MICROBIOLOGIA
1 EDIO
ABDI
AGNCIA BRASILEIRA
DE DESENVOLVIMENTO
INDUSTRIAL
ABIHPEC
ASSOCIAO BRASILEIRA DA
INDSTRIA DE HIGIENE PESSOAL,
PERFUMARIA E COSMTICOS
SEBRAE
SERVIO BRASILEIRO DE APOIO S
MICRO E PEQUENAS EMPRESAS
GUIA DE
MICROBIOLOGIA
1 EDIO
2015
3
APRESENTAO
O Programa de Desenvolvimento Setorial de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmeticos (PDS/HPPC),
coordenado pela Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos
(ABIHPEC), em parceria com a Agncia Brasileira de Desenvolvimento Industrial (ABDI) e o Servio
Brasileiro de Apoio s Micro e Pequenas Empresas (SEBRAE), apresenta o Guia de Microbiologia, nova
publicao do PDS/HPPC. O Guia faz parte de uma srie temtica, que visa disponibilizar para as indstrias
de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos (HPPC) um valioso suporte tcnico, estruturado sob a forma
de fascculos ou livretos, sobre temas pontuais referentes s etapas, procedimentos, controles e/ou aes
pertinentes ao processo produtivo.
O gerenciamento da qualidade microbiolgica uma etapa primordial para assegurar a qualidade do
produto final, assim como o controle de qualidade microbiolgica possui funo de extrema importncia,
na garantia da segurana e da qualidade dos produtos de HPPC.
A partir deste pensamento, a ABIHPEC coordena o Comit Brasileiro de Higiene Pessoal, Perfumaria e
Cosmticos ABNT/CB 57 e representa o Brasil em reunies internacionais do ISO/TC 217 Cosmetics no
grupo da ISO - International Organization for Standardization, que discute os trabalhos relacionados a
este tema por meio de sua Comisso de Estudo de Microbiologia, grupo aberto a participao de toda
a sociedade brasileira, em atendimento as regras da Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT).
Este fascculo uma recomendao e disponibiliza um condensado de prticas e metodologias
especficas para o setor de HPPC quanto ao controle microbiolgico aplicvel a estes produtos, bem
como no que se refere ao ambiente produtivo, sistemas instalados, equipamentos, matrias-primas e
insumos utilizados, em especial para as micro e pequenas empresas.
Os critrios adotados e as prticas descritas neste guia, refletem as normas e os regulamentos tcnicos
vigentes, estabelecidos para o setor no mbito de seu controle microbiolgico observado o rigor
pertinente matria.
Nosso agradecimento ao grupo de profissionais de notrio saber, participantes da elaborao e reviso
desta ferramenta, cuja aplicabilidade e observao ao contedo por parte dos produtores e importadores
refletir em produtos disponveis no mercado com a conformidade requerida para uso seguro de seus
consumidores.
A contribuio dos tcnicos que atuam no setor foi fundamental para que o trabalho tivesse os critrios
necessrios e refletisse a responsabilidade e atitude do setor de HPPC.
O Guia no pretende esgotar o assunto e temos a expectativa que novas publicaes seguiro no futuro.
COORDENAO TCNICA
Renata Amaral ABIHPEC
Juliana Souza ABIHPEC
APOIO GERENCIAL E COORDENAO DO PROJETO PDS
Eliene da Conceio - ABIHPEC
ELABORAO DO MANUAL
Artur Joo Gradim - AVISA
Marina Anjos - AVISA
GRUPO DE TRABALHO
Andrea Carotta - HYPERMARCAS
Carolina Cacais - AVISA
Danielle Cunha - JOHNSON & JOHNSON
Dbora Rodriguez - NATURA
Karla Constncio - LACQUA DI FIORI
Maria A. Marcondi - HYPERMARCAS
Silvia Yuko Eguchi - GRUPO INVESTIGA
Thamires Rodrigues - AVISA
Vera Lcia Siqueira - SANQUIMIUS
COLABORADORES
Flvia Montibeller OXITENO
Juliana Shiki MARY KAY
Karina Silva AMWAY
PARCEIROS NO PDS-HPPC
ABDI / ABIHPEC / SEBRAE
LISTA DE SIGLAS
ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas
ANVISA - Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria
AW. - Atividade da gua ou water activity
ATCC - American Type Culture Collection
CADRI - Certificado de Movimentao de Resduos de Interesse Ambiental
CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
FMEA - Anlise de modo e efeito de falha ou Failure Mode and Effects Analysis
INMETRO - Instituto Nacional de Metrilogia, Qualidade e Tecnologia
ISO - International Organization for Standardization
HPPC - Higiene Pessoal Perfumaria e Cosmticos
INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade
NBRC - NITE Biological Research Center
NCTC - National Colletion of Type Cultures
OGMs - Organismos geneticamente modificados
REBLAS - Rede Brasileira de Laboratrios Analticos em Sude
SDA - Sabouraud dextrose agar
TSA - Tryptic soy agar
UFC - Unidade formadoras de colnia ou colony forming unit
USP - Farmacopia Americana ou United State Pharmacopeia
SUMRIO
APRESENTAO.........................................................................................5
1
INTRODUO...........................................................................................12
MICROBIOLOGIA......................................................................................13
2.1
FORMULAO......................................................................................................................................................... 13
2.1.1
2.2
BIOSSEGURANA EM LABORATRIOS.................................................................................................13
3.2
PRODUTOS E SUSCEPTIBILIDADE..........................................................................................................18
3.3
3.2.1
AW - Atividade da gua..............................................................................................................................18
3.2.2
pH..................................................................................................................................................................18
3.2.3
Teor Alcolico...............................................................................................................................................19
MATRIAS-PRIMAS.................................................................................................................................19
3.3.1
gua..............................................................................................................................................................19
3.3.1.1
Parmetros Microbiolgicos.........................................................................................................20
3.3.1.2
gua potvel..................................................................................................................................20
3.3.1.3
Portaria MS n 2914/11..................................................................................................................21
3.3.1.4
Processos de Purificao...............................................................................................................21
3.3.1.5
Validao.......................................................................................................................................24
3.3.1.6
3.3.2
3.3.3
3.4
MATRIAS-PRIMAS DE AO CONSERVANTE......................................................................................25
3.5
EMBALAGEM..........................................................................................................................................34
GESTO DA QUALIDADE.........................................................................35
4.1
4.2
4.3
4.4
GARANTIA DA QUALIDADE...................................................................................................................38
4.4.1
Ensaio de Proficincia..................................................................................................................................38
4.4.2
4.4.3
Incerteza de Medio..................................................................................................................................39
4.4.4
Auditorias Internas.......................................................................................................................................39
4.4.5
Controle de Registros..................................................................................................................................40
4.4.6
Relatrio de Ensaio......................................................................................................................................41
LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA.......................................................42
5.1
Pessoal...........................................................................................................................................................42
5.1.2
Instalaes Prediais......................................................................................................................................42
5.1.3
5.2
5.1.2.2
Materiais e Tipos...........................................................................................................................43
5.1.2.3
Armazenagem...............................................................................................................................44
5.1.2.4
Equipamentos...............................................................................................................................................44
5.1.3.1
Tipos...............................................................................................................................................44
5.1.3.2
Qualificao/Calibrao/Aferio................................................................................................45
5.1.3.3
CEPAS.....................................................................................................................................................46
5.2.1
5.1.2.1
Identificao de Microrganismos................................................................................................................46
5.2.1.1
Colorao de Gram.......................................................................................................................46
5.2.1.2
Colorao de Wirtz-conklin..........................................................................................................47
5.2.1.3
Kits de Identificao......................................................................................................................47
5.2.2
Manuteno de cepas..................................................................................................................................47
5.2.3
Controle de gerao....................................................................................................................................52
5.2.4
Validade........................................................................................................................................................53
6.1.2
6.1.1.2
pH...................................................................................................................................................57
6.1.1.3
Tipos de esterilizao...................................................................................................................57
6.1.1.4
Validade.........................................................................................................................................57
6.1.1.5
6.1.1.6
Armazenagem...............................................................................................................................59
Assepsia.........................................................................................................................................60
6.2
Pesagem........................................................................................................................................60
6.1.2.3
MTODOS MICROBIOLGICOS...............................................................62
7.1
PLAQUEAMENTO...................................................................................................................................62
7.2
7.3
7.4
7.5
7.2.1
7.2.2
Leituras / clculos.........................................................................................................................................63
7.3.2
Pseudomonas aeruginosa...........................................................................................................................65
7.3.3
Staphylococcus aureus.................................................................................................................................66
7.3.4
Nvel de Inculo............................................................................................................................................69
7.4.2
7.4.3
7.4.4
7.4.5
7.4.6
7.4.7
Perodos de teste.........................................................................................................................................74
7.4.8
7.4.9
Leituras / Clculos........................................................................................................................................75
7.5.2
7.5.3
Leitura............................................................................................................................................................77
7.5.4
Critrio de aceitao....................................................................................................................................77
7.6
7.7
ATIVIDADE ANTISSPTICA.....................................................................................................................78
7.7.1
7.7.2
7.7.3
10
6.1.2.2
7.7.2.1
7.7.2.2
Eficcia da Neutralizao..............................................................................................................80
7.7.4
Anlise de Resultados..................................................................................................................................82
8.2
8.1.1
8.1.2
Frequncia de testes....................................................................................................................................84
8.1.3
AMOSTRAGEM (TCNICA/TIPO)............................................................................................................85
8.2.1
8.2.2
8.2.3
Pessoal (swab/rodac)....................................................................................................................................87
8.2.4
8.2.5
LIMPEZA E SANITIZAO........................................................................90
9.1
9.2
9.3
10
9.2.2
10.2
DESCONTAMINAO............................................................................................................................99
10.3
10.4
11
CONSIDERAES FINAIS.......................................................................101
12
GLOSSRIO............................................................................................102
13
BIBLIOGRAFIA.........................................................................................104
11
1 INTRODUO
Esta publicao destina-se aos profissionais que trabalham com produtos de higiene pessoal, perfumaria
e cosmticos nas reas de fabricao, qualidade e reas indiretamente relacionadas estas. Ainda que
a unidade no conte com instalaes laboratoriais para anlises microbiolgicas, a compreenso do
contedo deste guia servir como suporte para que contratao de servio de terceiros seja mais criteriosa,
tanto no momento de escolha das anlises requeridas e dos prestadores de servio, como tambm no
planejamento de amostragem e interpretao dos resultados analticos obtidos.
Tcnicos analistas em geral, formuladores de produtos e demais profissionais de pesquisa e
desenvolvimento, operadores de fbrica como tambm compradores, pessoal de Marketing e no apenas
os profissionais microbiologistas compem o pblico-alvo deste trabalho.
Podero ainda encontrar suporte tcnico para o seu dia-a-dia, professores, alunos e interessados em
ingressar na atraente rea de HPPC.
Conforme a legislao brasileira vigente e harmonizada no Mercosul, exigida a apresentao dos dados
de Anlises Microbiolgicas, no ato da regularizao do produto. E nas inspees, exigida a apresentao
dos dados de controle de qualidade dos lotes, dos mtodos de ensaio e dos registros das anlises.
Este Guia tem por objetivo apresentar aos profissionais e ao segmento da rea de Microbiologia uma
abordagem sobre os procedimentos, parmetros e anlises microbiolgicas em produtos acabados e
matrias-primas para HPPC.
12
2 MICROBIOLOGIA
2.1
FORMULAO
2.1.1
Assegurar a qualidade microbiolgica dos produtos um desafio que deve se iniciar na fase de pesquisa e
desenvolvimento. Os qumicos formuladores geralmente do pouca importncia para o fato de que certas
frmulas so mais facilmente preservadas da contaminao por microrganismos do que outras. Observar
os aspectos fsico-qumicos destas frmulas e identificar os fatores que as tornam menos susceptveis
sobrevivncia e ao crescimento de fungos e bactrias pode determinar uma nova tcnica de formular o
sistema conservante do produto; pode transformar o jeito de se criar frmulas.
Relegar para o final do trabalho a escolha dos conservantes, tratando-os como simples coadjuvantes um
mtodo que no condiz com as tendncias de minimizao do uso de conservantes. A criao de produtos
autoconservantes atende demanda de um segmento crescente de consumidores que preferem usar
produtos cada vez mais seguros, exime o projeto de complicaes regulatrias, alm de reduzir custos.
Simplesmente retirar os conservantes da frmula no a soluo.
Algumas das tendncias da nova formulao de produtos so: o ajuste da atividade de gua e do pH;
a utilizao de agentes antioxidantes, tensoativos e quelantes; a aplicao de determinadas fragrncias
e de extratos naturais e outros mecanismos para fazer uso de propriedades antimicrobianas ou de
componentes de frmula que so multifuncionais e no so regulamentados como conservantes. A opo
por embalagens no-contaminantes do tipo dose nica ou dispensers tambm uma ttica para minimizar
ou zerar o uso de conservantes (Kabara; Orth, 1997).
preciso enfatizar que a fabricao de produtos autoconservantes possvel em operaes que adotam
boas prticas de fabricao e que contam com instalaes e equipamentos favorveis ao controle
microbiolgico.
Assim, o futuro da qualidade microbiolgica de produtos de HPPC desafiante no apenas para
microbiologistas e gestores da qualidade, mas primeiramente para os formuladores e demais profissionais
que atuam em tecnologias de inovao.
2.2
BIOSSEGURANA EM LABORATRIOS
13
tecnolgico e prestao de servios que podem comprometer a sade de seres humanos, animais,
ambientes e/ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.
Partindo-se do princpio de que a preveno de acidentes responsabilidade de todos, e considerandose a natureza dos servios efetuados em laboratrios de microbiologia, os profissionais devem se informar
e estar aptos a cumprir as normas estabelecidas. Portanto, os treinamentos e reciclagens devem ser
programados para assegurar que todos os profissionais participem. Se ocorrerem acidentes, estes devem
ser comunicados e devidamente monitorados.
Cada laboratrio deve dispor de um manual de biossegurana que identifique os riscos e especifique as
prticas e os procedimentos que minimizem ou eliminem estes riscos. Deve dispor dos equipamentos de
proteo individual e de proteo coletiva necessria s operaes.
Os materiais contaminados por agentes biolgicos devem ser tratados e dispostos corretamente. Estes
podem ser: bactrias, fungos, alm das amostras biolgicas, no frequentemente encontradas em
laboratrios de produtos de HPPC.
Conforme o grau de patogenicidade, os agentes biolgicos so entendidos segundo a classificao de
risco a seguir (BRASIL, 2006):
Classe de risco 1: baixo risco para o indivduo e para a coletividade, com baixa probabilidade de
causar doena ao ser humano.
Classe de risco 2: risco individual moderado para o indivduo e com baixa probabilidade de
disseminao para a coletividade. Podem causar doenas ao ser humano, entretanto, existem
meios eficazes de profilaxia e/ou tratamento.
Classe de risco 3: risco elevado para o indivduo e com probabilidade moderada de disseminao
para a coletividade. Podem causar doenas e infeces graves ao ser humano, entretanto nem
sempre existem meios eficazes de profilaxia e/ou tratamento.
Classe de risco 4: risco elevado para o indivduo e com probabilidade elevada de disseminao
para a coletividade. Apresenta grande poder de transmissibilidade de um indivduo a outro.
Podem causar doenas graves ao ser humano, ainda no existem meios eficazes para a sua
profilaxia ou seu tratamento.
14
termos: resduos de servios de sade e os rejeitos, estes como sendo os resduos slidos que, depois de
esgotadas todas as possibilidades de tratamento e recuperao por processos tecnolgicos disponveis e
economicamente viveis, no apresentem outra possibilidade que no a disposio final ambientalmente
adequada.
As Boas Prticas de Laboratrio, que devem estar descritas num manual, podem ser resumidas conforme
segue.
1.
2.
Observar os princpios bsicos de higiene, entre eles: manter as mos limpas e unhas aparadas;
sempre lavar as mos antes e aps procedimentos (manuseio de materiais biolgicos viveis; uso
das luvas; antes de sair do laboratrio; antes e aps a ingesto dos alimentos e bebidas, etc.). Se
no existirem pias no local, deve-se dispor de lquidos anti-spticos para limpeza das mos;
3.
Proibir: a ingesto e/ou o preparo de alimentos e bebidas, fumar, mascar chicletes, manipular
lentes de contato, utilizao de cosmticos e perfumes, armazenamento de alimentos para
consumo nas reas de manipulao de agentes biolgicos e qumicos. Em todos os laboratrios
deve haver uma rea designada como refeitrio;
4.
Pipetar com a boca expressamente proibido e jamais se deve colocar na boca objetos de uso
no laboratrio (canetas, lpis, borrachas, pipetas, entre outros);
5.
6.
7. Trajar roupas de proteo durante as atividades laboratoriais, tais como: jalecos, aventais,
macaces, entre outros. Essas vestimentas no devem ser usadas em outros ambientes fora do
laboratrio, como: escritrio, biblioteca, salas de estar e refeitrios;
8.
9.
Manter os artigos de uso pessoal fora das reas designadas s atividades laboratoriais;
10. Organizar os procedimentos operacionais padres (POP) para o manuseio dos equipamentos e
tcnicas empregadas nos laboratrios;
11. Garantir que a limpeza dos laboratrios (bancadas, pisos, equipamentos, instrumentos e
demais superfcies) seja realizada regularmente antes e imediatamente aps o trmino das
atividades laboratoriais. Em caso de derramamentos, dependendo do tipo e quantidade de
material biolgico disseminado, pode-se empregar para a descontaminao do local lcool 70%
ou soluo de hipoclorito de sdio, preferencialmente, 10%, deixando agir por 30 minutos e
removendo com papel absorvente em seguida;
12. Assegurar que os resduos biolgicos sejam descontaminados antes de serem descartados;
13. Manusear, transportar e armazenar materiais (biolgicos, qumicos e vidrarias) de forma segura
15
para evitar qualquer tipo de acidente. O manuseio de produtos qumicos volteis, metais,
cidos e bases fortes, entre outros, necessita ser realizado em capela de segurana qumica.
As substncias inflamveis precisam ser manipuladas com extremo cuidado, evitando-se
proximidade de equipamentos e fontes geradoras de calor;
14. Usar os EPIs adequados durante o manuseio de produtos qumicos;
15. Identificar adequadamente todos os produtos qumicos e frascos com solues e reagentes, os
quais devem conter a indicao do produto, condies de armazenamento, prazo de validade,
toxidade do produto e outros;
16. Acondicionar os resduos biolgicos e qumicos em recipientes adequados, em condies
seguras e encaminh-los ao servio de descartes de resduos dos laboratrios para receberem o
seu destino final;
17. Aplicar/fixar a sinalizao adequada nos laboratrios, incluindo o smbolo internacional de "Risco
Biolgico" na entrada dos laboratrios;
18. Instituir um programa de controle de roedores e vetores;
19. Evitar que tcnicos trabalhem sozinhos e jornadas de trabalho prolongadas;
20. Providenciar treinamento e superviso aos profissionais iniciantes;
21. Disponibilizar kits de primeiros socorros e promover a capacitao dos usurios em segurana e
emergncia.
16
Os produtos de HPPC sujeitos ao controle microbiolgico foram divididos em 02 subgrupos (Tipo I e Tipo
II), de acordo com a faixa etria e local de aplicao, conforme tabela a seguir:
Tabela 01: Parmetros de controle microbiolgico para produtos de HPPC (RDC n 481, 23 de setembro de 1999 da ANVISA)
rea de Aplicao
e Faixa Etria
Limites de
Aceitabilidade
a) Contagem de microrganismos mesfilos
aerbicos totais, no mais que 10 UFC/g
ou mL.
Produtos para
uso infantil
Produtos para
TIPO I
entram em contato
com mucosas
TIPO II
produtos
susceptiveis
contaminao
microbiolgica
17
3.2
PRODUTOS E SUSCEPTIBILIDADE
Uma srie de caractersticas do produto precisam ser avaliadas quando se realiza uma anlise de risco
microbiolgico, para determinar se esse produto deve ser submetido s normas internacionais publicadas
para produtos de HPPC ou outros mtodos relevantes. Estas caractersticas incluem a composio do
produto, as condies de produo, embalagem e uma combinao destes fatores.
Determinadas caractersticas fsico-qumicas contribuem para a no proliferao de microrganismos
indesejveis ao produto cosmtico. Fatores subletais iro aumentar a hostilidade do ambiente e a fase de
latncia. Se o ambiente suficientemente hostil, a fase lag (fase de adaptao metablica) vai estenderse ao infinito e, portanto, causar a morte celular. A combinao de vrios fatores letais ir causar a morte
celular mais rpida. Os seguintes fatores devem ser considerados para determinar se os produtos de
HPPC apresentar um ambiente hostil dos microrganismos.
aw =
p
p0
n2
n1 + n2
Onde:
3.2.2 pH
Determinados tipos de produtos, com valores de pH extremos (maior que 10 e abaixo de 3) no exigem testes
microbiolgicos, tanto teste de desafio (Challenge test) como teste do produto final. Em todos os outros
valores de pH (3,0 pH 10,0) uma combinao de pH e outros fatores fsico-qumicos tem de ser avaliada
para determinar o risco potencial. Dados para apoiar a concluso de que o risco microbiolgico baixo precisa
ser gerado, seja atravs de desing experimental ou histrico do produto.
18
3.3 MATRIAS-PRIMAS
As matrias-primas usadas em produtos de HPPC normalmente so incuas para a sade, com raras
excees, logo suas quantidades devero ser estritamente controladas. O uso industrial de substncias
qumicas est sujeito a normas de rgos reguladores, no Brasil os produtos de HPPC precisam ser
registrados na ANVISA, Nos Estados Unidos o controlador o FDA (Food and Drug Administration), rgo
governamental cujas normas so frequentemente adotadas por outros pases. Essas normas so baseadas
em estudos de cada substncia com respeito a sua toxicidade para o homem, animais e meio ambiente, a
curto e longo prazo, determinando quais so as substncias incuas e definindo limites para sua utilizao
na produo de produtos de HPPC.
As matrias-primas so classificadas como excipientes ou princpios ativos. Excipiente todo aquele
ingrediente inerte adicionado a uma formulao que lhe confere consistncia para que a formulao possa
ser aplicada, manipulada e embalada apropriadamente. Os excipientes so essenciais na produo de
produtos HPPC porque proporcionam diferentes veculos de aplicao, com distintos tamanhos, volumes
e caractersticas. Existem mais de 8.000 excipientes aprovados pelo FDA para uso em produtos HPPC.
Os princpios ativos so substncias que efetivamente atuam e promovem modificaes sobre a regio
em que o cosmtico ser aplicado e cuja as quantidades preciso ser controladas em virtude dos limites
aceitveis de aplicao, da sua toxicidade, das consequncias de dose excessivas, de possveis efeitos
colaterais e da possibilidade de sensibilizao e reaes alrgicas.
Pigmentos, solues, corantes orgnicos e fragrncias so grupos especiais de matrias-primas, pois
apesar de serem inertes e no modificarem muito o local de aplicao, sua quantidade necessita ser muito
bem controlada.
3.3.1 gua
A gua a matria-prima de maior volume na fabricao de um produto de HPPC. Ela utilizada no
processo de fabricao como veculo ou como matria-prima, alm disso, a gua utilizada na limpeza e
sanitizao de equipamentos e instalaes.
19
20
porm para o uso na indstria de produtos de HPPC, gua com caractersticas especficas deve ser empregada
em alguns processos.
Microrganismos
Parmetros
Contagem Heterotrficas
At 500 UFC/mL
Coliformes Totais
Ausncia em 100 mL
Escherichia coli
Ausncia em 100 mL
Preveno de vazamento: nenhum dos materiais que entram em contato com a gua pode
apresentar vazamentos;
Acabamento interno liso: devem ser utilizadas superfcies internas lisas que ajudem a evitar
21
Desenho de flanges ou juntas: quando so utilizados flanges ou juntas, eles devem ser
projetados para atender a critrios higinicos sanitrios. Devem ser realizadas verificaes
para garantir que os lacres corretos sejam usados e que estejam encaixados e ajustados
corretamente;
Parmetro
Critrio de Qualidade
pH
5~7
Condutividade
Contagem bacteriolgica
<100 UFC/100mL
COT
<500 ppb
Para obteno de gua com esse padro de qualidade os seguintes tratamentos so possveis, partindose da gua potvel disponvel:
22
Sistemas de destilao;
Osmose reversa
Outro processo de produo de gua purificada utilizada a tecnologia de osmose reversa. Nesse processo
a gua potvel aps tratamento prvio passa sob presso tangencialmente por um conjunto de elementos
de membranas semipermeveis, que permite que a gua permeie atravs da membrana deixando na
corrente original os ons e outras impurezas indesejveis.
O desempenho de osmose reversa depende dos seguintes fatores (SCHNEIDER; TSUTIYA, 2001).
23
eficincia do ponto de vista de separao de sais, porm diminuindo a sua vazo de produo.
As membranas atualmente utilizadas podem ser acondicionadas em sistemas modulares que podem ser
multiplicados conforme necessidade.
A gua potvel que alimenta o sistema de osmose reversa necessita ser pr tratada para que esteja livre
de impurezas e de cloro que podem danificar ou reduzir a vida til das membranas. O sistema de pr
tratamento bem como o prprio conjunto de mdulos de membranas necessitam de um bom controle de
limpeza e tambm de sanitizao peridica (SCHNEIDER; TSUTIYA, 2001).
Destilao
O terceiro processo para purificao de gua, a destilao, o mais empregado na indstria cosmtica para
obteno de gua estril em pequenas quantidades. Como meio de obteno de grandes quantidades
de gua purificada a destilao apresenta custo elevado, em decorrncia da energia envolvida. Alm da
energia consumida para o sistema de evaporao necessrio igualmente um sistema de refrigerao para
condensar o vapor para fase lquida. Tudo isso faz com que seja um sistema no utilizado nas operaes
industriais, porm pode ser utilizado em laboratrios de microbiologia.
3.3.1.5 Validao
A evidncia documentada requerida no processo de validao resulta na gerao de uma srie de
documentos que espelha o grau de confiabilidade do sistema. O documento bsico inicial o protocolo
de validao. Nele se inclui a definio clara do processo a validar, os objetivos da validao, o pessoal
responsvel, os procedimentos e mtodos empregados, as anlises fsico-qumicas e microbiolgicas a
serem realizadas, a periodicidade, a indicao dos pontos de amostras e os critrios de aceitao. Outros
documentos so requeridos no processo de validao, visando comprovar a qualificao de pessoal
envolvido: os materiais empregados, a aferio e calibrao de instrumentos, procedimentos operacionais
e registro das operaes, todos relacionados e condensados num relatrio final.
24
evitar o uso de gua de melhor qualidade para aplicaes onde esta no necessria.
importante, ento o conhecimento dos processos e equipamentos para que uma avaliao criteriosa
e aes de caa aos desperdcios possam ser conduzidas com sucesso. Muitas vezes necessria
a busca de novas tecnologias que possibilitem a substituio de equipamentos por outros de melhor
desempenho em termos de consumo de gua ou mesmo a instalao de dispositivos para reduo do
consumo (MIERZWA; HESPANHOL, 2005).
A utilizao de processos de produo e de sistemas de lavagem com baixo consumo de gua deve ser
estimulada desde a fase de projeto. Como por exemplo, gua de determinados processos como lavagem
de filtros e de decantadores pode ser recuperada e reutilizada em outros processos, desde que atendam
aos parmetros de qualidade para estes.
As aes devem tambm ter foco no pessoal operacional, na medida em que melhor capacitao leva execuo
de tarefas com regularidade e dentro de padres pr-estabelecidos para as mesmas. Assim, treinamentos e
campanhas de conscientizao contra o desperdcio devem ser realizados regularmente (MIERZWA,2005).
3.4
MATRIAS-PRIMAS DE AO CONSERVANTE
So substncias que so adicionadas como ingrediente aos produtos de HPPC com a finalidade de inibir
o crescimento de microrganismos durante sua fabricao e estocagem, ou para proteger os produtos da
25
N
ORD
Substncia
Mxima
Concentrao
Autorizada
a) 2,5% (cido)
Produtos que se
enxguem, exceto
os produtos para
higiene bucal
b) 1,7% (cido)
Produtos de
higiene bucal
c) 0,5% (cido)
Produtos que no
se enxguem
26
0,5% (expresso
como cido)
2,0% (expresso
como cido)
Limitaes
Proibido em sistema
pulverizveis (como
aerossis e sprays) quando a
concentrao for maior que
0,5%.
Condies de Uso
e Advertncias
N
ORD
Substncia
Mxima
Concentrao
Autorizada
0,5% (expresso
como cido
Sorbato de
Trietanolamina (*)
Bifenil -2-ol (o-fenilfenol)
e seus sais
7
(O-PHENYLPHENOL &
salts)
Piritionato de zinco (*)
8
Sulfitos e Bisulfitos
inorgnicos (*)
9
(AMMONIUM SULFITE &
BISULFITE, etc.)
10
Condies de Uso
e Advertncias
0,6% (expresso
como cido)
0,6% (expresso
como cido)
0,2% (expresso
como fenol)
a) 1,0% produtos
capilares
Limitaes
b) 0,5% outros
produtos
Somente em produtos
enxaguveis.
Proibido em produtos de
higiene bucal.
0,2% (expresso
como SO livre)
0,5%
Proibido em sistemas
pulverizveis (como aerossis
e sprays).
Contm clorobutanol.
(CHLOROBUTANOL)
cido 4- hidroxibenzico,
seus sais e steres
11
(4- HIDROXYBENZOIC
ACID, salts & esters:
METHYLPARABEN,
PROPILPARABEN, etc)
cido dehidroactico e
seus sais
12
(DEHYDROACETIC ACID
& salts)
cido frmico e seu sal
sdico
13
(FORMIC ACID & sodim
salt)
a) 0,4% (expresso
como cido
individual)
b) 0,8% (expresso
como cido) para
misturas de sais e
steres
0,6% (expresso
como cido)
Proibido em sistemas
pulverizveis (como aerossis
e sprays).
0,5% (expresso
como cido)
0,1%
(dibromohexamidina)
(DIBROMOHEXAMIDINE
& salts)
27
N
ORD
15
Substncia
Tiosalicilato de
etilmercurio sdico
(THIMEROSAL)
(PHENYLMERCURIC &
salts)
PHENYL MERCURIC
BORATE (*)
17
Mxima
Concentrao
Autorizada
Limitaes
Condies de Uso
e Advertncias
Contm timerosal.
Contm compostos
fenilmercuriais.
0,2 % (expresso
como cido)
0,1%
19
5- Bromo-5-nitro-1,3
dioxano (5-BROMO-5NITRO-1,3-DIOXANE)
0,1%
20
2-Bromo-2-nitropropano1,3-diol (Bronopol)
(2-BROMO-2NITROPROPANE-1,3DIOL)
0,1%
Evitar formao de
nitrosaminas.
21
3,4,4- Triclorocarbanilida
(*)
0,2%
(TRICHLOROCARBAN)
p-cloro-metacresol (*)
22
0,2%
(p-CHLORO-m-CRESOL)
p-cloro-metaxilenol
23
0,5%
(CHLOROXYLENOL)
Imidazolidinil ureia
24
0,6%
(IMIDAZOLIDINYL UREA)
25
Cloridrato de
polihexametileno
biguanida
(POLYAMINOPROPYL
BIGUANIDE)
28
Critrio de pureza:
3,3,4,4-Tetracloroazobenzeno menor que
1ppm
0,3%
Proibido em produtos
destinados a entrar em
contato com mucosas.
N
ORD
Substncia
Mxima
Concentrao
Autorizada
Limitaes
Condies de Uso
e Advertncias
2-fenoxietanol
26
1,0%
(PHENOXYETHANOL)
27
6- Clorotimol
0,1%
28
0,2%
29
1-(4-clorofenoxi)-1-(1imidazolil)-3,3-dimetil-2butanona
Proibido em produtos
infantis.
(QUATERNIUM 15)
0,5%
(CLIMBAZOLE)
30
1,3-Dimetilol-5,5dimetilhidantona
0,6%
(DMDM HYDANTOIN)
31
2-Feniletanol
0,5%
1,0%
(BENZYL ALCOHOL)
33
34
35
4-Isopropil-m-cresol
(O-CYMEN-5-OL)
Mistura de 5-cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-ona
e 2-metil-4-isotiazolina-3-ona com cloreto de
magnsio e nitrato de
magnsio (3:1)
(METHYLISOTHIAZOLINONE + METHYL CHLORO ISOTIAZOLINONE)
a) 1,0% para
produtos que se
enxagum
b) 0,5% para
produtos que no
se enxagum
0,1%
0,0015% (de
uma mistura na
proporo 3:1
de 5-cloro-2methyl-isothiazol3(2H)-one e 2methylisothiazol3(2H)-one)
36
2-Benzil-4-Clorofenol
(CHLOROPHENE)
0,2%
37
2-Cloroacetamida
(CHLOROACETAMIDE)
0,3%
Bis-(clorofenildiquanida)1,6-hexano: acetato,
gluconato e cloridrato
38
(CHLORHEXIDINE
DIACETATE, DIGLUCONATE DIHYDROCHLORIDE)
Contm cloroacetamida.
0,3% (expresso
como
clorohexidina)
29
N
ORD
Substncia
Mxima
Concentrao
Autorizada
Limitaes
1,0%
0,1%
pH do produto acabado no
deve ser menor do que 6.
Condies de Uso
e Advertncias
1-Fenoxi-2-propanol (*)
39
(PHENOXYISOPROPANOL)
4,4-Dimetil-1,3oxazolidina
40
(DIMETHYL
OXAZOLIDINE)
41
N-(hidroximetil)-N(dihidroximetil-1,3-dioxo2,5-imidazolidinil-4)N(hidroximetil)
0,5%
urea
(DIAZOLIDINYL UREA)
Glutaraldedo
42
0,1%
Proibido em sistemas
pulverizveis (como aerossis
e sprays).
0,3%
(GLUTARAL)
5-Etil-3,7-dioxo-1azobiciclo(3.3.0)octano
43
(7-ETHYLBICYCLO
OXAZOLIDINE)
44
6,6-dibromo-4,4-dicloro2,2-metilenodifenol
0,1%
(BROMOCHLOROPHENE)
lcool
2,4-Diclorobenzlico
45
0,15%
(DICHLOROBENZYL
ALCOHOL)
46
Tricloro-2,4,4hidrxi2difenileter (*)
0,3%
(TRICLOSAN)
Hexametilenotetramina
47
0,15%
(METHENAMINE)
48
49
Brometo e Cloreto
de Alquil (C12-C22)
Trimetilamnio (*)
1,6-Di-(4-amidinofenoxi)n-hexano e seus sais
(incluindo isotionato e
p-hidroxibenzoato)
0,1%
0,1%
50
3-(p-clorofenoxi)-propano1,2-diol
CHLORPHENESIN)
30
0,3%
Contm glutaraldedo
(somente para concentraes
superiores a 0,05% no
produto acabado).
N
ORD
Substncia
Mxima
Concentrao
Autorizada
Limitaes
Condies de Uso
e Advertncias
52
(SODIUM
HYDROXYMETHYL
GLYCINATE)
Cloreto de prata
depositado em dixido
de titnio
0,5%
0,004%
(calculado como
cloreto de prata)
(SILVER CHLORIDE)
Cloreto, Brometo e
Sacarinato de Aquil
(C8-C18)
53
dimetilbenzilamnio (*)
(BENZALKONIUM
BROMIDE, CHLORIDE,
SACCHARINATE)
54
Benzilhemiformal
(BENZYLHEMIFORMAL)
0,1%
(calculado como
cloreto de
benzalcnio)
0,15%
a) 0,02% Produtos
que se enxguem
3-Iodo-2propinilbutilcarbamato
55
b) 0,01% Produtos
que no se
enxguem, exceto
em desodorantes/
antitranspirantes
c) 0,0075%
desodorantes/
antitranspirantes
a) No utilizar em produtos
destinados a crianas com
idade inferior a 3 anos,
com exceo dos produtos
de banho/shower gis e
shampoos.
b) No utilizar em loes
e cremes corporais que
se apliquem em grandes
extenses corporais;
- No utilizar em produtos
para crianas com idade
inferior a 3 anos.
c) No utilizar em loes
e cremes corporais que
se apliquem em grandes
extenses corporais;
56
Cloreto de Diisobutil
Fenoxietoxietil-dimetilbenzilamnio
0,1%
(BENZETHONIUM
CHLORIDE)
31
N
ORD
Mxima
Concentrao
Autorizada
Substncia
Condies de Uso
e Advertncias
Limitaes
2-metil-4-isotiazolina-3ona
57
0,01%
(METHYLISOTHIAZOLINONE)
Nota: Os conservantes com smbolo (*) tambm podem ser usados para outros fins especficos devendo ser respeitadas as
condies e os limites de concentraes estabelecidos em outras listas quando houver.
Agente conservante
Bactria Gram
positiva
Bactria Gram
negativa
Leveduras
Bolores
+++
++
cido srbico
++
++
+++
++
lcool benzlico
+++
Bronopol
++
+++
Cetrimida
+++
++*
++
Cresol
++
Cloreto benzalcnio
+++
++*
++
Clorexidina
+++
+++*
++
Clorobutanol
+++
+++
++
Clorocresol
+++
++
Etanol
+++
+++
++
++
Fenol
++
Fenoxietanol
++
+++
Parabenos
++
+*
++
++
Legenda: +++ ativo; ++ moderadamente ativo; + fracamente ativo * pouco ativo contra Pseudomonas sp
Fonte: Guide to microbiological in pharmaceuticals.
32
Caractersticas / Exemplos
0 UFC/ g
No permitem crescimento.
pHs extremos, apresentam atividade microbicida.
Frequncia de
amostragem e
anlise
Sem necessidade
de teste
Uma vez
ao ano
A cada lote
A cada dia
de uso
33
Caractersticas / Exemplos
A ------------- Hostis
B ------------ Inertes
C ----------- De Suporte
D ---------- Preservados
Caractersticas / Exemplos
3 -------------- Hostis
No permitem o crescimento.
Ex: lcoois, glicerina, propilenoglicol e ceras.
2 -------------- Susceptveis
3.5 EMBALAGEM
O processo de fabricao das embalagens trabalha com altas temperaturas, principalmente os plsticos,
com os sistemas de sopro e injeo.
A preocupao, no entanto, vem na sequncia da fabricao, isto , no processo de gravao,
decorao, pintura, montagem, acondicionamento - principalmente nas embalagens que o produto a ser
acondicionado for rico em nutrientes.
Diferente dos produtos acabados, nos quais existem normas e parmetros definidos pela ANVISA para
microbiologia, as embalagens ainda no os tm. Porm, o fato de no ter no significa que as indstrias
de produtos de HPPC no devam fazer anlises microbiolgicas nas embalagens.
34
4 GESTO DA QUALIDADE
O Laboratrio de Microbiologia terceirista deve possuir habilitao em vigilncia local de acordo com
a RDC N 11 de 16 de Fevereiro de 2012- Dispe sobre o funcionamento de laboratrios analticos que
realizam anlises em produtos sujeitos Vigilncia Sanitria e d outras providncias.
O Laboratrio de Microbiologia pode possuir Acreditao pelo INMETRO de acordo com ABNT NBR ISO/
IEC 17025:2005- Requisitos gerais para competncia de laboratrios de ensaio e calibrao e Habilitao
REBLAS. A Habilitao estabelecida pela RDC n 12, de 16 de fevereiro de 2012- Dispe sobre a Rede
Brasileira de Laboratrios Analticos em Sade (REBLAS).
Para um sistema de gesto da qualidade em laboratrio de microbiologia, deve-se incluir alm de uma
lista de itens especficos o bom julgamento e uma constante ateno aos detalhes.
Para o controle de qualidade deve-se estabelecer o padro mnimo e delinear as diversas etapas que
devem ser seguidas para o controle dirio e vigilncia de todas etapas do sistema.
As diretrizes para o sistema de gesto da qualidade devem constar em um manual, no qual estejam
detalhadas prticas tais como procedimentos para monitorar o funcionamento dos equipamentos, o
controle da reatividade dos meios e reagentes, os prazos de validade, os resultados de todos os testes,
etc.
Devem ser elaborados formulrios adequados para coletar dados, de modo que qualquer anormalidade
possa ser facilmente detectada. O encarregado tambm deve revisar todos os registros de controle
e verificar que sejam anotadas todas as incidncias fora do controle e as respectivas aes corretivas
tomadas.
Os laboratrios devem tambm dispor de uma lista de inspeo para realizar avaliaes pontuais dos
controles de qualidade um requerimento para credenciamento de laboratrios e/ou auditoria e
fiscalizao sanitria.
Para melhoria na qualidade dentro do laboratrio recomenda-se a elaborao de POPs, ou seja,
procedimentos que descrevem detalhadamente cada atividade realizada no laboratrio, desde a coleta
at a emisso do resultado final, incluindo utilizao de equipamentos, procedimentos tcnicos e inclusive
cuidados de biossegurana e condutas a serem adotadas em acidentes.
Os POPs tm como objetivo padronizar todas as aes para que diferentes tcnicos possam compreender
e executar, da mesma maneira, uma determinada tarefa, garantindo assim qualidade.
35
Esses POPs devem estar escritos de forma clara e completa possibilitando a compreenso e adeso de todos. Os POPs
devem estar disponveis em local de acesso e conhecido de todos os profissionais que atuam no ambiente laboratorial,
revisados e atualizados periodicamente e devem ser assinados pelo responsvel do laboratrio.
A poltica da qualidade deve estar definida no manual da qualidade e ser assinada pelo executivo-chefe,
onde so tomadas as decises sobre as polticas e os recursos do laboratrio.
A poltica da qualidade deve incluir:
a)
b)
c)
d)
Uma declarao de que todo o pessoal envolvido com as atividades de ensaio est familiarizado com a
documentao da qualidade e que implementa permanentemente suas polticas e procedimentos;
e)
4.1
4.2
COMERCIAIS
Embora aceito por auditores, inspetores de laboratrio os registros de qualidade documentados pelos
fabricantes de meios de cultura, recomenda-se um controle de qualidade peridico desses produtos pelo
laboratrio.
36
Os microrganismos empregados para o controle de qualidade devem ser mantidos no laboratrio por meio de
subcultivos de isolados recuperados como parte do trabalho de rotina ou microrganismo de referncia como os
da ATCC.
Cada lote de meios deve ser controlada com os quesitos mais exigentes para o crescimento ou para a
produo de atividade bioqumica. A disponibilidade de cepas do laboratrio pode ser necessria para
suplementar aquelas comercialmente disponveis.
Cada tubo de cultura, placa de meio e reagente deve ter uma etiqueta que identifique claramente o contedo e
as datas de preparo e vencimento. Cada lote de tubos e placas deve ser tambm controlada quanto esterilidade,
principalmente aqueles nos quais so adicionados suplementos aps a esterilizao.
As provas de esterilidade devem ser feitas visualmente e por meio de subcultivos. Determinados
meios seletivos, por exemplo, podem suprimir o crescimento visvel de bactrias, mas as clulas viveis
podem aparecer nos subcultivos. Os meios preparados devem ser visualmente avaliados para sinais de
deteriorao como descolorao, turvao, mudana de cor e desidratao.
Os kits comerciais devem ser examinados a cada entrega e a cada lote, conforme as recomendaes do
fabricante. Os componentes de um kit no devem ser utilizados com um kit de lote diferente, a no ser
quando especificado pelo fabricante.
A frequncia das provas de controle de qualidade dos produtos comerciais utilizados no laboratrio
deve ser determinada pelo responsvel imediato do laboratrio, conforme as instrues dos respectivos
fabricantes ou referncias em literatura.
4.3
37
b)
38
a)
b)
c)
Comparaes interlaboratoriais
d)
e)
Avaliao da incerteza dos resultados com base no conhecimento cientfico dos princpios
tericos do mtodo e na experincia prtica.
A faixa e a exatido dos valores que podem ser obtidos por meio de mtodos validados devem ser
pertinentes s necessidades dos clientes, como:
a)
b)
Limites de deteco;
c)
Seletividade do mtodo;
d)
Linearidade;
e)
f)
39
Quando a auditoria constatar dvidas sobre a efetividade das operaes ou correo ou validade dos
resultados de ensaios, o laboratrio deve tomar aes corretivas em tempo hbil e notificar, por escrito,
ao cliente, se for demonstrado que os resultados foram afetados.
Devem ser registradas a rea de atividade auditada, as constataes da auditoria e as aes corretivas
dela decorrentes.
As atividades de acompanhamento da auditoria devem verificar e registrar a implementao e a eficcia
das aes corretivas tomadas.
40
identificao do laboratrio;
b)
endereo do laboratrio;
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
observaes pertinentes.
41
5 LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
5.1
Os Princpios das Boas Prticas de Laboratrio devem ser estabelecidos a fim de garantir a qualidade do
servio prestado pelo laboratrio microbiolgico.
5.1.1 Pessoal
Para execuo das responsabilidades atribudas ao laboratrio analtico microbiolgico, o pessoal deve ter
treinamento bsico em microbiologia e experincia pratica suficiente nas tcnicas aplicadas e em relao
aos microrganismos estudados.
O responsvel pela emisso dos resultados e laudos analticos deve possuir competncia (habilitao)
para interpretar com confiana os resultados obtidos.
5.1.2
Instalaes Prediais
42
Fonte: Avisa
gua deionizada: gua pura isenta de ons. Deve ser preparada para uso imediato apenas,
diminuindo assim a possibilidade de contaminao.
Meio de cultura: podem ser encontrados como slidos liofilizados prontos para preparo ou
como meios prontos para uso.
43
Placas de Petri de vidro ou plstico descartvel (mais comum entre 85 a 100 mm de dimetro)
5.1.2.3 Armazenagem
Todas as matrias-primas, consumveis, meios de cultura prontos para uso (conforme descrito pelo
fabricante), materiais de referncia e devem ser armazenados hermeticamente para garantir sua qualidade
no momento do uso (p.ex. abrigo da luz, da umidade, da temperatura).
Amostras devem ser analisadas o mais rpido possvel, aps a coleta. Quando isso no possvel ou
quando esto destinadas a ser analisadas posteriormente, devem ser transportadas e armazenadas em
condies que garantam a integridade e exatido do resultado analtico.
5.1.3 Equipamentos
Todos os equipamentos devem ser devidamente instalados, qualificados e conservados de acordo com
as normas estabelecidas no laboratrio. Deve-se documentar toda limpeza, calibrao e manuteno dos
equipamentos, bem como monitoramento do seu uso.
5.1.3.1. Tipos
Laboratrios microbiolgicos devem estar equipados minimamente com:
44
Banho-maria: Aplicvel para incubao de meios de cultura inoculados e testes temperaturadependente, assim como para aquecer meios de cultura do tipo gar sua forma lquida.
Fluxo laminar: cabines fechadas com passagem de corrente de ar nas entradas, bloqueando
fisicamente a passagem de microrganismos. Utilizado com o propsito de proteger a
amostra de contaminao externa e de proteger o analista do material contido dentro da
cabine.
5.1.3.2 Qualificao/Calibrao/Aferio
A calibrao e qualificao devem ser realizadas em todos os equipamentos que influenciam diretamente
no resultado dos ensaios. A frequncia das calibraes deve ser estipulada pelos responsveis do
laboratrio, mas deve ser minimamente suficiente para garantir as condies adequadas do uso dos
equipamentos. Podem ser utilizadas evidncias no histrico do equipamento ou recomendaes do
fornecedor no momento de decidir a frequncia e necessidade de calibrao. Todas as calibraes devem
ser devidamente registradas e documentadas.
45
5.2 CEPAS
5.2.1 Identificao de Microrganismos
Desde a descoberta dos microrganismos h alguns sculos, vm se buscando novas maneiras de identificar
as bactrias. Neste item sero abordados alguns mtodos que auxiliam na identificao de microrganismos.
Bactrias Gram-positivas
Fonte: Avisa
46
Bactrias Gram-negativas
Culturas de referncia
As culturas de referncia consistem em microrganismos classificados por gnero e espcie, catalogados e
descritos de acordo com suas caractersticas e origem (ISO 11133-1:2000).
Devem ser adquiridos de Centro de Referncia como: ATCC (American Type Culture Collection), NCTC
(National Collection of Type Cultures), INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade),
NBRC (NITE Biological Resource Center), NCIMB (National Collection of Industrial Bacteria), NCPF
(National Collection of Pathogenic Fungi), IMI (International Mycological Institute), UKNCC (United
Kingdom National Culture Collection), CIP (Collection de lInstitut Pasteur) e NCYC (National Collection of
Yeast Cultures).
Para a reconstituio das culturas de referncia recomendado seguir as instrues do fornecedor, que
determina meios de cultura e tempos de incubao ideais.
47
Culturas estoque
As culturas estoque so consideradas as preparadas conforme indicao do fornecedor a partir de uma
cultura referncia (ISO 11133-1:2000).
O repique deve ser realizado em meio de cultura adequado e mantido sob-refrigerao (2 a 8 C),
devidamente identificada com nome do microrganismo, nmero de identificao (exemplo:ATCC 6538),
gerao a que se refere (2 G) , lote, data de preparao e validade
Exemplo:
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 2 G
Lote 12345678-9
Data 01/01/ 2013
Validade 1 ms
Mensalmente, a cultura estoque mantida em tubo ou placa deve ser renovada, por repique em meio de
cultura adequado. Realizar controle das culturas repicadas mensalmente, conduzindo testes confirmatrios
de acordo com a caracterstica de cada microrganismo (exemplo colorao de Gram, coagulase, oxidase,
catalase, kits comerciais, etc). Todos os dados devem ser registrados, permitindo a sua rastreabilidade.
48
Cultura de trabalho
As culturas de trabalho so obtidas a partir de uma cultura estoque para serem utilizadas em testes
microbiolgicas quando aplicveis (ISO 11133-1:2000).
O repique deve ser realizado em meio de cultura adequado e mantido em estufa incubadora por tempo
e temperatura determinados pelo fornecedor conforme exemplo abaixo:
Temperatura
de Incubao
Tempo
de Incubao
Meio de
Cultura
Bactrias
30 - 35C
21 3 horas
TSA *
Leveduras
20 - 25C
48 4 horas
SDA **
Fungos filamentosos
20 - 25C
6 - 10 dias
SDA **
Legenda: TSA* = meio de cultura Trypticase Soya Agar; SDA ** = meio de cultura Saboraud Dextrose Agar
Aps perodo de incubao as culturas podem ser utilizadas para conduo de testes microbiolgicos (teste
desafio de conservante, teste de fertilidade, validao de mtodo de testes microbiolgico, etc.).
Em casos especficos ou quando definido pela empresa pode- se utilizar nos testes microbiolgicos, alm
das culturas de trabalho, que partiram de uma cultura de referncia, culturas de microrganismos isolados
de produtos ou ambiente (Farmacopeia Brasileira 5 edio 2010).
recomendado anotar cada repique em ficha ou caderno a fim de controlar as geraes obtidas e garantir
a rastreabilidade do processo.
O descarte da cultura de trabalho feita aps o uso conforme procedimento de descarte de resduos com
risco microbiolgico de cada laboratrio no sendo necessrio o registro na ficha ou caderno.
49
CULTURA
ESTOQUE
IDENTIFICAO
CEPA
5 GERAO
IDENTIFICAO
4 GERAO
CEPA
3 GERAO
2 GERAO
1 GERAO
ATCC
REFERNCIA
CULTURA DE TRABALHO
2 A 8C
Criogenizao de cepas
De acordo com USP 37-NF 32 captulo 1117 pode-se realizar a criogenizao das culturas mantendo congelada
a temperatura de at -70 C. A partir desta tcnica as clulas so mantidas em seu estado vivel por um
perodo de tempo indefinido. Estas culturas criogenizadas podem ser usadas como cultura de trabalho.
importante ressaltar que uma vez retirado do Ultrafreezer, o cryovial (tubo), no pode ser novamente
congelado.
Preparao de Cryovials
Aps crescimento da cultura de 1 Gerao, lavar os tubos ou placas com soluo salina (bactrias e leveduras)
ou soluo salina acrescida de 0,05% de Tween 80 para fungos filamentosos, exemplo Aspergillus brasiliensis.
Para obter a 2 Gerao, repicar a suspenso acima com loop descartvel em tubo inclinado, placas ou
garrafa de Roux e incubar conforme tabela abaixo:
Temperatura
de Incubao
Tempo
de Incubao
Meio de
Cultura
Bactria
30 - 35C
21 3 horas
TSA
Leveduras
20 - 25C
48 4 horas
SDA
A. brasiliensis
20 - 25C
6 - 10 dias
SDA
Legenda: TSA* = meio de cultura Trypticase Soya Agar; SDA ** = meio de cultura Saboraud Dextrose Agar
50
Aps perodo de incubao determinado, lavar os repiques com meio de cultura TSB acrescido de 15%
glicerol (soluo crioprotetora) que evitar o rompimento das clulas durante o processo de congelamento.
Transferir no mesmo dia da preparao, aproximadamente de 1 a 2 ml (no mais que 2/3 do volume
do tubo) da suspenso para cryovials. Identificar cada cryovial com nome do microrganismo, nmero de
ATCC, data da preparao e data de expirao.
Realizar preparado em quarentena at que os testes estejam concludos. Se a pureza controle de pureza
e identificao da cultura de um dos cryovials preparados, e manter o restante da cultura for confirmada
(>90%), estocar em Ultrafreezer a temperatura de -70C. Caso a pureza da cultura no seja satisfatria
(<90%), todos os cryovials devem ser descartados conforme procedimento de descarte de resduos com
risco microbiolgico de cada laboratrio.
Descongelamento do Cryovial
Retirar o Cryovial do Ultrafreezer e coloc-lo em incubadora a 30-35C aproximadamente de 30 a 60
minutos ou at que descongele o contedo. No permitido congelar novamente uma vez descongelado
o cryovial.
Para a obteno das 3, 4 geraes proceder da mesma maneira citada acima, com exceo da 5 gerao
que s poder ser usada nos testes microbiolgicos e no poder utilizada no preparo de uma nova
gerao sendo ento descartada aps seu uso conforme procedimento de descarte de resduos com risco
microbiolgico de cada laboratrio.
2 GERAO
2 GERAO
IDENTIFICAO
CEPA
5 GERAO
3 GERAO
ESTOQUE
-70 C
4 GERAO
2 GERAO
AT C C
2 GERAO
1 GERAO
GARRAFA DE ROUX
2 GERAO
CULTURA DE TRABALHO
51
MICRORGANISMO:
ATCC:
LOTE:
VALIDADE:
RECONSTITUIO
CRIOGENIZAO
Data:
Data:
Meio de cultura/Lote:
Meio de cultura/Lote:
Gerao:
Responsvel:
52
Quantidade:
Gerao:
Responsvel:
Validade:
Quantidade:
5.2.4. Validade
A data de validade de cada cepa liofilizada ou pronta para uso determinada pelo fornecedor e deve-se
seguir a recomendao contida em seu Certificado de Anlise.
Para culturas estoque a data de validade de um ms e para culturas de trabalho a data de validade
consiste em uma semana. Ambas devem ser mantidas refrigeradas de 2 a 8 C.
Para culturas criogenizadas, a data de validade torna-se indeterminada.
Para cada uma dessas apresentaes de cultura, observar suas caractersticas morfolgicas, pureza
e identificao atravs de testes confirmatrios adequados (colorao de Gram, coagulase, oxidase,
catalase, kits comerciais, etc). Caso alguma contaminao seja observada, a cultura deve ser descartada
conforme procedimento de descarte de resduos com risco microbiolgico de cada laboratrio. Todos os
dados devem ser registrados, permitindo a sua rastreabilidade.
53
Inteno de uso
D)
Mtodo de preparo
A) COMPOSIO
a.
pureza.
b.
B) CONSISTNCIA
a.
b.
C)
INTENO DE USO
a.
54
b.
c.
d.
e.
f.
Corao.
g.
h.
i.
j.
dos microrganismos para sua identificao. Exemplo: Agar Eosina Azul de Metileno.
k.
Meio de mltiplas finalidades certos meios que podem atender diversas categorias.
l.
55
Finalidade
Quimicamente Definido
Complexo
Redutor
Seletivo
Diferencial
Enriquecimento
D)
MTODO DE PREPARO
a.
Meio pronto para uso fornecido em recipientes no formato pronto para uso.
b.
Meio desidratado comercialmente disponvel meio no formato seco na qual no est pronto
para uso imediato. Exemplo p, grnulos. A re-hidratao formar um meio completo pronto
para uso ou um meio incompleto que necessita de componentes adicionados na hora do uso.
c.
56
6.1.1.2 pH
A maioria das bactrias cresce melhor dentro de variaes pequenas de pH sempre perto da neutralidade,
entre pH 6,5 e 7,5. Poucas bactrias so capazes de crescer em pH cido como pH 4,0. No entanto, algumas
bactrias denominadas acidfilas apresentam alto grau de tolerncia acidez.
Os fungos filamentosos e as leveduras podem crescer em variaes de pH maiores que as bactrias, porm,
os valores timos de pH para fungos so geralmente inferiores, entre 5 e 6.
As bactrias cultivadas em laboratrio com frequncia produzem cidos que podem acabar interferindo
no seu prprio crescimento. Para neutralizar esses cidos e para a manuteno do pH normalmente so
includos tampes qumicos nos meios de cultura. Portanto, os pHs dos meios de cultura variam de acordo
com o microrganismos a ser cultivado.
6.1.1.4 Validade
A validade dos meios de cultura variam de acordo com a composio e o fabricante, portanto importante
seguir a recomendao descrita no rtulo.
Para os meios de cultura estreis, parcialmente completos, nas quais componentes finais so adicionados
imediatamente antes do uso, devem ser mantidos sob refrigerao por at 3 meses ou a temperatura
ambiente por at 1 ms, para prevenir que sua composio seja modificada. Contudo, recomenda-se que o
meio que tenha suplementos seletivos sensveis adicionados, seja usado no dia do preparo. Meios slidos
contendo substncias quimicamente reativas e/ou sensveis no devem ser armazenados em grandes
quantidades para fuso.
57
Antes do uso ou do aquecimento adicional, recomenda-se que o meio de cultura atinja a temperatura
ambiente.
Esterilidade uma quantidade adequada de cada lote deve ser testada para contaminao microbiana,
atravs da incubao sob condies apropriadas, antes do uso ou em paralelo com o meio inoculado. Meios
seletivos podem apresentar alguns problemas, devido inibio de vrios microrganismos. A contaminao
pode no estar evidente visualmente, em forma de turbidez ou formao de colnia. Este problema pode
ser superado atravs da transferncia de uma poro do meio seletivo lquido para um meio no seletivo
ou fazendo um swab da superfcie da placa e incubando o swab em um meio no seletivo. Limites para a
porcentagem de placas ou tubos ou frascos com meio lquido contaminados, devem ser estabelecidos para
cada meio, ou especificados pelo fabricante.
Organismos teste Um conjunto de organismos teste deve conter microrganismos com caractersticas
estveis, representativas de sua espcie e que sejam confiveis para demonstrar o desempenho de
um meio preparado no laboratrio. Os organismos teste devem compreender as cepas que estejam
facilmente disponveis nas colees de cultura de referncia, porm cepas bem caracterizadas, isoladas
no laboratrio tambm podem ser includas.
Os organismos teste para cada meio pode incluir:
cepas positivas que crescem fracamente (de uma natureza mais sensvel);
Para os meios que no contm indicadores ou agentes seletivos, o uso de uma cepa teste positiva simples,
adequado. Para os meios que contm indicadores ou agentes seletivos, devem ser utilizadas cepas que
demonstrem a funo do indicador e seletividade. Para os meios complexos, como os adicionados de
suplemento, cada lote deve ser verificado com as cepas que apresentem as caractersticas listadas acima.
58
Produtividade meios de cultura lquidos, semi-slidos e slidos devem ser inoculados com inculos
apropriados da cultura de trabalho dos organismos teste, utilizando um dispositivo adequado. Para
mtodos quantitativos a produtividade a relao entre a contagem total de colnias no meio de cultura
teste e contagem total de colnias no meio de cultura de referncia.
Seletividade Para a avaliao da seletividade em mtodos quantitativos, utilizando dispositivos adequados
e organismos teste definidos, um meio de cultura seletivo e um meio de referncia so inoculados com
inculos apropriados dos organismos teste. Seletividade a diferena entre a maior diluio, apresentando
crescimento acima de 10 colnias, no meio de referncia e a maior diluio, apresentando crescimento
comparvel, no meio teste.
Cuidado especial deve ser dado seleo das amostras e organismos a serem avaliados nestes testes. Se
organismos teste so utilizados na avaliao de meios no seletivos, os organismos escolhidos devem ser
to fastidiosos quanto queles para a qual o meio ser utilizado rotineiramente. Recomenda-se que mais
de um organismo teste seja utilizado para avaliar um determinado meio.
Para a avaliao de meios seletivos/diferenciais, devem ser escolhidos organismos que testem as
caractersticas seletivas/diferenciais e de produtividade do meio. Meios lquidos podem ser avaliados
utilizando organismos que devem crescer no meio e queles que devem ser reprimidos. Seguindo com
uma incubao adequada, as concentraes devem ser determinadas para cada organismo teste. Um
meio aceitvel deve apresentar altas concentraes do organismo esperado e baixas concentraes do
organismo reprimido. O desempenho de um novo lote deve ser similar ao lote controle. A avaliao de
um meio slido realizada de uma maneira parecida.
Microrganismos do grupo para qual o meio designado devem ser recuperados, quantitativamente,
quase comparado ao meio no seletivo. Organismos que devem ser reprimidos pelo meio, no podem se
desenvolver ou devem ser fortemente reduzidos, ao se comparar com a enumerao do meio no seletivo.
6.1.1.6 Armazenagem
De forma geral, os meios pontos devem ser armazenados temperatura entre 2 a 8C (geladeira). O efeito
nocivo comumente associado ao armazenamento a desidratao. Esta no ser problema em meios
lquidos e sim nos meios em placas, principalmente em laboratrios pequenos onde certos meios so
usados ocasionalmente. Estes meios em placas devem ser conservados em sacos plsticos, selados, para
minimizar a perda de umidade, e estocados em posio invertida. Todos os meios devem ser levados
temperatura ambiente antes do seu uso. Meios como gar padro, batata e outros, podem ser guardados
em volumes para serem adicionados em placa (15 ml). No momento da anlise sero fundidos, resfriados
e adicionados na placa contendo a amostra.
Os meios de cultura em p devem ser armazenados de acordo com as recomendaes do fabricante.
59
nome do produto,
data de recebimento,
tipo de anlise.
6.1.2.1 Assepsia
Para evitar contaminao dos produtos, manusear de forma a evitar risco de contaminao. Para isto,
devem-se seguir tcnicas de assepsia, como por exemplo:
6.1.2.2 Pesagem
A preparao inicial e de amostras diludas, deve ser realizado em um intervalo entre o fim do preparo e o
momento que o inoculo entra em contato com o meio de cultura no deve exceder 45 min.
Registrar o volume ou massa que foi pesado da amostra.
60
6.2
Os procedimentos para inativao do sistema preservante devem ser validados, pois a amostra diluda no
pode inibir a multiplicao dos microrganismos, eventualmente presentes.
A inativao do sistema preservante realizada atravs da transferncia da concentrao aproximada de
10 de microrganismos viveis por 0,5 mL de diluente neutralizante para a placa de petri contendo 1 mL
da diluio 1:10 do produto (em duplicata). Adicionar 15 mL do meio de cultura adequado, esterilizado e
resfriado at cerca de 46C.
O crescimento parcial ou o no crescimento do microrganismo invalida o teste. Os microrganismos
sugeridos para a realizao do ensaio para comprovar a inativao do sistema preservante esto listados
abaixo:
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Candida albicans
Aspergillus brasiliensis
Inativante
Parabenos
3% p/v polissorbato 80
Formaldedo
Isotiazolinonas
Dibromoglutaronitrila
Imidazolidinil uria/Diazolidinil
uria/dm hidantona
0,5% histidina
Piritionato de zinco
3% p/v polissorbato 80
0,5% p/v cistidina/histeina
Ipbc
3% p/v polissorbato 80
0,5% p/v cistidina/histeina
Fenoxietanol
2% p/v polissorbato 80
0,3% p/v lecitina de soja
Outros fenis
3% p/v polissorbato 80
61
7 MTODOS MICROBIOLGICOS
Neste captulo sero abordados mtodos de anlises microbiolgicas em produtos acabados e matriasprimas utilizados em produtos de HPPC.
7.1 PLAQUEAMENTO
Existem 2 tipos de plaqueamento: plaqueamento em profundidade e plaqueamento por semeadura em
superfcie.
O plaqueamento por profundidade consiste em adicionar a amostra diluda, distribuir o meio de cultura
fundido em placa de Petri esterilizada at que se obtenha uma camada de no mnimo 3 mm a 4 mm
(por exemplo, para placa de 90 mm de dimetro, 15 mL a 20 mL de gar so normalmente requeridos)
homogeneizar rapidamente fazendo crculos com a placa. Aguardar o resfriamento e solidificao do gar,
colocando as placas de Petri em uma superfcie horizontal e temperatura ambiente.
O plaqueamento por semeadura em superfcie consiste em distribuir o meio de cultura fundido em placa
de Petri esterilizada at que se obtenha uma camada de no mnimo 3 mm a 4 mm (por exemplo, para placa
de 90 mm de dimetro, 15 mL a 20 mL de gar so normalmente requeridos). Aguardar o resfriamento
e solidificao do gar, adicionar a amostra diluda e semeia-se com o auxlio de um loop ou ala de
Drigalsky proporcionando completa absoro da amostra no Agar.
7.2
62
no mais que 48C em placas de Petri de 90 mm de dimetro. Resfriar e solidificar. Semear na superfcie
do meio de cultura um volume determinado, no menos que 0,1 mL da preparao inicial e/ou diluio
da amostra preparada.
7.2.1
A menos que haja outra indicao, inverter a placa inoculada e coloc-la em incubadora regulada a 32,5
C 2,5C por 72 h 6h.
7.3
7.3.1
Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados, equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao
inicial dever ser realizada com agente solubilizante adequado, o tempo transcorrido entre o momento
da inoculao at que entre em contato com o caldo de enriquecimento e o fim do preparo no deve
exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL
adequadamente homogeneizado do produto a ser analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo
de enriquecimento.
Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).
Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar MacConkey, de modo a obter colnias isoladas.
63
Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).
Observar a presena de colnias vermelho-tijolo.
Colorao de Gram
Fonte: AVISA
Fonte: AVISA
64
Fonte: AVISA
equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao inicial dever ser realizada com agente solubilizante
adequado, o tempo transcorrido entre o momento da inoculao at que entre em contato com o caldo
de enriquecimento e o fim do preparo no deve exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado
a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL adequadamente homogeneizado do produto a ser
analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo de enriquecimento.
Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).
Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar Cetrimide, de modo a obter colnias isoladas.
Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).
Observar a presena de colnias pigmento amarelo - verde
(piocianina), com fluorescncia sob luz UV.
Cetrimide
Dar sequncia aos testes para colnias suspeitas isoladas no
Agar Cetrimide. A presena de Pseudomonas aeruginosa
pode ser confirmada por outros testes adequados, cultura e
testes bioqumicos.
Colorao de Gram
Observar presena de bastonetes Gram-negativos.
Fonte: AVISA
65
Teste de oxidase
Observar teste positivo para oxidase
e 72h. Pseudomonas aeruginosa formam colnias rodeadas por zona azul a verde devido formao de
piocianina ou uma zona vermelha a marrom escura devido produo de piorrubina.
7.3.3
Staphylococcus aureus
Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados, equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao
inicial dever ser realizada com agente solubilizante adequado, o tempo transcorrido entre o momento
da inoculao at que entre em contato com o caldo de enriquecimento e o fim do preparo no deve
exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL
adequadamente homogeneizado do produto a ser analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo
de enriquecimento.
66
Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).
Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar Baird Parker, de modo a obter colnias isoladas.
Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).
Observar a presena de colnias pretas, brilhantes, circundadas por zonas claras.
Dar sequncia aos testes para colnias suspeitas isoladas no
Agar Baird Parker. A presena de Staphylococcus aureus pode
ser confirmada por outros testes adequados e testes
bioqumicos.
Colorao de Gram
Teste de Catalase
Observar teste positivo para catalase.
Teste de Coagulase
Observar resultado positivo para coagulase.
Se a identificao das colnias confirmar a presena dessa espcie,
Fonte: AVISA
67
Misturar cada parte das pores e transferir 10ml/g para um recipiente contendo 90 mL do meio Reinforced
Medium for Clostridia para diluio. Incubar a amostra diluda em uma jarra de anaerobiose a 30-35 C
por 48 h. Aps incubao utilizando uma ala estril, estriar uma alquota do meio Reinforced Medium
for Clostridia de enriquecimento incubado sobre a superfcie da placa de Petri j preparada com meio
Columbia Agar de modo a obter colnias isoladas.
Imagem
11: Clostridium sp em
Agar Columbia
Incubar as placas de Petri em posio invertida em jarra de
anaerobiose a 30-35C por 48 a 72 horas.
Se a identificao das colnias confirmar a presena dessa
espcie, expressar o resultado como: Presena de Clostrdios
sulfito redutores na amostra.
Se no houver crescimento aps o enriquecimento e/ou a
identificao das colnias no confirmar a presena dessa
espcie, expressar o resultado como: Ausncia de Clostrdios
sulfito redutores na amostra.
Fonte: AVISA
7.4
O teste de eficcia do sistema conservante, tambm conhecido como Teste de Desafio Microbiolgico,
ou Challenge Test, tem como objetivo final determinar a resistncia de um produto ou material
contaminao microbiana, refletindo diretamente a eficcia do sistema conservante.
Atravs deste teste possvel verificar se a dosagem de conservante est adequada ao produto final, e
se o produto est apto a resistir s intempries na qual ser submetida, durante o perodo de validade do
produto.
Resumidamente, uma quantidade do material teste (produto) inoculada com uma determinada populao
de microrganismo padro. O produto contaminado com o microrganismo-teste incubado em condies
de temperatura adequados para o desenvolvimento do microrganismo utilizado. Em diferentes tempos de
incubao, uma alquota do produto contaminado retirada e a contagem microbiana realizada.
A eficcia do sistema conservante escolhido para um produto em desenvolvimento no pode ser previsto
com base somente na sua composio. Portanto, a formulao deve ser testada atravs de um desafio
68
microbiolgico. O mtodo utilizado no s deve ser validado, mas necessrio levar em considerao o
tipo do produto e a sua utilizao. Recentemente, os testes simulando o uso dos produtos de HPPC (in-use
tests) esto adquirindo importncia.
Um ponto muito importante sobre os testes de desafio microbiolgicos que, at o presente momento,
no h consenso num mtodo harmonizado, de forma global. A norma ISO 11930:2012 Cosmetics
Microbiology Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product, especfica para
produtos de HPPC, encontra-se em fase de discusso final, e possvel que venha a se tornar uma norma
harmonizada para este setor.
Diferentes mtodos oficiais e normativos apresentam pequenas variaes de procedimento, que sero
apresentadas a seguir.
Um levantamento realizado por Anon (1990) indicou que nos EUA, 78% utilizavam a metodologia CTFA
modificada. As modificaes mais frequentes envolvem o uso de microrganismos adicionais, desafios
mltiplos, aumento da concentrao de microrganismos inoculados e critrios mais rigorosos de aprovao.
Somente 3% utilizavam o mtodo conforme publicado. A metodologia USP estava adotada por 19% das
empresas, e a norma ASTM no havia sido adotada por nenhuma empresa.
A metodologia USP 37, est orientada conforme as 4 categorias dos produtos compendiais, sendo a que
mais aproxima da aplicao cosmtica e em domissanitrios a Categoria 2.
Categoria 3: Produtos orais, exceto anticidos, preparados com bases ou veculos aquosos.
7.4.1
Nvel de Inculo
O inculo para o Challenge Test constitudo de uma suspenso, em soluo salina ou gua estril, das
clulas microbianas, preparada a partir de uma cultura ativa, de 24 48h em superfcie de gar (tubo
inclinado ou placas de Petri), do meio recomendado para cada microrganismo. A suspenso ajustada
para uma contagem de 108 ufc.mL-1 para as bactrias (Pseudomonas, Staphylococcus, etc.) e 107 ufc.mL-1,
para os fungos (Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, etc.), usando tcnicas como a densidade ptica
(DO620 0,15 a 0,46 para suspenses celulares a 108ufc.mL-1), por turbidimetria, ou por comparao visual
com os tubos padres de McFarland.
69
USP 37
FB 5
EP 7
ISO 11930
ASTM
E640-06
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027
Escherichia coli
ATCC 11229
Escherichia coli
ATCC 8739
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
X
X
Enterobacter gergoviae
ATCC 33028
Burkholderia cepacia
ATCC 25416
Candida albicans
ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis
ATCC 16404
Eupenicillium levitum
ATCC 10464
Microrganismos in-house
ou deteriorantes
opcional
USP37: United States Pharmacopeial Convention, Ed. 37
FB 5: Farmacopia Brasileira, 5 Edio
EP 7: European Pharmacopeia, 7th Edition
70
Cepas
Quais Usar
Isolados in-house
Um ou mais
Cocos Gram+
Staphylococcus aureus
Staplylococcus epidermidis
Ao menos um
Bacilos Gram-fermentativos
Klebsiella pneumoniae
Enterococcus cloacae
Escherichia coli
Proteus sp.
Enterococcus georgoviae
Ao menos dois
Pseudomonas aeruginosa
Burkholderia cepacia
Pseudomonas putida
Pseudomonas fluorescens
Flavobacterium sp.
Acinetobacter sp.
Pseudomonas
aeruginosa, e
outro adicional
Leveduras
Candida albicans
Candida parapsilosis
Ao menos um
Fungos
Aspergillus niger
Penicillium luteum
Ao menos um
Bacilos esporulados
Bacillus subtilis
Opcional
A seleo dos microrganismos utilizados para o teste de desafio microbiolgico determinada com base
em riscos e frequncia que participam do processo de deteriorao.
Um fator importante a ser considerado que tanto o CTFA quanto o ASTM preconizam desafio com
inculos mistos de bactrias, e de leveduras + fungos. A metodologia USP preconiza o uso de inculos
individuais, ou seja, cada microrganismo testado separadamente.
71
72
Alquotas so retiradas em dois momentos (no incio e aps um tempo de contato definido pelo mtodo),
diludas e semeadas em placas para contagem, segundo o protocolo estabelecido. A confirmao da
ausncia de declnio significativo na contagem entre o inoculo diludo no neutralizante e aquele diludo
em diluente universal indica que a neutralizao foi eficiente, e no afeta o inoculo.
Se as placas de controle do inoculo apresentarem crescimento normal e no for observado crescimento
nas placas das diluies mais baixas, esta uma clara indicao de que o neutralizante no adequado,
e outro deve ser selecionado.
A descrio passo-a-passo se encontra descrita na norma EN 1040 (ref.) e ASTM E-1054 (ref.)
USP 37
CTFA
ASTM 640-06
Bactrias
32,5 2,5C
18 a 24h
30 a 37C
18 a 48h
35 2C
24 a 48h
Leveduras
22,5 2,5C
44 a 52h
25 a 35C
24 a 48h
25 2C
48 a 72h
Fungos
filamentosos
22,5 2,5C
6 a 10 dias
20 a 30C
7 a 28 dias
25 2C
5 a 7 dias
USP 37
CTFA
ASTM 640-06
Bactrias
22,5 2,5C
30 a 37C
24 a 48h
35 2C
48 a 72h
Leveduras
22,5 2,5C
25 a 35C
48 a 72h
Opcional
Fungos
filamentosos
22,5 2,5C
20 a 30C
3 a 7 dias
Opcional
Fungos (leveduras +
fungos filamentosos)
25 2C
3 a 5 dias
73
7.4.7
Perodos de teste
CTFA: 0, 1-3, 7, 14, 21 e 28 dias. Se for introduzida a reinoculao, a contagem semanal retomada
por pelo menos 21 dias.
ASTM: 0, 7, 14, 21 e 28 dias, sendo o 21 dia considerado opcional, e mais contagens intermedirias
podem ser adicionadas.
Grupo de Produtos
Critrio
Produtos de Categoria 1: No menos que 1 Log de reduo em
7 dias, no menos que 3 Log de reduo em 14 dias
e sem aumento na contagem em 28 dias.
Bactrias
USP
Bactrias
Leveduras e Fungos
filamentosos
Bactrias e
Leveduras
Fungos
CTFA
ASTM
74
RD = Log No Log Nx
Onde RD = Reduo Decimal, ou Reduo Logartmica, No a contagem inicial e Nx a contagem do
tempo x de contato.
Avaliao do resultado: nmero positivo indica a reduo decimal obtida, e um nmero negativo
indica crescimento microbiano. Os resultados devem ser analisados conforme os critrios de aceitao
apresentado no tem 6.5.8.
7.5
HALO DE INIBIO
7.5.1
A seleo dos microrganismos-teste e os meios de cultura podem ser obtidos nos compndios (USP, FB,
75
7.5.2
Difuso em gar
O mtodo de difuso em gar consiste na medida do halo de inibio formado, onde o microrganismoteste o visualizador desta inibio. Em princpio, o antimicrobiano se difunde atravs da superfcie do
meio de cultura contendo gar, inibindo ou mesmo matando os microrganismos presentes na rea.
Desenvolvido primeiramente para a aplicao clnica, na dosagem e seleo de antibiticos, conforme
citado anteriormente, o mtodo simples, e permite introduzir variaes, para adapt-los a diferentes
situaes.
Neste captulo estaremos focando a aplicao no-clnica, ou seja, produtos de HPPC, com conservantes
e ao antimicrobiana.
A difuso em gar realizada de duas formas distintas: com orifcio em Agar ou tcnica dos poos - Figura
04 ou com discos de papel - Figuras 05 e 06.
SOBRECAMADA INOCULADA
MEIO DE CULTURA
DISCOS DE ANTIBIOGRAMA
HALO DE INIBIO
MEIO DE CULTURA
76
Para outras aplicaes, em especial na rea cosmtica, o teste realizado utilizando-se um suporte, como
o papel de filtro cortado em crculos, de 40 a 50 mm de dimetro, esterilizados. Sobre este suporte, o
produto aplicado, mantendo-se a quantidade aplicada nos Branco e Controle. Neste caso, somente um
suporte utilizado em cada placa.
7.5.3 Leitura
A formao do halo de inibio, ausncia/presena de crescimento microbiano sobre o corpo de prova, e
as medidas do halo so anotadas.
No caso de antibiticos, a medida realizada pelo dimetro do halo, ou seja, de toda a zona inibitria.
No caso em que o tamanho do disco diferente, as regras do mtodo NCCLS devem ser ajustadas.
Ou seja, no h como mensurar quantitativamente a concentrao do conservante.
77
7.6
REDUO LOGARTIMICA
7.7
ATIVIDADE ANTISSPTICA
O claim antissptico utilizado para produtos que devem matar os microrganismos sobre a pele e
mucosa, at nveis considerados seguros, num intervalo de tempo adequado. Nesta classe de produtos se
enquadram os sabonetes degermantes, antisspticos, produtos a base de lcool utilizado para antissepsia,
produtos higienizantes de uso domstico e hospitalar, produtos de higiene pessoal, enxaguatrio bucal,
entre outros.
O ensaio realizado para avaliar a reduo da populao microbiana proporcionada pelo produto teste
quando entra em contato com as bactrias. Vrios microrganismos podem ser testados, dependendo
da finalidade do produto teste, no entanto, os microrganismos comumente testados so: Sthapylococcu
aureus e Pseudomonas aeruginosa, sendo estes representantes das bactrias Gram positivas e Gram
negativas respectivamente.
Estes microrganismos tambm so os indicados na norma CEN 1040, para a avaliao bsica de um
produto antimicrobiano.
Em se tratando de microbiota da pele, o Staphylococcus epidermidis prevalente sobre Staphylococcu
aureus. Porm, o S. aureus um microrganismo-teste mais robusto que o S. epidermidis. A Pseudomonas
aeruginosa um microrganismo com maior resistncia erradicao que as demais bactrias Gramnegativas comumente adotadas como organismo teste: Escherichia coli e Salmonella choleraesuis.
Outros microrganismos podem e devem ser testados, de acordo com o tipo de produto, sua abrangncia
e rigor requeridos. Isto , no podemos dizer que o produto seja esporicida se bactrias esporuladas
no foram testadas. Microrganismos especficos da mucosa bucal, como o Streptococcus pyogenes,
78
podem ser includos nas avaliaes de enxaguatrios bucais, assim como Candida albicans, para reforar
a atividade fungicida.
7.7.1
7.7.2
Num tubo de ensaio contendo 8 mL de caldo neutralizante e 1mL de gua estril, adiciona-se
1mL da suspenso de inoculo contendo 104 a 105UFC/mL (populao inicial equivalente a 103 a
104UFC/mL);
79
Em outro tubo de ensaio, 9 mL de gua estril recebe 1mL do inoculo, como o Controle;
1 mL do contedo de cada tubo plaqueado, em duplicata, pela tcnica de pour plate em gar
TSA;
A ausncia de toxicidade do neutralizante confirmada se a mdia das contagens obtidas nas placas de
neutralizantes for igual mdia das contagens do tubo Controle, ou seja, (Log10 0,5).
Aps a incubao, retirada uma alquota de 0,1mL e colocado em um tubo contendo 9,8 mL de
caldo neutralizante;
Caso esta verificao for realizada ao mesmo tempo com o teste de toxicidade do neutralizante,
o Controle poder ser o mesmo para ambos os testes. Caso contrrio, adicionar o tubo Controle;
80
Aps o tempo de contato, transferida uma alquota de 0,1 mL em 9,9 mL de gua estril;
1 mL do contedo do tubo foi plaqueado, em duplicata, por pour plate, com gar TSA;
A eficcia da neutralizao confirmada se a mdia das contagens obtidas nas placas de neutralizantes
forem iguais mdia das contagens do tubo Controle, ou seja, (Log100,5).
7.7.3
A mesma quantidade de inoculo deve ser transferida para 49 mL de gua estril, sendo este o
controle do inoculo. A contagem desta amostra fornece a populao inicial do teste;
Aps este perodo cada umas das amostras so submetidas diluio decimal, e plaqueadas por
81
RD = log N0/NT
Equao 01
Uma vez obtida a RD, possvel e calculada a porcentagem de reduo obtida pelo contato do
microrganismo com a amostra atravs de Equao 2.
PR= (1-1/10RD)x100
Equao 2
82
83
8.1.2
Frequncia de testes
Nvel
Local
Limite
10-50 UFC / 25 cm
Mo de operador
50-100 UFC / 25 cm
100 UFC / 25 cm
Ambiente
Portas e paredes
100 UFC / 25 cm
Pisos
300-500 UFC / 25 cm
NRA
NRM
NRB
ndices praticados por algumas empresas de HPPC (no se tem referncia destes ndices em literatura)
Esta unidade (% Eficincia) usada para expressar de forma simples o desempenho da rea. Para uma
rea fabril ter bom desempenho, o percentual mnimo de eficincia dever ser de 80% para cada nvel de
risco.
84
8.2
AMOSTRAGEM (TCNICA/TIPO)
85
86
5 CM
9 ML DE SALINA
87
deixar a placa deslizar, pois poder favorecer o aparecimento de espalhamento de colnias dificultando a
contagem. Evitar pressionar com fora, pois poder acarretar deformaes no gar. Recolocar a tampa na
placa. O funcionrio dever lavar as mos e sanitiz-la aps a realizao do teste.
8.2.4
De acordo com a RDC 48 de 2013 as amostras de produtos acabados devem ser retidas nas embalagens
originais. Se for necessrio, em virtude da capacidade das apresentaes de venda, poder ser retido
produto fracionado em embalagem equivalente ao material de comercializao, a fim de facilitar o
armazenamento e a realizao dos ensaios. Em todos os casos as amostras devem ser armazenadas nas
condies especificadas, em quantidade suficiente para permitir, no mnimo, duas anlises completas.
Nos casos de produtos sujeitos contaminao microbiolgica, deve-se manter ao menos uma amostra
na sua embalagem original.
As amostras de reteno devem possuir rtulo contendo identificao, lote e data de validade.
As amostras de matrias-primas, quando aplicvel, devem ser retidas at o vencimento do seu prazo de
validade. As amostras de produtos acabados devem ser retidas por 1 (um) ano aps o vencimento do seu
prazo de validade.
Recomenda-se que as amostras sejam armazenadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz, salvo
excees que devero ser armazenadas de acordo com especificaes prprias.
O acesso s amostras de reteno deve ser restrito aos funcionrios autorizados.
Sugesto de rotulagem para reteno de matria-prima:
NOME DA EMPRESA
AMOSTRA DE RETENO
N ______
Produto: ________________________________________________________________________
Lote: __________________ Validade: __________________ Fornecedor: __________________
Amostragem: ____/____/____
88
Responsvel: _______________________
NOME DA EMPRESA
AMOSTRA DE RETENO
N ______
Produto: ________________________________________________________________________
Lote: ___________ Origem de Produo: ____________ Validade do Produto: ____________
Armazenar at: ____/____/____
Responsvel: _______________________
89
9 LIMPEZA E SANITIZAO
Assegurar a qualidade microbiolgica de fabricao atravs de programas eficazes de limpeza e sanitizao
essencial para assegurar as boas prticas de fabricao, e do produto final.
Os procedimentos para a limpeza e sanitizao necessitam estar claramente descritos e validados, pois
eles so complementares, isto , o sucesso do controle microbiolgico depende da sinergia dos dois
processos. A escolha do melhor mtodo para cada uma destas etapas depende de cada instalao,
produtos, matrias-primas e o processo de fabricao em si.
Etapa 1: Limpeza
realizada de forma fsica, de modo a remover a sujidade, resduos e grande parte da contaminao,
atravs do uso de gua, detergente, e outros agentes de limpeza. O objetivo principal desta etapa
promover a remoo de maior parte da sujeira, constitudo basicamente de resduos e dejetos, que possa
estar ancoranda e abrigando os microrganismos. A remoo desta camada deixa a superfcie exposta para
a ao dos desinfetantes. Em superfcies de tanques, reatores e reservatrios que podem ser alcanadas,
o uso de jateamento por presso recomendada, por remover melhor as crostas e resduos alm de
economizar a gua de uso e dispensar a fase de escovamento.
Etapa 2: Enxgue
Geralmente realizada com gua purificada, est aos poucos sendo substituda por gua aquecida ou
vapor, j integrando a etapa de sanitizao. importante ressaltar que a qualidade da gua nesta etapa
de extrema importncia.
90
treinamento de todos os colaboradores, dando importncia para tcnicas de higiene e conduo para as
operaes crticas.
A anlise de risco refere-se probabilidade da ocorrncia de determinada falha no processo e sua
severidade, identificando potenciais perigos ou pontos crticos de falhas no processo.
Os pontos crticos relacionados a cada etapa do processo devem ser identificados utilizando as informaes
do produto, processo de fabricao e experincia da equipe.
Os riscos devem ser eliminados ou reduzidos a nveis aceitveis para a segurana do produto. Para cada
risco, a equipe deve listar os fatores responsveis desde seu incio at o agravamento e determinar as
medidas preventivas a serem implementadas.
A identificao das causas de risco na qualidade de um produto tem como ferramenta o diagrama de
causa e efeito (diagrama de Ishikawa) e Pareto.
MATERIAIS
MTODOS
COLABORADORES
EFEITO
EQUIPAMENTOS
MEIO AMBIENTE
MEDIDAS
Mtodo: toda a causa envolvendo o mtodo que estava sendo executado o trabalho;
Material: toda causa que envolve o material que estava sendo utilizado no trabalho;
Mo-de-obra: toda causa que envolve uma atitude do colaborador (ex: procedimento
inadequado, pressa, imprudncia, ato inseguro, etc.)
91
Medida: toda causa que envolve os instrumentos de medida, sua calibrao, a efetividade de
indicadores em mostrar as variaes de resultado, se o acompanhamento est sendo realizado,
se ocorre na frequncia necessria, etc.
Meio ambiente: toda causa que envolve o meio ambiente em si (poluio, calor, poeira, etc.) e, o
ambiente de trabalho (layout, falta de espao, dimensionamento inadequado dos equipamentos,
etc.).
Aps a identificao dos riscos, possvel prioriz-los por meio da avaliao da probabilidade, da
severidade e do potencial de sua deteco, empregando a anlise de modo e efeito de falha (Failure Mode
and Effects Analysis (FMEA)). O resultado conduz ao maior entendimento do processo e desenvolvimento
de estratgias de controle eficaz do risco.
A Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (Hazzard Analysis and Critical Control Points) (HACCP))
baseia-se em um sistema de segurana alimentar porm muitas indstrias de produtos de higiene pessoal,
perfumaria e cosmticos utilizam esta ferramenta pois consiste em analisar as diversas etapas de produo
de um produto, verificando os perigos sade dos consumidores.
O primeiro passo fundamental para o delineamento das aes a serem tomadas. Trata-se da coleta
e anlise de dados gerados pela auditoria da qualidade e pelas anlises do controle microbiolgico.
Isto permite gerar uma ampla discusso sobre as possveis causas dos resultados encontrados fora das
especificaes. Alm disto, facilita determinao do grau de atendimento das boas prticas. Os dados
obtidos, sempre que possvel, devem ser apresentados na forma de grficos e tabelas para a visualizao
de possveis tendncias. Ou seja, em uma anlise microbiolgica da gua purificada, durante trinta dias,
possvel visualizar as tendncias do sistema em relao a sua operacionalidade e a necessidade de
manuteno durante este perodo.
Um outro exemplo a determinao da carga microbiana contaminante de um ambiente, onde haja
exposio dos insumos ou produtos ao ar. Os microrganismos, mesmo sendo retirados do ambiente
diariamente, tornaro a contamin-lo. Portanto, um ponto crtico importante a qualificao do sistema
de filtrao do ar insuflado para o interior destes ambientes. A validao dos mtodos de limpeza e
sanitizao, utilizados nas superfcies das reas, dos equipamentos e utenslios, alm do treinamento
rigoroso do pessoal operacional, da mesma forma exigvel. O passo seguinte a elaborao de um
programa de controle dos pontos crticos de contaminao microbiana. Este programa deve contemplar
o pessoal, produtos qumicos de limpeza e desinfeco, local de trabalho, procedimentos operacionais,
procedimento de amostragem e anlise e demais fatores que influenciam na qualidade do produto final.
Toda a informao obtida at aqui, servir como base para os estudos de validao de limpeza e de
processo. Estes estudos so uma exigncia das boas prticas de fabricao e manipulao adotadas
em todos os pases, tendo por objetivo a comprovao documentada de que um processo ou mtodo
conduza de forma consistente e produtvel aos resultados esperados.
92
9.2
Fator de Risco
Fator Preventivo
Pessoal de Produo
Matria-Prima
Embalagem primria
gua de processo
Ar comprimido
Ar Ambiente
Equipamentos
Utenslios de produo
Utenslios de limpeza
Produtos de Limpeza
93
Tipo de Agente
pH ativo
Limpeza Sobre
Exemplos
gua
ND
gua potvel
gua desmineralizada
PW, WFI
cidos fortes
cido clordrico
cido sulfrico
cido fosfrico
cidos fracos
cido actico
cido ctrico
cidos minerais
moderados
94
0,2 a 5,5
Agentes neutros
5,5 a 8,5
Tensoativos neutros,
incluindo os adjuvantes
(lcool, glicis, etc)
Agentes Alcalinos
8,5 a 12,5
Hidrxido de amnio
Fosfato de sdio
Carbonato de sdio
Alcalinos
corrosivos
12,5 a 14
Hidrxido de sdio
Hidrxido de potssio
Silicato de sdio
Saneante
Ativos Antimicrobianos
Caractersticas de Uso
Clorados
Hipocloritos de Sdio,
Clcio
Clorados
Cloroisocianuratos
de Sdio, Clcio
Perxidos de hidrognio
Solues estabilizadas de
perxidos, geralmente com
35% de ativo
Perxi-cidos
cidos Peracticos
e Peroxiacticos
Alcois
lcool isoproplico
e etlico
Fenlicos
Fenis e derivados
clorados
Compostos de
quaternrio de amnio
Tensoativos catinicos
95
Caractersticas
Linhas de Vapor
gua quente
(aprox. 80C)
96
Grupo de Ativo
Classificao
Exemplos
Aldedos
Esporicida
2% Glutaraldedo*
Alcois
Clorados
Esporicida
Fenlicos
Oznio
Esporicida
8% Gas, em peso
Perxido
de hidrognio
Biguanidas
substitudas
Agente antissptico
cido
Peractico
xido
de Etileno
Compostos de quaternrio
de amnio
- Propionolactona
Esporicida
*H restries quanto ao uso do Glutaraldedo, pela ANVISA, como esterilizante de materiais crticos (Clnicos e Cirrgicos),
principalmente pela resistncia apresentada s espcies resistentes de Micobactria de crescimento rpido.
9.3
A validao de limpeza consiste em realizar um processo de limpeza que garanta a higienizao (Limpeza
e sanitizao) do equipamento.
importante estabelecer que no existe um nico caminho para executar um processo de validao de
limpeza, e que o ponto comum a ser buscado a existncia de critrios, parmetros e metodologias que
sejam cientificamente justificveis e que demonstrem claramente que o procedimento de limpeza produz
resultados que esto de acordo com as especificaes pr-estabelecidas.
Para iniciar o estudo de validao de limpeza, inicia-se com a avaliao do prprio procedimento de
limpeza e assim devemos verificar itens importantes para que se inicie a validao:
a.
b.
O procedimento deve detalhar os pontos crticos do equipamento e a maneira como cada ponto
deste deve ser limpo.
c.
d.
O material utilizado na limpeza deve ser padronizado, o procedimento deve detalhar ou fazer
referncia metodologia de preparao do detergente, estabelecendo sua concentrao de
uso. A concentrao de uso do detergente e sua marca so imutveis aps a validao do
97
procedimento de limpeza, qualquer alterao nesses itens deve ser precedida de avaliao
atravs do controle de mudana, antes que o procedimento seja aplicado na rotina.
e.
O procedimento deve definir por quanto tempo o equipamento pode permanecer sujo, antes
que a limpeza seja executada, pois a efetividade de um procedimento de limpeza inversamente
proporcional ao tempo que o mesmo permanece sujo, pois aumenta consideravelmente sua
dificuldade de limpeza. O tempo deve ser definido e o estudo de validao dever sempre ser
conduzido nesse prazo limite para assegurar que o procedimento eficaz em seu pior caso.
f.
O procedimento deve definir por quanto tempo o equipamento pode permanecer limpo sem
que uma nova limpeza tenha que ser executada.
g.
98
As validaes devero ser realizadas de acordo com o tipo de produto a ser limpo.
O descarte correto dos materiais contaminados no pode afetar diretamente a qualidade dos ensaios.
Devem existir procedimentos para minimizar a possibilidade de contaminao dos materiais ou do
ambiente de ensaio.
Contudo, esta uma questo de boas prticas de laboratrio e deve obedecer aos regulamentos
ambientais ou de sade e segurana.
Aps o uso (cultura de microrganismos ou material em contato com microrganismos), o aparelho ou
materiais e os seus contedos devem ser tratados para a destruio de microrganismos, antes da limpeza
ou descarte qualquer que seja o microrganismo envolvido.
De acordo com a natureza dos materiais, desinfeco, esterilizao ou a incinerao de material descartvel
pode ser utilizado.
10.2 DESCONTAMINAO
Esterilizao por calor seco - A esterilizao por este processo deve ser a forno durante pelo menos 1h,
a 170C a 180C. Pode-se utilizar qualquer outra combinao de tempo e temperatura, se eles forem
validados. Os indicadores podem ser utilizados, a fim de garantir que foi conseguida a esterilizao.
Esterilizao por calor mido - A esterilizao por este processo deve ser de no mnimo 121C por pelo
menos 15 minutos, numa autoclave. Os indicadores podem ser utilizados, a fim de garantir que foi
conseguida a esterilizao.
Esterilizao por filtrao - esterilizao por filtrao pode ser realizada sob vcuo ou em condies
pressurizadas. Use membranas estreis e elementos de filtros com poros de dimetro de 0,22 g (alguns
casos podem ser utilizados o de 0,45 g). Esterilizar os diferentes componentes do aparelho de filtrao,
montado ou no, na autoclave durante 15 minutos a 121C. A montagem assptica deve ser efetuada
numa cmara de microbiolgica aps a autoclavagem.
A incinerao um tratamento aplicando o processo de combusto controlada, em altas temperaturas,
permitindo com isso a reduo do volume e massa dos resduos. Os resduos so transformados em gases,
calor e materiais inertes.
99
Utilizar luvas e vesturio protetor, incluindo, se necessrio, proteo para a face e os olhos.
2.
Para no deixar espalhar, cobrir o derrame com toalhas de papel e soluo desinfetante. Deixar
100
11 CONSIDERAES FINAIS
Encerrando esta nossa pequena viagem pela microbiologia do presente Guia: Controle Microbiolgico
na Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos, foram abordados os aspectos atuais da
microbiologia, de forma prtica e simples, com pinceladas do conhecimento e experincia dos autores,
e fica ainda uma questo por ser desvendada: E agora? Para onde seguimos?
As tcnicas microbiolgicas evoluram desde a poca de Robert Koch, em 1884, que foi o pioneiro no
cultivo de microrganismos. De l para c, a microbiologia tratada ainda baseada no cultivo, contagem,
isolamento e identificao. Esta forma de anlise ainda est muito presente nos mtodos atuais, normas e
leis, nossos principais alicerces para definir metodologias e parmetros microbiolgicos a serem adotados
ou seguidos.
Por outro lado, inquestionvel o avano da cincia, especialmente na informatizao e melhoramento
dos equipamentos.
At pouco tempo atrs, nem as placas de Petri eram descartveis. Hoje, por questes de riscos sade,
e principalmente para fazer melhor uso da mo-de-obra, as placas descartveis vieram para ficar, e junto
com elas, tubos, pipetas, alas, etc. As placas tambm se miniaturizaram e formas diferentes de pensar a
microbiologia vm surgindo muito rapidamente.
Mtodos microbiolgicos rpidos ou facilitados, totalmente automatizados ou semi-automatizados
esto a cada dia mais prximos, factveis e, financeiramente mais acessveis fazendo uso do crescimento
microbiano, ou de sua presena, anlise genmica, resposta qumica ou fsico-qumica, para citar alguns.
Acreditamos que nos prximos anos, os mtodos microbiolgicos j estejam modificados, de forma a
atingir os maiores anseios dos cientistas e do prprio corpo tcnico: repostas rpidas, confiveis e eficazes
sempre visando a segurana do consumidor.
101
12 GLOSSRIO
gar: Hidrocolide extrado de diversos gneros e espcies de algas marinhas vermelhas. Consistem
de agarose e agaropectina e so usados como meio de cultura para o crescimento microbiolgico
(Bactrias e fungos).
gua desmineralizada: gua que tem todos os sais minerais removidos por um sistema de resinas de
troca inicas.
Amostragem: a tcnica para obter uma amostra (parte) de um lote de um produto.
Antissptico: Substncias e produtos destinados a higienizao, desinfeco, aes com finalidade de
destruir e inibir a multiplicao e proliferao de microrganismos patognicos. Usualmente est associado
com substncias aplicadas na superfcie da pele e mucosas.
Atividade da gua: a relao do vapor de presso de um produto comparado ao vapor de presso
da gua pura. Esta relao utilizada para avaliar a susceptibilidade de uma matria-prima ou produto
contaminao microbiolgica.
Calibrao: Conjunto de operaes que estabelecem, sob condies especificadas, a relao entre os
valores indicados por um instrumento (calibrador) ou sistema de medio e os valores representados
por uma medida materializada ou um material de referncia, ou os correspondentes das grandezas
estabelecidas por padres.
Cepa: Microrganismo puro, que d origem a microrganismos similares.
Colnia: Crescimento visvel, macroscpico, de microrganismo em meio de cultura slido. Relacionado a
Unidade Formadoras de Colnias (UFC).
Concentrao Inibitria Mnima: Menor concentrao de um ativo necessrio para inibir o crescimento
de um determinado microrganismo.
Conservante: Agente qumico que previne o crescimento microbiolgico.
Esporos: Microrganismos em estado dormente, adaptados a sobreviver em condies ambientais
adversas.
102
Esterilizao: Eliminao e destruio da vida microbiolgica destes materiais. Para ser esterilizada
necessrio que seja submetida ao calor durante um determinado tempo, destruindo todas as bactrias,
seus esporos e fungos. Existem vrias tcnicas de esterilizao, que apresentam vantagens e desvantagens;
contudo, a tcnica usada mais regularmente a autoclavagem.
Gram-negativa: Bactria que retm a cor vermelha depois de usar o procedimento de Colorao de
Gram.
Gram-positiva: Bactria que retm a cor violeta depois de usar o procedimento de Colorao de Gram.
Meio de Cultura: Nutriente contendo gar lquido ou slido que permite o crescimento de microrganismos.
Qualificao: Conjunto de aes realizadas para estabelecer evidncias documentadas confiveis de que
um processo qualquer, executado em conformidade com especificaes pr-determinadas e com os
requisitos da Qualidade.
Rastreabilidade: um processo que permite a identificao e reproduo de todas as etapas da fabricao
de um produto, apresentando todos os documentos referentes aos processos de fabricao, limpeza e
anlises estarem registrados, documentados e arquivados.
Swab: Zaragatoa para coletar microrganismos em uma superfcie (bancadas e equipamentos) e transferilos para uma placa onde ser feita a anlise microbiolgica.
Validao: Ao conduzida para estabelecer e demonstrar que um processo, procedimento, instrumento,
aparato ou equipamento/material conduz necessria e efetivamente ao objetivo requerido.
103
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