Mtodos en biociencias

2 .3 . Tcnicas de separacin

y purificacin de protenas
A pesar de las constantes mejoras en la instrumentacin analtica utilizada en el anlisis de proteinas,
el conjunto total de protenas que constituye un
proteoma celular tpico resulta demasiado complejo para ser analizado d irectamente. Por ello, es
habitual recurrir al fraccionamiento de la muestra
para:
-

Reducir su complejidad e incrementar el

nmero de protenas identificadas.
Enriquecer o favorecer la deteccin de
aquellas proteinas de inters o presentes
en menor cantidad.

Los mtodos de fraccionam iento permiten subdividir Ja complejidad del proteoma que se pretende
analizar con el objetivo de alcanzar una mayor cobertura mediante e l estudio de las fracciones
obtenidas. Los procesos de fraccionamiento pueden
realizarse a nivel de protenas o pptidos, o combinarse (fraccionamiento multidimensional).
Las muestras pueden ser fracc ionadas usando
diferentes mtodos de fracc ionamiento a diferentes
niveles y /o basndose en diferentes propiedades:
(i) s u localizacin en el mater ial biolgico de partida
(subfraccionamiento celular); (ii) las propiedades
fsico-qum icas de sus componentes proteicos (solubilidad, filtracin, ultracentrifugaci n); (ii i) sus
propiedades electroforticas (SDS-PAGE, 2D-PAGE,
etc.); o (iv) sus propiedades cromatogrficas (exclusin molecular, cromatografa de afinidad,
cromatografa lquida ...)
2 .3 .1 . Subfraccionamiento

celular

Uno de los mtodos clsicos de fraccionamiento a

partir de extractos celulares es el fraccionamiento subcelular (ver epgrafe 1.4). Este consiste en el
aislamiento y caracterizacin de los diferentes orgnulos q ue componen la clula. Este mtodo tiene dos
grandes ventajas: por un lado, la complejidad del proteoma de un orgnulo es considerablemente inferior
al de la clula completa y, por otro, la caracterizacin
del proteoma del orgnulo permite determinar la lo
calizacin subcelular de las protenas.
El fraccionamiento de orgnulos implica la
utilizacin de un protocolo de lisis celular que perm ita mantener la integridad fsica de Jos diferentes
componentes subcelulares de inters y su posterior
separacin mediante aproximaciones clsicas,
como pueden ser (Figura 2.7):

La centrifu9ac6n dferencal (ver apartado 1.4.2),

basada en la aplicacin de centrifugaciones se
cue111ciales a partir de un homogeneizado celular
o tisular, permite obtener diferentes orgnulos en
distintas fracciones subcelulares: nuclear, mitocondrial, microsomal y soluble (Figura 2.7a). La
separacin de los diferentes orgnulos depende de
la diferente velocidad de sedimentacin de las partculas en suspensin en funcin de su tamao y su
densidad. La principal desventaja de este mtodo es
su baja resolucin, dando lugar al solapamiento de
fracciones y generando mezclas de diferentes orgnulos con velocidades de sedimentacin parecidas.
La centrifugacin en gradente de densdad sopcnca
(ver apartado 1.4.2.) es el mtodo ms eficiente en la
separacin de componentes subcelulares. Se basa en
la separacin de orgnulos en funcin de su densidad
de flotacin (Figura 2.7b). La muestra se dispone en
un gradiente de densidad que contiene una concentracin muy elevada de sacarosa o de CsCI. Durante la
centrifugacin cada orgnulo se desplaza hasta que
su densidad iguala la del medio circundante (punto
de flotabUdad neutra o isopcnica).
El fraccionamiento dferencal medante detergentes
es una alternativa a los mtodos de fraccionamien
to basados en centrifugaciones seriadas. Consiste
en el empleo de tampones con diferentes detergen
tes cuyas ventajas son reducir las contaminaciones
de otros orgnulos y el tiempo de fraccionamien
to empleado en las centrifugaciones seriadas. Es un
mtodo sencillo, capaz de fracciona r protenas de
acue rdo a cuatro localizaciones subcelulares: citllsol, membrana celular/orgnulos, soluble-nuclear
y citoesqueleto (Figura. 2.7c). Este mtodo esw
dis ponible en formato comercial (ProteoExtrad
subcellular proteome extracton kit, CalbioChem)
La purftcacn de orgnulos por mtodos de nmL
noafindad permite la obtencin de fracciones de
manera muy especfica. Este mtodo se basa en
unin entre anticuerpos especficos inmovilizados en un soporte slido y los orgnulos de inters
(Figura 2.7d). Existen modificaciones para el tipo
de ligando, y se han utilizado tambin ligandos qu
micos, pptidos, aptmeros, etc. Sus principales
limitaciones estn relacionadas con el a lto coste
de los a nticuerpos empleados y el incremento d
tiempo de purificacin.

2.3.2 . Tcnicas electrofortcas

Las tcnicas electroforticas son herramientas a
plia mente utilizadas para la separacin, aislamie'1