*ICS: Corticosteroide inhalado, *CMB: Concentracin mnima bactericida, *EBC: Aire

exhalado condensado

Pacientes y mtodos
Los pacientes
Noventa y un asmticos se inscribieron en el estudio de la siguiente manera: 22 sujetos
con esteroides ingenuo, asma alrgica leve (21 mujeres, 1 hombre; una edad media de
29 aos; oscilar 19-52 aos), 35 sujetos con el establo, De leve a moderada,
corticosteroides inhalados (ICS) tratados con alrgica el asma (20 mujeres, 15 hombres
con una edad media 42 aos, rango 18-73 aos) y 34 sujetos con alergia grave,
inestable, ICS-tratados el asma (10 mujeres, 24 hombres con una edad media 49 aos,
rango 25-74 aos). El asma se diagnostic de acuerdo con los criterios recomendados
por GINA 2002 [19]. Los pacientes con exacerbacin de asma,
que se define a continuacin, fueron excluidos del estudio. Los pacientes con cualquier
otra enfermedad respiratoria o cualquier maligna concomitante, Tambin se excluyeron
del corazn, renales, hepticas o enfermedad del colgeno. Exacerbacin del asma se
defini como una intensificacin de la clnica sntomas, una disminucin en los valores
espiromtricos y un aumento en el consumo de medicamentos de rescate. Estos
cambios requieren la intensificacin del tratamiento antiinflamatorio (aumento en la
dosis y / o la adicin de corticosteroides orales) esteroide inhalado y, si la infeccin de
las vas respiratorias se confirm, se sigue la terapia con antibiticos. La infeccin se
descart basado en la historia del paciente y el examen clnico, as como la medicin
del CMB. Los pacientes que haban tenido infecciones del tracto respiratorio en el mes
antes del estudio fueron excluidos de este programa.
Los asmticos libres de esteroides no haban sido tratados con ICS durante los 3 meses
anteriores. La mayora de los pacientes en que grupo eran sujetos con asma
recientemente diagnosticada, tratada nunca. Estaban libres de exacerbaciones agudas
de las vas respiratorias y infecciones durante los 3 meses previos al estudio. Los
pacientes con estable, de leve a moderada de asma haban sido tratados con baja
dosis de ICS en una dosis constante durante al menos 3 meses. El asma estable se
defini como una necesidad mnima de medicamentos de rescate (De accin corta 2agonistas), sin exacerbaciones y sin uso de esteroides sistmicos en los 12 meses
anteriores. Los pacientes con severa, asma inestable haba requerido una o ms
hospitalizaciones
para el asma y ms de tres rfagas de esteroides orales en el ao anterior. Ellos haban
estado tomando altas dosis de ICS y longacting 2-agonistas de al menos 6 meses.
Todos los pacientes eran atpica y sensibilizados a los alrgenos inhalados comunes,
tal como se evalu puncionando la piel.
Un total de 19 sujetos sanos (14 mujeres, 5 hombres, con una media de 32 aos aos;
rango 19-51 aos) participaron en el estudio como control grupo. Ellos estaban libres
de infeccin del tracto respiratorio dentro de 3 meses antes del estudio y de otras
enfermedades importantes sabe que afectan a las mediciones de ENO F. Los pacientes
de asma y voluntarios sanos fueron los no fumadores que en el anterior ao no haba
sido fumadores pasivos. Todos los pacientes y voluntarios sanos fueron examinados por
un mdico y luego se someti a coleccin EBC, la medicin F ENO y espirometra. Se
recogieron muestras de sangre para determinar
IgE srica total, el ECP y el recuento de eosinfilos en sangre.

El protocolo de estudio fue aprobado por el Comit de Investigacin de tica de la

Universidad de Medicina de Bialystok (nmero de acuerdo: R-I-002/139/2009). El
consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.
Mediciones
F ENO se midi mediante la tcnica de quimioluminiscencia usando un analizador de
NO Sievers 280i (Boulder, Colo., EE.UU.). Las mediciones se realizaron en un flujo
espiratorio de 50 ml / s segn las recomendaciones ATS para la medicin en lnea de F
ENO en adultos [20].
La espirometra (volumen espiratorio forzado en 1 s, FEV 1) se realiz con un
espirmetro MasterScreen neumo PC (Jaeger, Hchberg, Alemania) de acuerdo con las
normas ATS [21]
EBC se recogi mediante el uso de un condensador disponibles en el mercado
(EcoScreen I; Jaeger) de acuerdo con las actuales directrices ATS / ERS [20]. Todas las
mediciones se realizaron al mismo tiempo (8,00-10,00 a.m.) para evitar posible ritmo
circadiano en las concentraciones de mediador en la EBC. Se pidi a todos los
pacientes que se abstengan de comer y beber antes de la recogida de EBC. El aire
exhalado entr y sali de la cmara a travs de las vlvulas de un solo sentido y la
entrada y salida, manteniendo as la cmara cerrada. Una baja temperatura dentro de
la cmara de condensacin durante todo el tiempo de recoleccin produjo una muestra
de refrigeracin baja. La temperatura de la recoleccin fue de alrededor de 0 C [20,
22]. Los pacientes fueron instruidos para respirar por la marea durante 10 minutos con
una pinza en la nariz. La frecuencia respiratoria vari de 15 a 20 respiraciones / min. Se
pidi a los pacientes a tragar su saliva peridicamente y para interrumpir
temporalmente la coleccin si necesitaban a toser. Al final de la recogida de 1,5 a
alcuotas de 3,5 ml de condensado se transfirieron a tubos Eppendorf, inmediatamente
congelado y descongelado poco antes del uso. Las muestras fueron almacenadas a -80
C por no ms de 3 meses [23]. Se congelo y descongelo solamente una vez. A lo
largo de este estudio las partes no consumibles del condensador se lavaron
extensamente con agua libre de amoniaco.
Los valores de pH en el EBC fueron evaluados despus de la desaireacin por burbujeo
con argn como se ha descrito anteriormente [24, 25], utilizando un medidor de pH con
microelectrodo (ELMETRON, Zabrze, Polonia). pH estable se logr en todos los casos
despus de la desaireacin del condensado con argn (350 ml / min) durante 10 min.
La EBC pH se midi en
22 C.
El amonaco en la EBC se determin por el mtodo espectrofotomtrico descrito por
Chaney y Marbach [26]. Brevemente, se aadieron 0,5 ml de reactivo de fenol (0,5 M
fenol y nitroprusiato de sodio 0,01 M) y el reactivo de hipoclorito (NaOH 0,625 M y el
hipoclorito de sodio 0,03 M) sucesivamente a 100 l de EBC y despus de 30 min de
desarrollo de color a 40 C la absorbancia se midi en un espectrofotmetro (Unicam,
Leeds, Reino Unido) a 625 nm. Los otros constituyentes presentes en la EBC no
interfirieron con el desarrollo del color. Lmite de deteccin de este mtodo fue de 10
M. El NO2 / NO3 total de - nivel en la EBC se midi mediante un procedimiento de dos
pasos. El NO3 - se redujo primero en NO2- y luego el total de NO2 (NO3 convierte
adems NO2) se detect mediante la reaccin de Griess colorimtrico. La conversin
de NO3- a NO2- se realiz por reduccin enzimtica usando nitrato reductasa
dependiente de NADPH (de Aspergillus spp .; Boehringer Mannheim, Alemania) como
se describe por Schmidt y Kelm [27]. Brevemente, alcuotas de EBC se

complementaron con NADPH, FAD y nitrato reductasa para producir concentraciones

finales de 50 M, 5 M y 200 U / l, respectivamente, y se incubaron durante 30 minutos a
37 C. Para retirar el NADPH sin reaccionar, las muestras se incubaron adicionalmente
durante 5 min con lactato deshidrogenasa (de msculo de conejo; Boehringer
Mannheim) y piruvato de sodio aadido a las concentraciones finales de 10 mg / ml y
10 mM, respectivamente. Las muestras se mezclaron entonces con un volumen igual
de reactivo de Griess y despus de 10 min de desarrollo del color a temperatura
ambiente se midi la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Los valores
obtenidos por este procedimiento representan la suma de nitrito y nitrato. Lmite de
deteccin en este estudio fue de 0,2 M, que era comparable a la informada por otros
autores [28].
Las concentraciones de IgE total en suero y ECP en suero se midieron utilizando
ImmunoCAP TM Tecnologa (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suecia). El nivel mnimo
detectable fue de 2,0 g / l. recuento de eosinfilos en sangre se midi usando un
analizador hematolgico
(Coulter Electronics GmbH, Miami, Fla., EE.UU.)

Discusin
En nuestro estudio hemos demostrado que los valores de pH en EBC en pacientes
asmticos fueron significativamente ms bajos en comparacin con sujetos sanos.
Estos resultados confirman y extienden los datos de Kostikas et al, se ha encontrado en
adultos asmticos y Carraro et al.se ha observado nios asmticos nios. Ademas,
teniendo todos los grupos de asmticos estudiados en cuenta, hemos observado los
valores de pH ms bajos en los pacientes con asma inestable. Esta observacin se
puede interpretar en el sentido de que la acidificacin endogena de las vas
respiratorias podra aumentar cuando aumenta la gravedad del asma.

Kostikas et al. ha demostrado una correlacin negativa entre los niveles de

PH en EBC y el nmero de eosinfilos en el esputo inducido de pacientes asmticos.
Se ha hipotetizado que la matriz de los grnulos de eosinfilos contiene peroxidasa de
eosinfilos, una enzima que, en presencia de H2O2, es capaz de oxidar haluros a
cidos hipohalosos altamente reactivos. Esto podra explicar en parte la baja de pH que
se observ en pacientes estables con asma moderada, que se caracteriza por conteo
de eosinofilos y valores de H2O2 ms altos que aquellos con asma leve. Las hiptesis
antes mencionadas confirman en nuestro estudio, que ya hemos demostrado que los
valores de pH en EBC se correlacionan negativamente con eosinofilia en sangre
perifrica en todos los grupos estudiados de asmticos y con concentraciones de ECP
(un marcador de la activacin de eosinfilos) en pacientes con esteroides nativos y el
asma estable ICS tratada. Para nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en
el que el pH, amonaco, nitrito / nitrato en EBC y eosinofilia en sangre perifrica y ECP
fueron medidos juntos en pacientes asmticos con diferentes grados de gravedad de la
enfermedad. Tambin hemos encontrado (datos no mostrados aqu y no publicado
hasta ahora) que en los pacientes con asma inestable los niveles de H2O2 en EBC
fueron significativamente ms alto que en los controles.

Hunt et al. demostraron que celulas epiteliales cultivadas de las vas respiratorias y el
pulmn podrian producir amonaco estequiomtricamente de la glutamina en una
reaccin catalizada por glutaminasa. La hiptesis es que la produccin de amonaco
representa un intento por parte de las clulas epiteliales para amortiguar el reto cido,
manteniendo el PH homeostasis de la va area. Los autores informaron que la
actividad de la glutaminasa es regulado negativamente por citoquinas inflamatorias
tales como interfern
gamma y factor de necrosis tumoral alfa, y regulados
positivamente por la administracin de corticosteroides, que suprime citoquinas
inflamatorias. Adems, se observ que durante exacerbaciones del asma aguda ambos
niveles de amonaco EBC y valores de Ph fueron bajos, mientras que la expresin de
glutaminasa se redujo, lo que sugiere que en sujetos asmticos la inhibicin de la
glutaminasa puede contribuir a bajar el pH de la va area. Esta observacin se
confirm adicionalmente por la estudio realizado por Carraro et al, que mostr que los
niveles de amoniaco en EBC son ms bajos en los nios asmticos en comparacin con
los controles y que hay una correlacion positiva entre las concentraciones de amonaco
y pH en EBC. Por lo tanto, nuestros resultados estn de acuerdo con las estas
observaciones, ya que se encontr que en los tres grupos estudiados de asmticos, los
niveles de amonaco en el EBC eran menores en comparacin con voluntarios sanos y
el pH de EBC se correlacion positivamente conlos niveles de amoniaco EBC.
La participacin de amonaco en la fisiopatologa del asma est soportado por el
estudio de Carraro et al., que ha demostrado que tanto el amoniaco EBC como el pH
son correlacionados negativamente con Feno, un marcador sensible de inflamacion de
las vas respiratorias asmatica. Estas correlaciones permiten a los autores especular
que el equilibrio cido-base en la va area puede afectar a la concentracin de nitrito /
nitrato. Esta es consistente con la observacin de Hunt et al. que demostr que la
acidez de la va area favorece la protonacin de nitrito, que se incrementa en el asma,
para formar acido nitroso inestable (HNO2), que se puede descomponer posteriormente
para producir NO. En nuestro estudio el pH de la EBC de pacientes asmticos se
correlaciona negativamente ambos con concentraciones de nitrito /nitrato y el nivel de
F ENO. Aqu nos informan de una correlacin negativa estadsticamente significativa
entre las concentraciones de amonaco en el EBC y F ENO en los grupos de pacientes
con esteroides nativos e ICS-asmaticos estables tratados, pero no en aquellos con
enfermedad inestable. Amoniaco superior en EBC en pacientes con asma tratada ICS
inestable puede ser consecuencia de la regulacin al alza de la exprecion de
glutaminasa por altas dosis de administraron por inhalacin y corticosteroides
sistmicos. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para confirmar esta
hiptesis.
El nitrito, que est presente en bajas concentraciones micromolares en el fluido de
revestimiento de las vas respiratorias, se convierte fcilmente en NO en entornos
ligeramente cidas. En todos los grupos de pacientes asmticos en nuestro estudio los
niveles de nitrito / nitrato en EBC se correlacionan fuertemente, especialmente con
FENO y con ECP y eosinofilia en sangre. Esta observacin puede sugierir que la
concentracin de nitrito / nitrato en EBC tambin podra reflejar la inflamacin
eosinoflica, que es un
rasgo caracterstico del asma.
Se ha informado que la acidificacin de las vas respiratorias en el asma puede producir
muchos efectos perjudiciales. Por lo tanto, el valor de pH en EBC puede reflejar en el
equilibrio acido base en la va area y estado inflamatorio. De hecho, nuestros
resultados muestran que lel PH en EBC se correlaciona negativamente con la gravedad

del asma. Esta observacin ha sido confirmada en estudios previos. Kostikas et al.
Revel que el PH en EBC es menor en los pacientes con asma mal controlada en
comparacin con el asma controlada. En lnea con esto, hay observaciones de
Ratnawati et al., lo que sugiere que el PH en EBC puede ser un marcador adicional de
control del asma en nios. Por otra parte, este parmetro es fcil de medir en EBC y el
tiempo de almacenamiento (no superior a 2 aos) hace no cambia el pH.
En un estudio publicado recientemente, Malinovschi et al. revel que los nitratos en
EBC, pero no nitritos, estaban relacionados en el control del asma. Sin embargo, la
mayora de los estudios informan mediciones de una combinacin de nitratos y nitritos.
En nuestro estudio la suma de NO2-/NO3- en EBC se midi y este parmetro se elev
cuando la gravedad del asma aument. Todava es una cuestin de debate acerca de
cul de estos metabolitos de NO medidos en EBC es mejor relacionada a inflamacin de
las vas aereas. Horvth et al. [18] ha sugerido que los nitritos son metabolitos de NO
inestables y la medicin de nitrito solo en EBC probablemente sera sin sentido. Se
necesitan ms estudios, por lo tanto, para definir qu parmetro sera ms adecuado
para evaluar en el EBC y que est ms estrechamente relacionada con control del
asma.
En cada grupo de asmticos ms de la mitad de los pacientes tena un pH bajo, bajo
amoniaco y alto nitrito/ nitrato en EBC simultneamente. El porcentaje de estos
pacientes fue mayor en el grupo de asmticos tratados con ICS inestables.
Por lo tanto, nuestras observaciones sugieren que el pH, amonaco y nitrito / nitrato,
medido juntos en EBC, poda ser til en la evaluacin de la gravedad del asma. Sin
embargo, otros estudios realizados en grupos ms grandes de pacientes son
necesarios para confirmar esta hiptesis.
Hay algunas limitaciones para el estudio. Uno de ellos podra ser el predominio de las
mujeres en el grupo de esteroide-nativo y el grupo de voluntarios sanos, lo cual es una
consecuencia de la seleccin de pacientes para este estudio. PagetBrown et al., en un
estudio realizado en 404 sujetos saludables, revelar que no hubo diferencias en el PH
de EBC basado en sexo. En nuestra opinin, el predominio de mujeres en los dos
grupos anteriormente mencionados de pacientes no ha tenido ningn impacto en los
resultados del estudio y su interpretacin. Otro punto dbil es la diferencia en la edad
en los grupos estudiados, lo que es una consecuencia de la historia natural de la
enfermedad. El asma se diagnostic a una edad temprana. Por lo tanto, los asmticos
con esteroides nativos son mas jovenes que aquellos con enfermedad inestable. Los
pacientes con la enfermedad inestable son mayores debido a la mayor duracin de los
sntomas de la enfermedad (la duracin de los sntomas del asma se presenta en la
tabla 1). De hecho, los resultados del experimento realizados por Dragonieri et al.
indican que la composicin de EBC de sujetos jvenes y mayores difiere. Esto sugiere
que el pH de su EBC puede tambin difierir. Sin embargo, en los estudios publicados
por Paget-Brown et al. realizado en 404 sujetos sanos de todas las edades, por Vaughan
et al. Realizada en 76 sujetos (rango 18-48 aos) y por Brooks et al. (23 sujetos mas
jvenes de edad media de 24 aos y los 25 participantes viejos de edad media 72
aos), la edad del sujeto no tuvo ningn efecto en el pH en EBC.

Conclusiones
Los resultados de nuestro estudio sugieren que existe una relacin entre el equilibrio
cido-base y los marcadores de estres nitrosativo en EBC y otros parmetros
comnmente utilizados en la evaluacin del estado inflamatorio en pacientes

asmticos (espirometra, FENO, ECP, eosinofilia en sangre e IgE total). Los tres
parmetros (pH, amonaco y nitrito / nitrato) medidos juntos en EBC en los asmticos
podra ser til en la evaluacin de la inflamacin de las vas aereas y la gravedad del
asma.

Expresiones de gratitud
Nos gustara dar las gracias a todos los participantes en el estudio. El estudio
fue
con el apoyo de la Subvencin N 3-06512P.