa spesies pseudomonas
lainnya. Semakin tinggi massa molekul dan muatan negative dari bakteri alginate,
maka semakin viskos pula mereka.
Banyak

bakteria-bakteria

laut

seperti

Pseudoalteromonas

elyakovii,

sphingomonas sp., Klebsiella pneumonia, vibrio sp., dan pseudomonas sp. yang
dilaporkan telah memproduksi alginate lyase dalam jumlah yang sangat besar. Dan
juga sudah banyak gen-gen bakteri yang memproduksi alginate lyase tersebut yang
diklon dan sekuensnya diketahui. Sehingga, perkembangan mutan-mutan alginate
lyase ini akan menguntungkan industry makanan, farmasi, dan medis.
Contoh yang akan dibahas kali ini adalah amplifikasi dari gen alyVI yang
diperoleh dari bakteri Vibrio sp. menggunakan plasmid pGEX-4T-1 untuk
mutagenesis. Ikatan alginate dengan mutan dari alyVI juga dipelajari secara
komputasional dan menggunakan ilmu bioinformatika. Studi ini bertujuan untuk

meningkatkan efisiensi katalitik dari alyVI terhadap alginate dengan meetode sitedirected mutagenesis berdasarkan model komputasional (bioinformatika).
Prosedur Percobaan

1. Material
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah, Glutatione (GSH),
GSH-separose 4B, sodium dodecyl sulfat (SDS), alginate, dan dithiothreitol (DTT)
yang didapatkan dari Sigma. Kemudian pfu DNA polymerase yang didapatkan dari
stratagene, dpnI endonuclease yang didapat dari New England Biolabs, protein AHRP yang didapat dari Transduction Laboratories, Membran polyvinylidene xuoride
yang didapat dari Milipore, vector pGEX-2T yang didapat dari pharmacia, dan primer
oligonukleotida.
2. Proses Mutagenesis
Semua proses mutagenesis dari alginate lyase dilakukan dengan metode
QuikChange site-directed mutagenesis. Terdapat 9 (Sembilan pasang) primer yang
dibutuhkan untuk melakukan Polymerase Chain Reaction (PCR). Kesembilan primer
tersebut digunakan untuk memutagenesis sekuens berikut: Thr-136 ke Ser-136, Asn18 ke Ser-138, His-200 ke Ala-200, Asn-217 ke Ala-217, Asn-217 ke Asp-217, Pro219 ke Gly-219, Tyr-306 ke Phe-306, Tyr-312 ke Ala-312, dan Tyr-312 ke Phe-312.
3. Pengekspresian dan purifikasi dari AlyVI dan mutan-mutannya
Ada beberapa tahapan dalam melakukan pengekspresian dan purifikasi dari
alginate, yaitu pertama, sel tersebut dikembangbiakkan dalam medium 500 ml yang
mengandung ampicillin pada suhu 37C dengan pengadukan, hingga nilai OD 600
mencapai nilai 0,6. Kemudian isopropyl thiogalaktosida (IPTG) ditambahkan pada
konsentrasi fina; 1 mM. Sel kemudian dipanen dengan sentrifugasi 5000 g selama 15
menit. Cell pellet kemudian diresuspensi dalam larutan buffer yang mengandung
EDTA.

Setelah diresuspensi, sel akan hancur dikarenakan sonikasi. Kemudian lisat

dari sel akan dihilangkan dengan sentrifugasi 10.000 g selama 20 menit. Ekstraknya
lalu akan ditambahkan secara perlahan ke dalam kolom GSH-Separose-4B. Setelah
proses pencucian dilakukan di dalam kolom, alyVI lalu dipisahkan dari kolom GSHsepharose-4B tadi dengan cara diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit di dalam
larutan buffer khusus elusi. Konsentras dari enzim yang dipurifikasi dapat ditentukan
dengan metode SDS/PAGE.
4. Pengujian AlyVI
Segala pengujian karakterisasi secara biokimia dilakukan dengan cara
meresuspensi enzim yang sudah terpurifikasi di dalam larutan buffer. Aliquot dari
larutan enzim sebanyak 0.2 ml kemudian ditambahkan ke dalam larutan substrat.
Larutan substrat tersebut mengandung sodium alginate yang sudah diinkubasi
sebelumnya. Reaksi enzimatik ini kemudian dihentikan dengan memanaskan
campuran tersebut di dalam air mendidih selama 5 menit. Aktivitas enzim lyase
diukur secara kuantitatif menggunakan metode asam thiobarbiturat. Satu unit
aktivitas enzim ini didefinisikan sebagai peningkatan absorbance sebanyak 549
nm/menit.
5. Modelling AlyVI
Dalam memodelkan AlyVI, terdapat beberapa tahapan tersendiri. Tahapan-tahapan
tersebut ialah:

Konstruksi model 3D dari protein AlyVI

Sekuens asam amino dari bakteri Vibrio sp. QY101 didapatkan dari database pada
GenBank. Kemudian sekuens ini kemudian dimasukkan ke dalam program
BLAST untuk kemudian dicari manakah alginate lyase lainnya yang memiliki
sekuens sama. Setelah itu didapat bahwa Sphingomonas sp. yang paling
mendekati, sehingga struktur kristalnya dijadikan template untuk membuat model
protein AlyVI. Akan tetapi, meskipun paling mendekati, jumlah sekuens yang
mirip dari keduanya masih rendah, sehingga perlu dilakukan alignment berulang
kali menggunakan homology module oleh software Accelrys, Inc.

Setelah dilakukan alignment, model 3D AlyVI dibuat dengan menggunakan

metode homology modelling, dan homology modelling dilakukan dengan

menggunakan SWISS-MODEL.
Validasi dari Model
Model homologi umumnya mengandung kesalahan dalam struktur inisialnya.
Jumlah kesalahan dari metode yang diberikan bergantung pada tingkat kesamaan
sekuens antara template dengan targetnya. Bagian terpenting dari homology
modeling adalah memverifikasi atau memvalidasi model yang ada. Beberapa
tahapan diperlukan untuk memperkirakan kesalahan yang ada dalam model tiga
dimensinya. Kualitas stereokimia dan parameter energetic dievaluasi untuk
menentukan apakah panjang ikatan dan sudutnya berada pada range yang normal.
Hal tersebut dievaluasi menggunakan Whatcheck, Prosall, Anolea, dan Verify3D
(SWISS MODEL server). Sementara kualitas dari model final dapat ditentukan

dari nilai B-score yang bisa dilihat pada server SWISS MODEL.
Perbaikan Model
Model alyVI inisial dilarutkan di dalam air dan ditujukan untuk meminimalisasi
energy untuk memperkecil jumlah interaksi sterik dan untuk mengoptimisasi
stereokimianya. Model tiga dimensi yang sudah diperbaiki dan diperbaharui
dievaluasi lebih lanjut secara berkala. Hal-hal yang dievaluasi antara lain kualitas

stereokimianya, residunya, dan kontak-kontak atomic yang terjadi di dalamnya.

Molecular Docking
Penentuan keadaan terionisasi dari molekul-molekul kecil dibawah kondisi
fisiologis dapat diprediksi menggunakan PKATYPER (Openeye Inc.) atau pKa
predictor (Schrodinger). Dalam kasus ini, semua keadaan ionisasi dari molekul
GGG sudah diketahui. Setiap bagian yang terionisasi disimpan (dock) dan
kompleks yang paling stabil dan energy ikatannya paling rendah disimpan.
Geometri molekul dari ligan polisakarida linear terbentuk atas 3 (tiga) -LGuluronat. -L-Guluronat ini diotimisasi lewat perhitungan dengan program
Gaussian03. Geometri molekul yang telah dioptimisasi ini digunakan untuk
menghitung potensial elektrostatik dari permukaan molekul.

Sementara untuk proses docking dari ligan alginate (-L-Guluronat), dilakukan

dengan menggunakan cara otomatis yaitu dengan software InsightII package
(Accelrys, Inc.).
Polisakarida ini kemudian diekstraksi dan disalin ke dalam sisi aktif dari struktur
model homology alyVI. Ligan diposisikan di dalam sisi aktif alyVI untuk
menciptakan interaksi yang tepat antara ligan dengan rantai samping residu. Hal
ini akan menghailkan struktur awal yang memungkinkan untuk studi modeling.
The Affinity/InsightII digunakan untuk meminimalisasi energy dari struktur awal.
Di akhir, tempat ikatan didefinisikan sebagai sebuah kubah yang terpusat pada
posisi inisial ligan dengan jari-jari sekitar 1x10-9 m dan mengitari situs aktif dari
protein alyVI.
Pergerakan ligan kemudian akan berubah secara translasi, rotasi, dan torsi dan
dilakukan secara acak. Pergerakan acak ini merepresentasikan perubaan orientasi
dan konformasi ligan terhadap alyVI. Prosedur ini memiliki keuntungan yaitu
untuk

menanggulangi

penahan-penahan

energy

pada

permukaan

yang

mengandung energy potensial.

Analisis Gugus
Setelah docking dilakukan, tahapan berikutnya adalah mengidentifikasi gugusgugus pada pendistribusian ligan. Identifikasi ini dilakukan dengan metode Root
Means Squared Deviation (RMSD). Setiap docking memiliki gugus yang
mengandung RMSD sebesar 8x10-11. Setelah kriteria pertama didapat, berikutnya
adalah pengujian untuk interaksi yag berbeda-beda yang mungkin terbentuk di
antara protein.