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Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa 2008; 28:31-37

Artculo original
Extraccin y purificacin de glucosa oxidasa para fines diagnsticos
producida en medios a base de fertilizantes y azcar industrial
Normig Zoghbia, Luis Ojedaa, Nirza Noguerab, Antonio Ypezc,
Hendricka Camargoc, Francisco Triana-Alonsoc*
a

Departamento de Fisiologa y Bioqumica, Escuela de Medicina


Departamento de Fsica Qumica y Matemticas, Escuela de Bioanlisis
Universidad de Carabobo - Sede Aragua
c
Instituto de Investigaciones Biomdicas, Universidad de Carabobo (BIOMED-UC)
Venezuela
b

Recibido 28 de noviembre de 2007; aceptado 05 de febrero de 2008

______________________________________________________________________________________________________________
Resumen La enzima glucosa oxidasa (GOX) es componente esencial de reactivos para determinacin de glicemia y otros parmetros
paraclnicos. Para su produccin suele utilizarse Aspergillus niger cultivado en medios con sustratos costosos de grado analtico. Por
tanto, se plante purificar GOX producida por A. niger, cultivado con nutrientes complejos y econmicos, y evaluar su efectividad en
mediciones de concentracin de glucosa. Para ello se formularon 4 tipos de medio, uno estndar y tres alternativos con azcar industrial y
fertilizantes. Los cultivos se realizaron en fiolas con 50 mL de medio bajo un diseo de bloques al azar, evaluando el crecimiento y la
actividad enzimtica. El medio alternativo con mejor rendimiento fue seleccionado para produccin en biorreactores de 5 L y posterior
purificacin de GOX (fraccionamiento salino y cromatografas en Sephadex G-25 y DEAE-Sephacel). Se obtuvieron altos rendimientos
de enzima (7 mg por carga) de alta pureza (39000 U/g) y un KM aparente para glucosa de 22 1 mM. El reactivo de diagnstico formulado present un intervalo de linealidad ptima (de 50 a 600 mg/dL de glucosa). Por lo que se concluy que los sustratos en el medio de
cultivo alternativo no interfieren en la calidad y cantidad del producto purificado.
Palabras Claves: Glucosa oxidasa, diagnstico, glicemia, Aspergillus niger

Extraction and purification of glucose oxidase for diagnostic purposes


produced in media based on fertilizers and industrial sugar
Abstract The enzyme glucose oxidase (GOX) is an essential component of reagents used for determining blood sugar and other clinical
parameters. Aspergillus niger grown in media prepared with expensive analytical grade substrates is used for its production. Therefore,
we decided to purify GOX produced by A. niger grown in media with complex and inexpensive nutrients and to evaluate its efficiency in
glucose concentration measurement assays. For this purpose we formulated four types of media, one standard and other three alternatives
in which we used industrial sugar and fertilizers. The cultures were done in 50 mL flasks under a random block design, evaluating growth
and enzymatic activity. The alternative medium with the best yield was selected for production in 5 liter bioreactors and later GOX purification (saline fractioning and Sephadex G-25 and DEAE-Sephacel chromatography ). Two large enzyme yields were obtained (7 mg per
load), highly purified (39000 U/g), and with an apparent 22 1 mM glucose KM. The diagnostic reagent formulated presented an optimal
linearity interval (between 50 and 60 mg/dL glucose). Therefore, it was concluded that the substrates in the alternative culture medium
did not interfere in the quality and quantity of the purified product.
Key words: glucose oxidase, diagnosis, glycemia, Aspergillus niger
______________________________________________________________________________________________________________
* Correspondencia:
E-mail: biomed@uc.edu.ve

Introduccin
La glucosa oxidasa (E.C.1.1.3.4) es una glicoprotena
dependiente de FAD, que cataliza la oxidacin de la -D-

glucosa, por la va del D-glucano--lactona, hacia cido


glucnico y perxido de hidrgeno, usando el oxgeno
molecular como aceptor final de electrones [1]. Es muy
utilizada a nivel industrial, es un aditivo importante para la

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conservacin de alimentos y forma parte de los reactivos


para determinacin de glicemia y otros parmetros paraclnicos. Las primeras extracciones fueron realizadas por
Mller en 1928, a partir de las cepas Aspergillus niger y
Penicillium glaucum, posteriormente se han encontrado
muchas especies productoras; sin embargo, las de mayor
rendimiento pertenecen a estos dos gneros [2]. Los sustratos que se utilizan para el cultivo, son muy variables y van
desde fuentes complejas como: suero de queso, licor de
maz, melazas, hidrolizados proteicos; hasta fuentes definidas como: glucosa y sales minerales [3]. La seleccin de
los sustratos para el cultivo depende de la naturaleza del
producto a obtener, su futuro uso y valor agregado, ya que
estos aspectos condicionan los procesos y tcnicas de extraccin y purificacin. En esta investigacin se plante,
producir GOX a partir de A. niger usando sustratos complejos como el azcar industrial y algunos fertilizantes, y
probar su efectividad en la determinacin de concentracin
de glucosa.
Materiales y Mtodos
Microorganismos
Se utiliz una cepa silvestre del hongo A. niger estandarizada, proveniente del Dpto. de Microbiologa de la Escuela de Bioanlisis de la Universidad de Carabobo, Venezuela.
Cultivos en fiola
Se establecieron 4 tipos de medios de cultivo y se probaron en cultivos de 50 mL, a fin de evaluar el crecimiento y
la actividad enzimtica exportada al caldo de fermentacin. Como medio estndar (Est) se utiliz uno a base de
glucosa y sales minerales [4]. Los medios alternativos
fueron elaborados siguiendo la formulacin de ste,
haciendo sustitucin de al menos 2 de los constituyentes.
En todos los casos la glucosa se sustituy por azcar industrial (sacarosa) y al menos una de las sales nutritivas
fue sustituida por un fertilizante comercial (Tabla 1).
Tabla 1. Descripcin de los medios.
Nombre del medio: Constituyentes
Medio estndar (Est): Glucosa (150 g/L), nitrato de amonio (2g/L),
fosfato de amonio (7g/L), fosfato dihidrgeno de potasio (12g/L) y
fosfato cido de potasio (7g/L), sulfato de magnesio (1g/L).
Medio alternativo I (Alt I): Azcar industrial (150 g/L), nitrato de
amonio grado fertilizante (2g/L), fosfato de amonio (7g/L), fosfato
dihidrgeno de potasio (12g/L) y fosfato cido de potasio (7g/L),
sulfato de magnesio (1g/L).
Medio alternativo II (Alt II): Azcar industrial (150 g/L), fertilizante urea-fosfato (4,6 g/L) nitrato de amonio grado fertilizante
(2g/L), sulfato de magnesio (1g/L), carbonato de calcio para ajustar
el pH.
Medio alternativo III (Alt III): Azcar industrial (150 g/L), nitrato
de amonio grado fertilizante (2g/L), humato de potasio fertilizante
(9,3 ml/L), N-72 fertilizante a base de cido fosfrico (17,5 ml/L),
sulfato de magnesio (1g/L).

El pH de todos los medios de cultivo fue ajustado a 7 y


se esterilizaron a 121C por 15 min. La inoculacin se
realiz con esporas, a razn de 250.000 esporas/mL de
medio. Los cultivos se llevaron a cabo en incubador a 30C
por 36 h con agitacin a 200 rpm. El micelio y el caldo de
fermentacin fueron separados por centrifugacin a 6000
rpm por 20 min. El micelio fue colocado en estufa a 90C
hasta alcanzar peso seco y al caldo de fermentacin (o
extracto crudo) se le midi el volumen, el pH y la actividad enzimtica. Tambin se procedi a realizar la precipitacin salina del caldo (con sulfato de amonio hasta el 80%
de saturacin), a fin de obtener un extracto parcialmente
purificado de la enzima y hacer mediciones de actividad.
Cultivos en biorreactores
Para la produccin y purificacin de la enzima, se llevaron a cabo cultivos en un biorreactor de 5 L (New Brunswick, Modelo Bioflo 2000). Las condiciones de incubacin fueron similares, 30C con suministro de aire a razn
de 2 L/min por 36 h con una agitacin de 200 rpm, monitoreando los cambios de peso, pH y consumo de oxgeno
durante el tiempo de incubacin. La recuperacin se realiz por filtracin y al extracto crudo obtenido se le determin el contenido proteico y la actividad enzimtica, antes
de someterlo a los procesos de extraccin y purificacin.
Contenido proteico
Para la estimacin se tomaron las lecturas de absorbancia de las muestras, a las longitudes de 260 y 280 nm y
aplic la frmula (1,55*Abs 280) (0,76*Abs 260) [5]. El
equipo utilizado para tomar las mediciones, fue un espectrofotmetro Beckman Modelo Du 650.
Actividad enzimtica
La actividad de GOX se evalu midiendo la produccin
de perxido de hidrgeno a partir de glucosa colocada
como sustrato en el ensayo. Para ello se utiliz la modalidad de acoplamiento con peroxidasa, usando la 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB) como cosustrato [6]. La mezcla
de reaccin contena 30 L de TMB 0,4 g/L oxigenado por
10 min; 1,4 l de una solucin de peroxidasa de 4,3
mg/mL en de buffer fosfato 0,05 M pH:6,9; 5 L de de D-glucosa 4 mM; y 0,1-0,2 g de protenas de cada muestra diluidas en un determinado volumen de buffer fosfato
0,05M (pH 7). Esta mezcla se incub por 10 minutos a 25
y la reaccin se detuvo agregando 50 L de HCl 0,1 N.
Las lecturas de absorbancia se realizaron a 450 nm (mximo de absorbancia del producto de oxidacin del TMB) y
los resultados se expresaron tanto en variacin de la absorbancia por unidad de volumen (Abs450nm/ml) como en
unidades de actividad. Para el clculo de stas se utiliz el
coeficiente de extincin molar del TMB (5,9x104 M-1cm-1)
y se defini como la cantidad de glucosa oxidasa que cataliza la oxidacin de 1 mol de -D-glucosa por minuto a
pH 7 y a 25C.

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Tcnicas de extraccin y purificacin


En esta investigacin se trabaj con la enzima extracelular, por lo que la purificacin de la misma se hizo a partir
del caldo de fermentacin, separado por centrifugacin y/o
filtracin del micelio. Se inici el proceso de extraccin
por fraccionamiento salino, con sulfato de amonio al 80%
en fro (4C) bajo agitacin. Cuando se disolvi completamente la sal, se dej en reposo durante 12 horas y luego
se centrifug a 6500 rpm por 30 min. El sobrenadante fue
descartado y el sedimento fue lavado con sulfato de amonio al 80% y resuspendido en buffer Tris-HCl (pH 7,5) 20
mM; NaCl 350 mM y Glicerol al 2%, para extraer la GOX
y tener as el extracto parcialmente purificado. Para purificacin ulterior, dicho extracto fue sometido a una cromatografa de exclusin molecular, en Sephadex G-25, para
eliminar el exceso de sal. La columna fue equilibrada en el
buffer de resuspensin y a las fracciones obtenidas se les
determin la presencia de sulfato de amonio, la cantidad de
protenas por estimacin 260-280 nm, y la actividad enzimtica. Se agruparon las fracciones de mayor contenido de
GOX y sin sal. Este volumen fue concentrado por ultrafiltracin usando membranas de corte en 10 kD (AMICON).
El concentrado fue sometido a cromatografa en una columna de DEAE-Sephacel (Sigma) equilibrada en TrisHCl (pH 7,5) 10 mM. La elucin de la protena se efectu
mediante un gradiente optimizado de NaCl como se indica.
A las fracciones obtenidas se les realiz estimacin de
contenido proteico y actividad enzimtica.
Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
Para determinar la presencia y calidad de la protena aislada, se procedi realizar anlisis electrofortico en condiciones desnaturalizantes usando geles de poliacrilamidaSDS al 10% [7]. Los polipptidos separados se visualizaron mediante tincin con nitrato de plata [8].
Parmetros cinticos de la actividad enzimtica de GOX
(KM)
Se realiz la determinacin del KM para la glucosa como
sustrato, mediante ensayos de actividad enzimtica de
GOX utilizando concentraciones variables de glucosa,
desde 0 hasta 250 mM. Los resultados se analizaron para
verificar el cumplimiento de postulados establecidos por
Michaelis y Menten.
Determinacin de concentracin de glucosa
A fin de dar un futuro uso a la enzima purificada en esta
investigacin en el rea clnica y de diagnstico, se procedi a disear un reactivo para la determinacin de glucosa
[9, 6]. Para establecer las concentraciones y cantidades de
cada uno de los componentes que conformaron este reactivo, se optimizaron sus concentraciones tomando como
base la informacin contenida en los folletos informativos
de diversos reactivos comerciales hasta estandarizar la
respuesta del reactivo diseado (Tabla 2). Para la prepara-

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cin del reactivo se mezclaron todos los componentes en


las concentraciones optimizadas para la reaccin. La reaccin inici mezclando 200 L del reactivo preparado con 2
L de solucin patrn de glucosa o agua (blanco reactivo),
respectivamente. Las mezclas de reaccin se incubaron
durante 10 min a 37C y posteriormente se realizaron las
lecturas de absorbancia a 505 nm. Para evaluar la linealidad de respuesta del reactivo se utilizaron soluciones patrn de glucosa entre 50 mM y 600 mM.. Las lecturas de
absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro Beckman Du 650, calibrado con el blanco del reactivo. Simultneamente se realiz el mismo ensayo empleando un
reactivo comercial (Sigma) con soluciones patrones dentro
del rango de linealidad reportado por esa empresa (desde
100 hasta 500 mg/dL).
Tabla 2. Concentraciones de los componentes del reactivo de determinacin de glicemia.
Reactivos

Concentracin

4-Aminofenazona

1,25 mM

GOX

0,25 g/L

POD

0,6 g/L

Fenol

40 mM

Fuente: Zoghbi (2006).

Anlisis estadstico
Los resultados de las variables peso, volumen de caldo
de fermentacin recuperado, la actividad enzimtica del
mismo y del extracto crudo, obtenidos de los cultivos en
fiolas, fueron analizados por la Prueba de Friedman, con
un nivel de significacin de 0,05 y as, establecer si existan diferencias significativas entre los diferentes medios
probados. En funcin de estos resultados, se seleccion el
medio para la produccin y purificacin de la enzima que
se utiliz en la preparacin del reactivo diagnstico.
Resultados y Discusin
Cultivos en fiolas
Al formular los medios se observ que, en el caso del
medio estndar, durante la esterilizacin la glucosa se
caramelizaba al mezclarse con los otros constituyentes del
medio. El problema se resolvi esterilizando separadamente la glucosa. Esta situacin no se present en el caso de
los medios alternativos, que fueron formulados completamente y esterilizados en un solo paso. En todos los medios
de cultivo utilizados se observ crecimiento de A. niger,
con formacin de un micelio esfrico regular. Sin embargo, se observaron diferencias significativas en cuanto al
peso (p= 0,0112), siendo los de menor rendimiento los
medios estndar y alternativo II, con 1 0.6 y 0,6 0.2
g/L, respectivamente. Los medios alternativos I y III arrojaron los mayores valores alrededor de 2 g (Figura 1A). En
las variables volumen de caldo de cultivo recuperado y
actividad enzimtica del extracto crudo (expresada como

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Abs450/ml), tambin se encontraron diferencias significativas (p= 0,0206 y 0,0112).

Extracto parcialmente purificado


Extracto crudo

8
6

4
1
2

Peso seco (g/l)

Actividad de GOX (Abs 450 nm/ml)

0
Est

Alt I

Alt II

Alt III

Volumen de caldo de fermentacin (ml)

Cultivos a mediana escala


A partir de los resultados de los cultivos en fiolas, se seleccion el medio alternativo I para desarrollar el medio de
produccin en el biorreactor de 5 L. Durante el desarrollo
del cultivo se evidenci que el perodo de latencia dur
aproximadamente 12 horas. Superado este tiempo hubo
incrementos significativos en el peso hmedo de las muestras de 10 mL acompaados por un descenso de la densidad de oxgeno disuelto (indicacin de metabolismo aerbico activo). A las 24 horas, en plena fase logartmica de
crecimiento, el oxgeno disuelto alcanz su nivel mnimo
(12-15%), el cual se mantuvo relativamente constante
hasta las 36 horas (con ligera pendiente negativa). En
cuanto al pH, se mantuvo estable hasta las 22 horas (alrededor de 6,75), tiempo a partir del cual ocurri un descenso marcado hasta un pH 6,0 que se mantuvo hasta el final
del cultivo (Figura 2). El rendimiento obtenido al final del
proceso fue de 3,2 L de extracto crudo (caldo de cultivo),
con un estimado proteico de 2,99 mg/mL y un peso hmedo del micelio 260g.
Extraccin y purificacin

40
30
20
10
0
Est

Alt I

Alt II Alt III

Figura 1. (A) Actividad enzimtica del extracto crudo ( ), extracto


parcialmente purificado ( ) y peso seco promedio ( ) de cultivos de A.
niger en fiolas recuperados despus de 36 h. (B) Volmenes promedios
del caldo de cultivo recuperado despus de 36 horas de crecimiento.

Los volmenes recuperados ms altos correspondieron a


aquellos medios con menor rendimiento de biomasa, estndar y alternativo II, y la mayor actividad en extracto
crudo el medio alternativo I seguido por el III , quedando
por debajo el alternativo II; pero todos significativamente
superiores al medio estndar (Figura 1A y 1B. Sin embargo, las actividades de los extractos parcialmente purificados mediante fraccionamiento salino, no mostraron diferencias al nivel de significancia que se estaba trabajando (p
= 0,0576), debido a que, probablemente, el procedimiento
de extraccin favorece a la homogenizacin de los extractos.

La adaptacin del procedimiento previamente optimizado para cultivos a pequea escala [6] funcion eficientemente para la purificacin de la actividad enzimtica a
partir de caldos de cultivo obtenidos del biorreactor. El
fraccionamiento salino permiti el incremento de la concentracin proteica desde 2,99 mg/mL hasta 9,61 mg/mL,
as como de la actividad especfica, la cual pas de valores
entre 60 - 80 U/g hasta 250 300 U/g aproximadamente.
Durante la desalinizacin por cromatografa en columna
Sephadex G-25, se evidenci un proceso de separacin
eficiente, rpido y sin riesgo de inactivacin enzimtica.
En el perfil cromatogrfico se observ que la actividad
enzimtica de GOX comenz a eluir de la columna en el
volumen de exclusin coincidiendo con el mximo de
absorbancia a 280 nm (Figura 3). Con este paso de purificacin se logr un incremento significativo de la actividad
especfica entre 2000-2500 U/g. Uno de los factores importantes para este aumento fue, probablemente, la eliminacin de la gluconolactona y/o el gluconato derivado que
aparecen en el medio durante la fermentacin. Se ha reportado que el gluconato inhibe a la glucosa oxidasa por competir con el sustrato (glucosa) por su sitio de unin [10,11].
Adems el paso de filtracin molecular elimina una porcin importante de material que absorbe a 280 nm. Esto
indica la eliminacin de pptidos pequeos que contribuyen a la concentracin de protenas calculada en el material inicial.
El esquema de fraccionamiento en DEAE-Sephacel
diseado con un gradiente salino lineal, desde 100 mM
hasta 600 mM NaCl (seguido por un incremento a 1 M
NaCl), permiti la elucin de la enzima a valores aproximados a 400 mM de la sal, logrando as la eliminacin
satisfactoria de elementos contaminantes y recuperando
ms del 65% de la actividad total de la muestra (270 U),

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con un incremento de la actividad especfica alrededor de


20 veces (39.000 U/g).
)

7,0
60
pH
50

2
40
6,5
30
1

20
10

Densidad de oxigeno (%)

12

18

24

30

36
)

0.8

Sulfato de amonio
0.4

1
0.2

Actividad de GOX
(Abs. 450 nm)

0.6

0
10
20
Nmero de fraccin

30

Figura 3. Purificacin parcial de GOX a travs de una columna de exclusin molecular en Sephadex G-25. Se registr el perfil de absorcin a 280
nm (lnea negra) del material eludo de la columna de Sephadex G-25. La
actividad de GOX fue medida en las fracciones colectadas (barras grises).
Se indica la fraccin en que comienza a eluir el sulfato de amonio [Prueba del Ba(Cl)2].

Evaluacin de la calidad del extracto enzimtico purificado


El preparado enzimtico purificado fue sometido a pruebas de calidad, comparando su integridad estructural con
respecto a preparados comerciales de la enzima (Sigma).
Se observ que el preparado purificado present un perfil
electrofortico similar al producto comercial, sin evidencia
de procesos de degradacin ni contaminantes mayores
(Figura 5). La calidad del producto purificado, tambin fue
estimada a travs de la determinacin del KM para el sustrato glucosa. Los resultados demostraron un comportamiento enzimtico ajustado a la ecuacin de Michaelis-

400

0.5

200

0.5

Este factor de purificacin es inusualmente alto para


cromatografas de intercambio inico. Sin embargo, en
este caso se justifica por el gran pico de material contaminante separado que eluye despus de incrementar la concentracin de NaCl a 1 M (Figura 4).

1.5

poras o UFC/ml. Peso hmedo de micelio ( ), pH ( ) y la cantidad de


).
oxgeno disuelto fue determinada en forma continua (

600

1.5

2
NaCl (mM,

Figura 2. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en un fermentador


New Brunswick BioFlo 2000. Condiciones de crecimiento: 30C; pH 7;
flujo de aire, 2 L/min; 5 litros de medio de cultivo; A. nger, 255.000 Es-

800

Tiempo (horas)

Actividad GOX (Abs. 450 nm,

2.5

6,0
0

Abs. 280 nm (

1000

2.5

Abs. 280 nm (

Peso hmedo de micelio (g/10 ml,

Menten, con la forma hiperblica tpica (Figura 6A). Las


representaciones de dobles recprocos (Figura 6B) y EadieHofstee (Figura 6C) dieron un buen ajuste a lneas rectas
(coeficientes de correlacin lineal: 0,99 y 0,95, respectivamente) y los valores estimados de KM aparente para la
glucosa fueron bastante cercanos: 21 mM y 23 mM, respectivamente; como se espera en caso de una enzima que
siga el mecanismo propuesto por Michaelis y Menten. El
valor estimado promedio del KM aparente (22 1 mM)
est en el orden de los valores reportados previamente para
preparaciones purificadas de glucosa oxidasa de Aspergillus niger [12-15].

0
0

10

20
30
Nmero de Fraccin

40

50

Figura 4. Cromatografa en de GOX DEAE-Sephacel con gradiente de


elucin optimizado. Al perfil de absorbancias a 280 nm (lnea negra) se
)y
superponen las determinaciones de la actividad glucosa oxidasa (
). Las lneas punteadas verticales
el gradiente de NaCl usado (
indican el rango de fracciones colectadas para los ensayos de actividad
enzimtica ulteriores (fracciones 18 a 22).

kDa
225
150
100
75
69
50
35
25
Figura 5. Anlisis electrofortico de la glucosa oxidasa parcialmente
purificada. Muestras (25 g) de glucosa oxidasa purificada por exclusin
molecular en Sephadex G-25 y cromatografia de intercambio aninico en
DEAE-Sephacel (canal 1), y glucosa oxidasa comercial (canal 2) fueron
sometidas a electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%.
Tincin con nitrato de plata. Las flechas indican la posicin de contaminantes de alto peso molecular en el preparado comercial.

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V ( abs. 450 nm / min)

0,12

0,08

0,04

0
0

50

100

150

200

250

[Glucosa] (mM)

160
A

120

Reactivo formulado
con GOX purificada

80
0.6

40

Abs. 505 nm

(abs. 450 nm/min)-1

1/V

que la absorbancia obtenida aumenta en forma lineal hasta


una concentracin de glucosa de 600 mg/dl, y sin desviaciones de la ley de Lambert-Beer (Figura 7A). Este rango
lineal de respuesta es mayor al reportado por la mayora de
los reactivos comerciales disponibles. Lo cual se ratific al
compararlo con la respuesta obtenida para el reactivo comercial usado como referencia (Figura 7B). Aunque la
respuesta del reactivo comercial es totalmente lineal hasta
500 mg/dl, se puede observar que la sensibilidad, expresada como la pendiente de la recta ajustada por mnimos
cuadrados, es un 50% mayor para el reactivo formulado
con la enzima purificada (0,0008 y 0,0012 unidades de
absorbancia por cada mg/dl de glucosa para el reactivo
comercial y el reactivo formulado en este trabajo, respectivamente). Esta mejor respuesta puede atribuirse a una
mayor calidad de la enzima usada en el reactivo formulado
[16]. Por lo tanto, en este estudio se demuestra que es
posible obtener metabolitos de alta calidad a partir de
microorganismos cultivados con materiales de bajo costo
como los fertilizantes y el azcar industrial.

KM ap = 23 mM
0.1

0.5
1/[Glucosa] (mM-1)

0.9

0.4
y = 0.0012x
R2 = 0.999
0.2

0,12

100

200

300

400

500

600

[Glucosa] (mg/dl)

0,08

B
Reactivo comercial
0.4

0,04
KM ap = 21 mM
0

2
4
V/[Glucosa] x 103

Abs. 505 nm

V (abs. 450 nm / min)

0.2

y = 0.0008x
R2 = 0,9999

Figura 6. Parmetros cinticos de la enzima glucosa oxidasa parcialmente


purificada. Los resultados se presentan como la dependencia de la velocidad (cambio de absorbancia a 450 nm por min = Abs. 450nm/min) con
la concentracin de glucosa (A); representacin de dobles recprocos
(Lineweaver-Burk, B) y de Eadie-Hofstee (C). Se indican los valores
estimados del KM aparente para glucosa en cada caso.

Linealidad del reactivo para la determinacin de glicemia


Los resultados del anlisis de la respuesta del reactivo
formulado con la enzima purificada (Tabla 2), mostraron

100

200

300

400

500

[Glucosa] (mg/dl)

Figura 7. Respuesta del reactivo formulado y un reactivo comercial frente


a diferentes concentraciones de glucosa. Representacin de las absorbancias obtenidas con el reactivo formulado en este trabajo (A) y un reactivo
comercial (B) a las concentraciones indicadas de glucosa.

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Conclusiones
Los resultados obtenidos demostraron que la enzima purificada fue de buena calidad y que el medio de cultivo a
base de fertilizantes y azcar industrial, como sustitutos de
las sales minerales, hidrolizados de protenas y de la glucosa, aportan todos los nutrientes que necesita el hongo
para su crecimiento y la produccin de la enzima. Otro
aspecto importante es que dichos componentes del medio
no ocasionaron interferencias detectables en los procesos
de extraccin y purificacin, ni sobre la calidad del producto final. Esto constituye una ventaja, que puede ser
aprovechada para reducir los costos de produccin de
enzimas a partir de microorganismos cultivados usando
materiales econmicos y de produccin nacional. Al mismo tiempo se eliminan los tiempos de espera por productos importados de alto valor agregado como son las enzimas con fines diagnsticos.

3.
4.

5.
6.

7.
8.
9.

Agradecimientos

10.

A la Prof. Rosa Cristina Prez del Departamento de Microbiologa de la Escuela de Bioanlisis de la Universidad
de Carabobo - Sede Aragua, por proveer la cepa de Aspergillus niger usada en este estudio. A la Lic. Ninoska Ramrez y el Lic. Edgar Tovar, por la excelente asistencia tcnica durante el desarrollo experimental.
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia
y Tecnologa (Proyecto: Purificacin de componentes
biolgicos para la produccin de reactivos de diagnstico
al servicio de la salud); FONACIT (Proyecto: Pem2001002174; Beca de la Prof. Normig Zoghbi para estudios de Maestra en Ciencias Biomdicas en el BIOMEDUC); OPSU (Financiamiento del Programa Alma Mater
para la Prof. Nirza Noguera).

11.
12.

13.

14.

15.

Referencias
1.
2.

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