Anda di halaman 1dari 5

PRODUKSI REKOMBINAN PROTEIN VIRUS JEMBRANA (J Gag 6)

UNTUK ANTIGEN ELISA.


(The Production of Jembrana Virus Recombinant Protein for Elisa Antigen(J Gag 6)
Ni Luh Putu Agustini dan Nining Hartaningsih
Balai Penyidikan dan Pengujian Veteriner, Regional VI, Denpasar

ABSTRAK
Uji Elisa untuk mendeteksi antibodi Jembrana pada sapi yang terinfeksi Jembrana Disease (JD) telah
dikembangkan sejak tahun 1993. Sampai tahun 2001, uji ini masih menggunakan antigen sucrose (N 90)
yang dibuat dari whole Jembrana virus, yang dalam produksinya selalu membutuhkan hewan donor (sapi
Bali) dan ultracentrifuge. Sebagai alternatif dari proses produksi antigen N90 yang mahal tersebut,
diupayakan pembuatan antigen dengan teknik rekombinan protein. Sejak tahun 2003, teknik pembuatan
antigen J Gag 6 telah berhasil dilakukan di Laboratorium Bioteknologi, BPPV, Regional VI, Denpasar
dan digunakan untuk antigen Elisa. Produksi rekombinan protein ini bertujuan untuk mendapatkan
antigen baru sebagai pengganti dari sucrose antigen untuk menghasilkan diagnose yang cepat dan akurat.
Dalam proses produksi antigen J Gag 6, potongan gen virus Jembrana dimasukkan ke dalam plasmid,
kemudian rekombinan plasmid ditransfeksikan ke dalam E. coli dan selanjutnya dilakukan produksi
protein yang diperbanyak dalam media 2 YT. Hasil perbanyakan tersebut kemudian disonikasi dan
dilisiskan untuk mengeluarkan kembali potongan virus yang sebelumnya dimasukkan, selanjutnya
dilakukan purifikasi dengan menggunakan soflink avidin resin untuk mendapatkan antigen yang murni.
Sebelum digunakan sebagai antigen Elisa dan Western Blotting, dilakukan kuantifikasi untuk
mendapatkan volume pengenceran yang harus dilakukan.
Kata kunci : virus Jembrana, protein rekombinan, antigen Elisa

ABSTRACT
The Elisa to detecs Jembrana disease antibodies in infected cattle has been developed since 1993. Until
2001 the sucrose antigen still be used for the Elisa test. It was produced from the whole Jembrana virus.
The production of the antigen requires Bali cattle and ultracentrifugation technique. Since 2003 new
recombinant capsid protein (J Gag 6) has been succsessfully produced by the Biotechnology Laboratory
of BPPV (DIC) and now being used as an Elisa antigen in DIC Denpasar. The aim of the antigen
production is to get a new that can replace the sucrose antigen, hopely it will give a quicker and more
accurate diagnose. The production of J Gag 6 antigen have been done by inserting JDV genes into
plasmid. The recombinant plasmid was then transfected into E. coli and protein produced in E. coli. using
was multiplied 2 YT media. Biotinylated protein was purified using a soflink avidin resin. The successfull
production of the antigen can be identified by using streptavidin conjugated to alkaline phosphatase.
Successfully of the production the antigen showed by was found the same molecular weigh protein with J
Gag 6 control. Before used as an antigen, the protein must be quantified in order to know the antigen
dilution for Elisa and Western Blotting.
Keywords : Jembrana virus, recombinant protein, Elisa antigen

PENDAHULUAN
Penyakit Jembrana merupakan penyakit
viral yang bersifat akut dan kadang fatal
pada sapi Bali. Selain diprovinsi Bali,
kasus JD dilaporkan telah terjadi
dibeberapa daerah di Indonesia seperti :
Lampung, Bengkulu, Sumatera Barat,

Sumatera Selatan, Kalimantan Selatan,


dan Kalimantan Timur.(Hartaningsih ,
2005).
Dalam mendiagnosa penyakit Jembrana,
beberapa
macam
uji
telah
dikembangkan. Salah satunya adalah uji
serologis
Elisa
yang
telah

dikembangkan sejak tahun 1993. Dalam


uji Elisa, antigen merupakan salah satu
faktor penting yang harus ada karena
prinsip dasar dari uji Elisa adalah ikatan
antara antigen dengan antibodi yang
homolog. Sampai tahun 2001, antigen
sucrose (N 90) masih dipergunakan
untuk uji Elisa. Produksi dari antigen ini
masih menggunakan seluruh virus
Jembrana dan dalam proses produksinya
tidak bisa terlepas dari penggunaan sapi
Bali sebagai hewan donor dan alat ultra
sentrifugasi sehingga biaya produksi
antigen tersebut menjadi sangat mahal.
Virus Penyakit Jembrana (JDV)
merupakan satu molekul rantai tunggal
yang terdiri atas 7732 basa nukleotida.
Selain mengandung gen yang umum
pada Retrovirus seperti : gen gag, pol,
envelope, dan long terminal repeat
(LTR) , JDV juga memiliki gen
tambahan yaitu : gen tat dan rev, yang
khas pada lentivirus. Protein capsid
(CA) yang disintesis oleh gen gag
subunit capsid (gag-ca) dan protein
transmembrane yang disintesis oleh gen
env subunit Transmembran(env-tm) dari
JDV ternyata bereaksi positif dengan
antibodi hewan yang terinfeksi JDV.
Karena itu kedua protein ini dianggap
epitop yang bersifat immunogenik
(Hartaningsih, 1994).
Sejalan dengan perkembangan teknologi
dan ilmu pengetahuan, produksi antigen
Jembrana saat ini sudah bisa dilakukan
dengan teknik rekayasa genetika
(recombinant protein). Dengan teknik
ini, antigen JD diproduksi hanya dari
bagian Gag saja. Teknik rekombinan
untuk antigen JD ini awalnya
dikembangkan di Murdoch University,
Perth, Western Australia (Moira
Desport, personal communication). Pada
tahun 2002, teknik ini berhasil diadopsi
dan mulai tahun 2003 diaplikasikan di
Laboratorium Bioteknologi, BPPV,
Regional VI, Denpasar. Pengembangan

teknik rekombinan
protein
pada
Eschericia coli telah dilakukan di
Australia (Burkala et al., 1996)
sedangkan pengembangan rekombinan
protein untuk uji serologis infeksi
lentivirus pada hewan dikembangkan di
Italia (Rosati et al., 2004). Saat ini
pengembangan
produksi
protein
rekombinan juga dilakukan di Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),
Cibinong. Pengembangan produksi
antigen JD dengan teknik rekombinan
protein masih terus dilakukan dalam
proyek kerjasama pemerintah Indonesia
dan Australia (ACIAR project) untuk
mendapatkan antigen yang betul-betul
spesifik untuk mendeteksi antibodi
Jembrana.
Keunggulan dari produksi antigen
dengan teknik rekombinan antara lain
tidak dibutuhkan hewan donor (sapi
Bali) dan alat ultra sentrifuge serta
proses produksinya lebih cepat sehingga
biaya produksi menjadi lebih murah
dibandingkan
dengan
antigen
sucrosa/N90.
Produksi
antigen
dengan
teknik
rekombinan
ini
bertujuan
untuk
menghasilkan antigen baru sebagai
pengganti antigen yang lama (antigen
sucrose/N90) sehingga bisa dilakukan
diagnosa secara cepat, tepat, dan akurat.

MATERI DAN METODE


Construct Protein
Construct protein adalah potongan gen
virus Jembrana yang telah dimasukkan
dengan Pin Point System Promega.
Proses pembuatan construct protein ini
dilakukan di Australia. Protein yang
akan diperbanyak disimpan dalam
glycerol stock dan untuk produksinya
dilakukan perbanyakan pada media 2
YT.

Kontrol Positif
Kontrol positif yang dipergunakan
adalah antigen J Gag 6 yang telah
standar, yang diproduksi oleh Murdoch
University dan dengan konsentrasi 150
ug/ml
Proses Produksi Protein Recombinant
Dengan Sistem PinPoint
1. Siapkan 1 liter media 2 x YT dan
tambahkan 100 l biotin stock
(20mM) dan 1 ml Ampicillin stock
(100mg/ml)
2. Inokulasikan biakan JGag6 dalam
glycerol stock pada 10 ml media 2
YT dan tumbuhkan pada suhu 370C
dengan cara dikocok 225 rpm
semalam.
3. Perbanyak biakan di atas dengan cara
menumbuhkan kembali pada 200 ml
media 2 x YT yang mengandung
biotin dan ampicillin dan dikocok
kembali 225 rpm pada suhu 370C
selama 1-2 jam.
4. Bila media sudah terlihat keruh,
tambahkan 200l IPTG stock untuk
merangsang ekspresi protein dan
dikocok selama 3-4 jam
5. Sentrifugasi hasil biakan dengan
kecepatan 8000 rpm selama 15 menit
pada suhu
40C sampai terbentuk
pellet, kemudian pelletnya diambil.
6. Larutkan pellet dengan 3 ml cold
lysis buffer di atas es. Pellet yang
telah dilarutkan ini dapat disimpan
pada suhu -200C .
7. Keluarkan
pellet
yang
telah
dilarutkan dan hancurkan pellet
tersebut dengan disonikasi melalui
proses sebagai berikut : pellet
dimasukkan ke dalam 30 ml yellow
top tubes yang diletakkan dalam

kotak berisi es dan disonikasi selama


4 x 30 detik.
8. Bagi larutan antigen hasil sonikasi
menjadi alliquot dalam tabung
Effendorf dan Sentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 G pada suhu 4 0 C
selama 15 menit.
9. Simpan supernatannya pada suhu -20
0
C. Antigen siap dimurnikan
(dipurifikasi).

Pemurnian
Antigen
Dengan
Menggunakan Softlink Avidin Resin
1. Bila Resin baru dipergunakan untuk
pertama kali maka resin harus di
preabsorb dengan 5 mM biotin dalam
lysis
buffer.
Caranya
adalah
tambahkan 2 ml biotin lysis buffer ke
dalam 1 ml resin dan dibiarkan
selama 30 menit.
2. Cuci dengan 8 ml 10 % acetic acid
untuk setiap 1 ml resin selama 10
menit.
3. Cuci dengan 8 ml phosphate buffer
pH 7,0 selama 10 menit. Kontrol pH
larutan
dan
biarkan
resin
mengembang selama 30 menit.
4. Untuk 200 ml biakan awal, gunakan
0,33 ml resin dan equilibrate dengan
3 ml lysis buffer di atas es selama 15
menit.
5. Biarkan resin mengendap atau bisa
juga diendapkan dengan Sentrifugasi
500 rpm selama 5 menit.
6. Buang buffer dan ganti dengan
supernatan hasil sonikasi dan
inkubasi sambil dirocking pada suhu
4 0 C selama 2 jam.

7. Cuci resin 3 kali dengan lysis buffer


dingin dengan lama pencucian
masing-masing 10 menit.

HASIL
Hasil produksi protein diketahui dengan
menganalisis protein dengan uji Western
Blotting dengan menggunakan conjugate
streptavidin
alkalin
phosphatase.
Keberhasilan
produksi
protein
ditunjukkan dengan munculnya band
protein dengan berat molekul yang sama
dengan berat molekul kontrol protein J
Gag 6 . Untuk mendapatkan protein yang
murni, perlu dilakukan proses purifikasi
dengan menggunakan softlink avidin
resin. Murninya protein yang dihasilkan
ditunjukkan oleh adanya hanya satu band
protein yang mempunyai berat molekul
yang sama dengan protein kontrol (J Gag
6 = 39,5 kDa)
pada uji Western
Blotting seperti terlihat pada gambar
berikut ini (Gambar 1).

8. Elute
biotinylated
recombinant
protein dalam 0,66 ml lysis buffer
yang mengandung 5 mM Biotin
semalam pada suhu 40 C.
9. Ambil supernatannya dan regenerasi
resin dengan acetic acid dan
phosphate buffer untuk selanjutnya
disimpan pada suhu 40C.

10 11

Gambar 1. Western Blotting Antigen J Gag 6


Keterangan :
1. J Gag 6 glycerol stok
2.Crude protein
3.Hasil sonikasi
4.Washing elution 1
5.Washing elution 2
6.Washing elution 3
7. Kontrol J Gag 6
8. J Gag 6 hasil produksi
9. Washing resin solution 1
10.Washing resin solution 2
11. Marker protein

KESIMPULAN
Munculnya satu band protein dengan
berat molekul yang sama dengan kontrol
J Gag 6 (39,5 kDa) pada uji SDS-PAGE
/WB menunjukkan bahwa protein JGag
6 dari glycerol stok (construct) sudah
berhasil diproduksi dan antigen yang
dihasilkan sudah murni.

SARAN
Untuk bisa dipergunakan sebagai antigen
untuk uji Elisa dan Western Blotting,
maka protein yang dihasilkan tersebut
perlu distandarkan atau diquantifikasi
sehingga
didapatkan
pengenceran
antigen yang tepat .

DAFTAR PUSTAKA
Narayani, B.E., and G.E. Wilcox . 1996.
Expression of Recombinant Jembrana
Disease Virus Env Protein in Eschericia
coli, Jembrana Disease and The Bovine
Lentiviruses. ACIAR Proceedings No. 75,
: 150-151.

Endang Tri Margawati, 2003. Protein


Rekombinan
Capsid
Dan
Sistem
Produksinya. Materi Pelatihan Produksi
Protein Rekombinan Dari Virus Penyakit
Jembrana
(JDV). Pusat Penelitian
Bioteknologi LIPI Cibinong.
Hartaningsih N., Wilcox G.E., Kertayadnya G.,
and Astawa N. 1994. Antibody response
to Jembrana Disease Virus in Bali cattle.
Veterinary Microbiology, 39 : 15-23.
Hartaningsih , N, Agustini, NLP, Moira Desport,
2002. Pembuatan Rekombinan Elisa
Antigen (J Gag 6). Manual Diagnosa
Laboratorik Penyakit Jembrana, Hal. 117
119.
Shcultz J, and Breitlow S, 2002. A one-step,
nondenaturing purification method for
recombinant protein in E. coli.
http://www.promega.com/pnotes/42/pinpp
nt/Pinppnt.html.
Rosati S., Profiti M., Lorenzetti R., Bandecchi
P., Mannelli A., Ortoffi M., Tolari F., and
Ciabatti I.M., 2004. Development of
Recombinant
Capsid
antigen/Transmembrane epitope Fusion
Proteins for Serological Diagnosis of
Animal Lentivirus Infection. Journal of
Virological Methods, 121 : 73-78.