Di pertengahan abad ke-19, Gregor Mendel merumuskan aturan untuk menjelaskan

pewarisan karakteristik biologi.

Asumsi dasarnya adalah bahwa setiap properti diwariskan dari suatu organisme
dikendalikan oleh faktor, yang disebut gen, yang merupakan partikel fisik hadir di suatu
tempat di dalam sel.
Gagasan bahwa gen berada pada kromosom diusulkan oleh W. Sutton pada tahun 1903
Morgan dan rekan-rekannya mengembangkan teknik untuk pemetaan gen, dan 1922
menghasilkan analisis yang komprehensif dari posisi relatif lebih dari 2000 gen pada 4
kromosom dari buah fl y, Drosophila melanogaster
Meskipun kecemerlangan studi genetika klasik, tidak ada pemahaman yang benar
tentang sifat molekul gen sampai tahun 1940-an.
Penemuan peran DNA adalah stimulus yang luar biasa untuk penelitian genetik, dan
banyak ahli biologi yang terkenal (Delbrck, Chargaff, Crick, dan Monod di antara paling
berpengaruh) berkontribusi usia besar kedua genetika
Kemudian pada tahun 1971-1973 penelitian genetik dilemparkan kembali ke gigi dengan
apa pada saat itu digambarkan sebagai sebuah revolusi dalam biologi eksperimental
Metode ini, disebut sebagai teknologi rekombinan DNA atau rekayasa genetika, dan
memiliki pada intinya proses kloning gen, memicu usia besar lain genetika.
Pemurnian DNA dari Sel Hidup
nsinyur genetik akan, pada waktu yang berbeda, perlu menyiapkan setidaknya tiga jenis
yang berbeda dari DNA:
DNA total sel
DNA plasmid murni
fag DNA
DNA total sel
akan sering diperlukan sebagai sumber bahan dari mana untuk mendapatkan gen yang
akan dikloning.
mungkin DNA dari budaya bakteri, dari tanaman, dari sel-sel hewan, atau dari jenis lain
dari organisme yang sedang dipelajari
Ini terdiri dari DNA genom dari organisme bersama dengan molekul DNA tambahan,
seperti plasmid, yang hadir
DNA plasmid murni
Persiapan DNA plasmid dari budaya bakteri berikut langkah-langkah dasar yang sama
seperti pemurnian total DNA sel, dengan perbedaan penting bahwa pada tahap tertentu
DNA plasmid harus dipisahkan dari sebagian besar utama DNA kromosom juga hadir
dalam sel
fag DNA
akan diperlukan jika vektor fag kloning akan digunakan

Fag DNA umumnya dibuat dari partikel bakteriofag bukan dari sel yang terinfeksi,
sehingga tidak ada masalah dengan mencemari DNA bakteri

Persiapan total DNA sel

rosedur total persiapan DNA dari kultur sel-sel bakteri dapat dibagi menjadi empat tahap
(Gambar 3.1.):
Sebuah kultur bakteri tumbuh dan kemudian dipanen.
Sel-sel yang rusak terbuka untuk melepaskan isinya.
ekstrak sel ini diperlakukan untuk menghapus semua komponen kecuali DNA.
Solusi DNA yang dihasilkan terkonsentrasi.
pembuatan ekstrak sel
Sel bakteri tertutup dalam membran sitoplasma dan dikelilingi oleh dinding sel yang
kaku.
Semua hambatan ini harus terganggu untuk melepaskan komponen sel.
Teknik untuk melanggar sel bakteri terbuka dibagi menjadi metode fisik, di mana sel-sel
terganggu oleh kekuatan mekanik, dan metode kimia, di mana lisis sel dibawa oleh
paparan bahan kimia yang mempengaruhi integritas hambatan sel
Kimia lisis umumnya melibatkan satu agen menyerang dinding sel dan lain mengganggu
membran sel (Gambar 3.4a).
melemahnya dinding sel biasanya dibawa oleh lisozim, etilendiamin tetraacetate (EDTA),
atau kombinasi keduanya.
Lisozim adalah enzim yang mencerna senyawa polimer yang memberikan sel dinding
kekakuan
EDTA menghilangkan ion magnesium yang penting untuk pra melayani keseluruhan
struktur amplop sel, dan juga menghambat enzim seluler yang bisa mendegradasi DNA
enzim adalah protein
reaksi biokimia membantu mendorong katalis biologis
Nama-nama enzim berakhir dengan ase (misalnya., endonuklease)
Bakteri telah berevolusi kelas enzim yang merusak DNA asing (misalnya. DNA Virus).
melindungi bakteri dari bakteriofag (Virus).
Bakteriofag tidak dapat berkembang biak jika DNA mereka dihancurkan oleh tuan rumah.
endonuklease restriksi MEMBATASI virus
Viral genom hancur saat masuk
Endonuklease restriksi = enzim restriksi
Endo (di dalam), nuklease (pemotongan asam nukleat): enzim yang membelah
fosfodiester dalam rantai polinukleotida seperti DNA
Endonuklease restriksi mengakui urutan DNA pendek dan spesifik dan memotong dari
dalam.
Urutan DNA spesifik disebut pengakuan situs urut / pembatasan

Manipulasi DNA dimurnikan

Setelah sampel murni DNA disusun, langkah berikutnya dalam kloning gen adalah
pembangunan molekul DNA rekombinan
Untuk menghasilkan DNA rekombinan, vektor dan DNA yang akan dikloning, harus
dipotong dan kemudian bergabung bersama-sama
Gen kloning mengharuskan molekul DNA dipotong dengan cara yang sangat tepat dan
direproduksi
Pemotongan dan bergabung manipulasi yang mendasari kloning gen dilakukan oleh
enzim yang disebut pembatasan endonuklease (untuk memotong) dan ligases (untuk
bergabung)
Gel elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk pemisahan (DNA), (RNA), atau
molekul protein menggunakan arus listrik diterapkan untuk matriks gel
Biasanya digunakan di:
- Tujuan analisis (seringkali setelah amplifikasi DNA melalui PCR)
- Teknik preparatif sebelum menggunakan metode lain seperti spektrometri massa, RFLP,
PCR, Kloning, sekuensing DNA, atau Southern blotting untuk karakterisasi lebih lanjut.
SDS (Sodium dodesil sulfat) adalah deterjen yang digunakan untuk memecah protein dan
memberi mereka muatan negatif
HALAMAN: Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Ini adalah teknik untuk memisahkan protein dengan berat molekul mereka

Mengapa kita perlu denaturasi protein

Karena kita mencoba untuk memisahkan banyak molekul protein yang berbeda dari
berbagai bentuk dan ukuran, pertama kita ingin mendapatkan mereka untuk menjadi
linear sehingga protein tidak lagi memiliki struktur sekunder, tersier atau kuaterner, kita
menggunakan SDS (sodium dodesil sulfat)
SDS dapat memecah daerah hidrofobik dan mantel protein dengan banyak tuduhan
negatif yang menguasai setiap muatan positif dalam protein karena bermuatan positif Rkelompok. protein yang dihasilkan telah didenaturasi dengan SDS (dikurangi menjadi
struktur utama) dan sebagai hasilnya telah lenearized
SDS adalah deterjen (sabun) yang dapat melarutkan molekul hidrofobik tetapi juga
memiliki muatan negatif (sulfat) yang melekat padanya. Oleh karena itu, jika sel
diinkubasi dengan SDS, membran akan dibubarkan dan protein akan soluablized oleh
deterjen, ditambah semua protein akan ditutupi dengan banyak tuduhan negatif.
Hasil akhirnya memiliki dua fitur penting:
semua protein hanya berisi struktur primer
semua protein memiliki muatan negatif yang besar yang berarti mereka semua akan
bermigrasi ke arah kutub positve ketika ditempatkan dalam medan listrik.

Jika protein terdenaturasi dan dimasukkan ke dalam medan listrik, mereka semua akan
bergerak menuju kutub positif pada tingkat yang sama. Jadi kita perlu menempatkan protein
menjadi lingkungan yang akan memungkinkan protein ukuran yang berbeda untuk bergerak
pada tingkat yang berbeda Lingkungan pilihan adalah poliakrilamida, yang merupakan
polimer dari monomer akrilamida Ketika polimer ini terbentuk, itu berubah menjadi gel dan
kami akan menggunakan listrik untuk menarik protein melalui gel sehingga seluruh proses
calledpolyacrylamide elektroforesis gel (PAGE).
endonuklease restriksi MEMBATASI virus
Viral genom hancur saat masuk
Endonuklease restriksi = enzim restriksi
Endo (di dalam), nuklease (pemotongan asam nukleat): enzim yang membelah
fosfodiester dalam rantai polinukleotida seperti DNA
Endonuklease restriksi mengakui urutan DNA pendek dan spesifik dan
memotong dari dalam.
Urutan DNA spesifik disebut pengakuan situs urut / pembatasan
Berguna sifat plasmid sebagai vektor kloning:
Ukuran kecil
asal independen dari replikasi
jumlah copy beberapa
Kehadiran penanda terseleksi
Penggunaan plasmid di kloning:
kalikan (membuat banyak salinan)
mengekspresikan gen tertentu
untuk membuat sejumlah besar protein
Namun, plasmid hanya dapat berisi sisipan dari sekitar 1-10 kbp