dan
Posisi
primer (*)
285-303
903-886
286-304
903-886
563-582
903-886
285-303
639-622
285-303
643-626
Ukuran
fragmen
(pb)
619
618
341
355
359
31
Tm
(C)
Konten
GC (%)
56,71
56,24
53,48
56,24
55,95
56,24
56,71
55,39
56,71
56,37
57,8
55,5
55,5
55,5
55,0
55,5
57,0
50,0
57,8
50,0
32
Pasangan Primer
Posisi
primer (*)
Ukuran
fragmen
(pb)
Tm
(C)
Konten
GC (%)
563-582
341
62,4
55,0
62,9
55,6
AzoF3
5'GGATCACCTATACCCTCGTC 3
AzoR3
5'CTTCAGGTCACGCAACAG
3'
903-886
33
421 CTTCTGGGCGAAAGCATGGGTGGGGCGGTGGTGCTCACCGCGATGACCGGCCCCAATCCG
481 CCCGAGGTCGCCGGCACCATCCTGGTCGCCCCCGCCGTCTGGGGCCGGCAGGCCATGGGC
541 TTCTTCCCGCGCGCCGCCCTGTGGATCACCTATACCCTCGTCCCCGGCATGGTCGTCCAT
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> AzoF3
601 CCGCCGCAGGATTTGGACATCCATCCATCCGACAACATCGAGATGCTGCGGGCGCTCGGC
661 CGCGACCCGCTGGTCATCAAGGGATCGCGGGTCGATGCGCTGGAGGGGTTGACCGACCTG
721 ATGGGCAGCGCGCTCGACGCCTGCCAGCATCTGCAAATCCCGTCCCTGGTCCTCTATGGC
781 GCGCATGAGGAGGTGCTGCCACCCAAGCCGGTCGAGCGGGCACTGAAGGAGTTCGAAACC
841 GGCGGGCGGCATGTCGTCGCCGTCTATCCCGACGGCTACCACATGCTGTTGCGTGACCTG
<<<<<<<<<<<<<<<
901 AAGGGCAAACTGGTCGTCGACGACATCGTCGCCTGGATCGAAAACCCGAAGCTGCCGCTG
<<< AzoR3
961 GCCAGCGGCGCCGACCGCGCTCCAAGGGCCCTGCTCGCCTCCAAGTGA
Gambar 5.1 Posisi urutan nukleotida primer AzoF3 dan AzoR3 pada
Azospirillum sp. B510
34
35
rusak selama proses penghancuran sel dan pelarutan komponen sel. Kemudian hal
ini bisa dilanjutkan ke tahap lisis bakteri. Bufer lisis yang digunakan mengandung
detergen Triton X-100 yang digunakan untuk memecah membran sel. Secara
keseluruhan fungsi dari bufer lisis juga untuk memisahkan protein histon dari
DNA dan mendenaturasikannya, serta merusak struktur sekunder dan tersier
protein dengan tetap menjaga kestabilan untai DNA target pada pH dan komposisi
bufer lisis yang digunakan.
Untuk mendapatkan kualitas DNA yang bagus tahap pencucian sangat
diperlukan yaitu dengan menggunakan NaCl dan EDTA. NaCl akan
mendenaturasi protein kromosomal sedangkan EDTA berperan sebagai agen
pengkhelat yang dapat menetralisir ion logam seperti Mg2+ dan Ca2+. Mengkhelat
ion-ion ini akan menjaga DNA tetap utuh pada kondisinya. Pelet yang didapatkan
semuanya merupakan hasil dari sentrifugasi 4000 rpm selama 10 menit pada suhu
4 C. Dari tahap pencucian kemudian pelet atau endapan dilarutkan pada trisEDTA dan lisis kembali dilakukan dengan menggunakan SDS dan proteinase K.
SDS digunakan untuk melarutkan membran sel. Enzim perusak komponen
penyusun sel atau penyusun sitosol biasanya ditambahkan pada sistem bufer SDS.
Enzim yang biasa dipergunakan adalah proteinase K. Proteinase K memecah
glikoprotein dan RNAse-DNAse inaktif pada konsentrasi 0,5% hingga 1% larutan
SDS (Shahriar et al., 2011). Pada penelitian ini digunakan konsentrasi SDS 10%
dan volume proteinase K sebanyak 20 L. Hal ini dilakukan dengan alasan bakteri
yang akan diisolasi DNA-nya adalah golongan bakteri gram negatif yang
memiliki lapisan peptidoglikan lebih tebal dibandingkan dengan milik bakteri
gram positif. Lapisan inilah yang sering menjadi masalah dalam isolasi DNA
bakteri karena akan mempengaruhi pada tingkat kemurnian isolat DNA yang
didapatkan.
Setelah tahap tersebut, protein dan kontaminan lainnya dihilangkan dengan
presipitasi NaCl. Dan presipitasi terakhir dilakukan dengan isopropanol.
Mekanisme presipitasi dengan menggunakan isopropanol ini adalah dengan
menggunakan sistem perbedaan kelarutan. Semula DNA berada dalam fasa
aquaeous (air) dan tidak larut dalam isopropanol. Di sisi lain alkohol lebih mudah
36
larut dalam air dibandingkan dengan DNA. Hal ini menyebabkan isopropanol
akan menyatu atau larut dengan air sehingga DNA terdesak, terpisah, dan
terpresipitasi. Keuntungan menggunakan isopropanol dibandingkan dengan etanol
adalah efisiensi dari proses presipitasi yang dihasilkan lebih tinggi sehingga lebih
efisien jika rendemen DNA yang dihasilkan sangat sedikit. Kelemahannya terletak
pada kurang volatilnya isopropanol dibandingkan dengan etanol, sehingga hal ini
menyebabkan pengeringan pelet DNA perlu waktu lebih lama. Pelet DNA yang
dihasilkan juga tidak terlalu melekat didasar tabung saat setelah dilakukan
sentrifugasi (Chen et al., 2010).
DNA Azospirillum sp. JG3 telah berhasil diisolasi. Analisis kualitatif dari
DNA hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa
untuk menunjukkan bahwa DNA bakteri tersebut berhasil terisolasi atau tidak.
Hasil elektroforesis isolat DNA ditunjukkan oleh gambar di bawah ini.
37
terdapatnya pita visualisasi dari RNA seperti yang ditunjukkan pada lajur A dan
B. Sehingga isolat C inilah yang selanjutnya digunakan sebagai cetakan DNA
pada proses PCR. Konsentrasi yang digunakan dalam proses selanjutnya akan
ditentukan setelah dilakukan analisis kuantitatif pada isolat DNA.
Tabel 5.3 Data analisis kuantitatif hasil isolasi DNA
No.
1
2
3
Sampel
A
B
C
Berdasarkan
A (260 nm)
0,119
0,114
0,104
analisis
A (280 nm)
0,103
0,087
0,087
kuantitatif
DNA
Rasio (A260/A280)
1,16
1,31
1,20
dengan
menggunakan
38
isolasi sebelumnya. Konsentrasi cetakan yang digunakan bukan 260 ng/L atau
menggunakan hasil isolasi DNA secara langsung melainkan menggunakan
cetakan dengan konsentrasi tertentu. Menurut Sambrook dan Russell (2001),
konsentrasi cetakan DNA yang digunakan untuk proses amplifikasi DNA dengan
teknik PCR adalah 10 ng/L hingga 1 g/L. Dalam penelitian ini dipilih
konsentrasi cetakan DNA 50 ng/L. Kisaran konsentrasi ini biasa digunakan
dalam proses PCR yang dilakukan dari DNA genom bakteri atau yeast.
Penggunaan konsentrasi cetakan DNA yang rendah atau tidak pekat juga berguna
untuk menghindari kesalahan penempelan primer ketika terjadi amplifikasi DNA
target.
Sepasang primer diperlukan untuk menginisiasi terjadinya amplifikasi atau
perbanyakan DNA. Dalam tahap ini digunakanlah pasangan primer hasil desain
yaitu AzoF3 dan AzoR3. Konsentrasi yang digunakan dari sepasang primer juga
tertentu. Dalam penelitian ini digunakan primer forward dan primer reverse
dengan konsentrasi 10 pmol/L dengan panjang masing-masing 20 dan 18
nukleotida.
Protokol lain yang diperlukan dalam proses PCR adalah bufer PCR,
MgCl2, dNTP, dan enzim DNA polimerase. Fungsi bufer di sini adalah untuk
menjaga pH medium karena PCR hanya akan berlangsung pada pH tertentu. Ion
Mg2+ dari MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi untuk menstimulasi
aktivasi enzim DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan
interaksi primer dengan cetakan DNA yang membentuk kompleks larut dengan
dNTP (Handoyo dan Rudiretna, 2001). dNTP sendiri merupakan suatu campuran
dari dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP
(deoksisitidin trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). dNTP ini bertindak
sebagai agen pembangun DNA yang diperlukan dalam proses perpanjangan DNA
yang terkatalisis oleh enzim DNA polimerase. Dalam penelitian ini, protokolprotokol tersebut berada dalam 1 butir PureTaq Ready To Go PCR. Penggunaan
kit ini mempermudah peneliti karena tidak perlu lagi melakukan optimasi
konsentrasi masing-masing. Pada volume akhir 25 L konsentrasi dNTP adalam
200 mM dalam 10mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, dan 1,5 mM MgCl2
39
40
1 kb
500 pb
B
Gambar 4.3 Hasil Amplifikasi DNA dengan primer AzoF3 dan AzoR3 (A)
fragmen 820 pb (B) fragmen 229 pb (M) DNA marker 100 pb
Hasil analisis kualitatif di atas menunjukkan adanya 2 fragmen yang
berhasil
diamplifikasi
oleh
primer
AzoF3
dan
AzoR3.
Pada
ukuran
820 pb menunjukkan pita tebal dan sangat jelas, sedangkan ukuran basa yang
lebih pendek yaitu 229 pb jauh lebih tipis (penentuan panjang fragmen pada
Lampiran 3). Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa primer yang digunakan adalah
primer yang spesifik. Semakin spesifik primer yang digunakan semakin sedikit
pula DNA fragmen yang dihasilkan pada saat amplifikasi DNA target. Langkah
selanjutnya yang diambil adalah mengisolasi kedua fragmen DNA yang
dihasilkan.
Jika dikembalikan ke awal lagi, maka hasil amplifikasi DNA target
pengkode lipase ini tidaklah cocok dengan perkiraan awal. Pada tahap desain
primer PCR, perkiraan hasil amplifikasinya adalah 341 pb. Maka bisa ditarik
kesimpulan bahwa ketidaksamaan hasil amplifikasi dengan dugaan awal adalah
dasar dari desain primer yang digunakan yaitu urutan nukleotida pengkode lipase
41
42
1 kb
820 pb
Gambar 5.4 Hasil purifikasi fragmen DNA 820 pb (M) DNA marker 1 kb
43
300
bp 0pb
03
200 pb
bp 002
Gambar 5.5 Hasil re-PCR fragmen 229 pb (M) DNA marker 100 pb
TACTGCAAGT
GGACGGGTGA
CGGGATACCG
GCCACACCCT
AGCCAGGACT
TGCTTCTGAC
CGAGCGGACA
GGANGGATGG
GAGANAAAGG
AGGGTTGGCC
GGGCATAAAG
AGC
GAAGGGAGCT
GGTAACCTGC
TGCTGTCATC
AATCTACTCC
ACAAGGGCAT
TGCTCCCGGA
CTGTAAGACT
CTTNCACCTC
CCCGAGCGAG
AGCCATCTAT
TGTTAGCGGC
GGGATAACTC
ACCCTGTGGA
GGAGGGCACG
TGGAAACCTG
50
100
150
200
250
44
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
701
751
801
CCGGGGACAG
CGTTAGTAGG
GGCCACCCGG
AATCAGGCCG
TACGAGTGCT
GGTGCACTGG
AGCCGGTCGC
ATAAAACAGG
TACACAGGAT
ATCGCCGTGG
ATAGTCCACA
CCCACTCCAC
AGCCGCCATA
CATGGTCTAT
TCCCCTGGCG
GCC
CGGCCGTACG
GGAACAATCC
ATTGGCGCCA
TCGTGCGTGC
GAACCAAATC
AAGACATAAC
CCACAAACAT
CGCCGGACGT
TTCGAGCTCC
CGATGGGTAT
GGATTGATGT
GTCCAGCCAG
AAACATGGGC
GCAGGAAGTC
CTTGTAGTAA
AGCGCTAGGG
GTACAGTGCG
CCAATAGCGG
AGCATTTGGC
AATCCGACAT
GCAAGCCACG
CTGGAAGCGG
CCGGAGCGAG
CACTGGGCGA
GTCTTCAAAC
CCTCGACCAC
AAGAGGGCCA
CCAATCAGCG
GCCGTCTTAA
GCGACGTAGA
CCGAGCGACG
CAAGCCCGGC
GGGCTCTACG
GGGGTAGCGC
ACTATGGGGA
GTGGATGATT
GGGTGATCAA
TTTTTTGCAC
CTGGCTGCCC
ACACCGATCA
TGCCAACTGA
GATTGCCGTC
TTCCATCGGT
ACAAAGTCAG
CGGCGTGTGC
TTATGACTTC
CGGATTACAT
TTGGGAACGG
GCATATGAAT
GAGCGTGATC
ATACCCGGGC
AGATTTGTGC
CGATCTTTGA
CGTTAGAATC
CGTCCTCACG
TCTGCACGCC
GCCAGGCAAG
AATCGCCCAG
AGTCGGGCTA
AGTCGAGCAT
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Gambar 5.6 Urutan DNA hasil sekuensing dengan primer AzoF3 dan
AzoR3
Dari hasil sekuensing fragmen 820 pb ini terlihat hasil sekuensing dengan
menggunakan primer AzoF3 lebih pendek. Hal ini mengakibatkan tidak adanya
keseimbangan jumlah nukleotida ketika disejajarkan dengan hasil sekuensing
dengan menggunakan primer AzoR3. Data kromatogram dari AzoF3 pun dinilai
sangat jelek ditunjukkan resolusi puncak yang sangat rendah, kemungkinan besar
disebabkan oleh inhibitor pada sampel yang berupa kontaminan atau konsentrasi
cetakan DNA dan primer tidak mencukupi saat reaksi sekuensing. Pada prinsipnya
sekuensing pada satu cetakan DNA dilakukan 2 kali dengan 2 primer berbeda
untuk melengkapi sekuen satu dengan yang lain yang disebut sebagai daerah
konsensus. Reverse complement dari sekuen AzoR3 disejajarkan dengan sekuen
AzoF3 pada program BioEdit sehingga diperoleh daerah konsensus seperti yang
terlihat di bawah ini:
1
51
101
151
201
251
TTTTCAGGGG
CCGGGGACAG
CGTTAGTAGG
GGCCACCCGG
AATCAGGCCG
TACGAGTGCT
ACGGCAACAG
CGGCCGTACG
GGAACAATCC
ATTGGCGCCA
TCGTGCGTGC
GAACCAAATC
GCTCGTACCT
AGCGCTAGGG
GTACAGTGCG
CCAATAGCGG
AGCATTTGGC
AATCCGACAT
CAACATCAAC
CCGAGCGACG
CAAGCCCGGC
GGGCTCTACG
GGGGTAGCGC
ACTATGGGGA
TTGGAGGATG
TTATGACTTC
CGGATTACAT
TTGGGAACGG
GCATATGAAT
GAGCGTGATC
50
100
150
200
250
300
45
301
351
401
451
501
551
601
651
701
751
801
GGTGCACTGG
AGCCGGTCGC
ATAAAACAGG
TACACAGGAT
ATCGGATCGC
ACGTCCTCAC
CTGATCTGCC
GCCAGATTGC
CAGCGTTCCA
TCTTAAACAA
CGTAGACGGC
AAGACATAAC
CCACAAACAT
CGCCGGACGT
TTCGAGCTCC
CGTGGACGGA
GATACCGTCC
ACGCCCTAGG
CGTCGCCAGG
TCGGTAATCG
AGTCAGAGTC
GTGTGCAGTC
GCAAGCCACG
CTGGAAGCGG
CCGGAGCGAG
CACTGGGCGA
TGGGGTAACC
ACAGGGTTGA
GTTGGCCACT
CAAGAGCCGC
CCCAGCATGG
GGGCTATCCC
GAGCATGCC
GTGGATGATT
GGGTGATCAA
TTTTTTGCAC
GCTGGCTGCC
TGTCTTCAAA
TGTCCTCCGA
CCACGTCCAG
CATAAAGACA
TCTATGACAG
CTGGCGCTTG
ATACCCGGGC
AGATTTGTGC
GGATCTTTGA
GGCCGTTAGA
CACACCGATC
CCACTGCCAA
CCAGAAGAGG
TGGGCCCAAT
GAAGTCGCCG
TAGTAAGCGA
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
CGGAAAAGAA
CGGCGGCTGG
TGGTGGTGCA
CTGCGCCTGG
GCTGGAGCTC
CACGCCAGCA
GGGCCATTGC
AGAGCGGCGA
GACGCCGCCT
CCCAAGGCAT
TGGCTGCATA
TGCGGTGTTC
GTTCATGTCG
GGGCCGGGCC
TCGATGGCCA
CTGTTGCGTG
GCCGCTACTG 50
AGTTTCCACC 100
GGCGCACCCG 150
ACCTGAAGA
TGGATCACCT
CGCCAGCCTG
CCCAGGGCAT
TGGCTGCATA
TG
ATACCCTCGT
TTCCATGTCG
GGGCCGGGCC
TCGATGGCCA
CGATTGGTTA
GCCGCTAGTG
AGTTTCCACC
GGCGCAGCCG
TTAGAGAGCC
CGGCGGCTGG
TGGTGGTGCA
CGCGACCTGA
TGGAGCTCGA
CACGCCAGCA
GGGCCATTGC
ATTCGGAACC
50
100
150
200
46
TGGATCACCT
CGCCAGCCTG
CCCAGGGCAT
TGGCTGCATA
ATTCGGTGAA
ATACCCTCGT
TTCCATGTCG
GGGCCGGGCC
TCGATGGCCA
CCTGTTGCGT
CGATTGGTTA
GCCGCTAGTG
AGTTTCCACC
GGCGCAGCCG
GACCTGAAGA
TTAGAGAGCC
CGGCGGCTGG
TGGTGGTGCA
CTGCGACCTG
TGGAGCTCGA
CACGCCAGCA
GGGCCATTGC
GAGAGCGGCG
50
100
150
200
ATGCGGCGTAGCGGGTTGGCGGCTGTCGGCTTGGCGGCTGTTCTCGGGCTGGGGCTTCTG
---------------TTTTCAGGGGACGGCAA-----CA-GGCTCGTACCTCAACATCAA
** *.* *:****::
*:
**** .*
..*:**:.
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
CTTGGCGGCTGCGCCGCGGATTTCCAGCCGATGGGAGCGGCCGTCGTCGAGCCGCGGTTG
CTTGGAGGATG----------------CCGGGGACAGCGGCCGTAC-------------*****.**.**
***. *. *********.
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
AACGACCGGGGACTGATCGCCGCCGACGGATTCGAGCTGCCGATGCGTTCCTGGCTGCCG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
GCGGACGGCAAGGTCCGGGCGGCGGTGGT-CGCCCT---GCATGGCTTCAACGACTATTC
---GAGCGCTAGGGCCGAGCGACGTTATGACTTCCGTTAGTAGGGGAA------C-AATC
** **:*** ***.***.** *.
* **
* * ** ::
* *:**
47
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
CAACGCCTTCGACGGCGC-----CGGCCGCGACTTCGCCGCCGCCGGCA---TCGCCACC
CG------TACAGTGCGCAAGCCCGGCCGG-ATTACATGGCCACCCGGATTGGCGCCACC
*.
*. * ****
****** * *:*. ***.** * *
*******
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
TACGCCT--------ATGACCAGCGCGGTTTCGGCGCCACCCGCGACCGCGGCGTATGGC
AATAGCGGGGGCTCTACGTTGGGAACGGAATCAGGCCG--TCGTGCGTGCAGCATTTGGC
:* . *
* *: .*..***::**.* *
** *. **.**.*:****
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
CGGGCACACCGACCCTGGTCAGCGACGCCCGCACCGCGGTCGAAATGGTGCGCCGACGCC
GGGGTAGCGCGCATATGAATTACGA-------------------GTGCTGAACCAAATC*** * . **.. .**.: :.***
.** **..**.*. *
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
ATCCCGGCGTCCCGGTCTATCTTCTGGGCGAAAGCATGGGTGGGGCGGTGGTGCT----AATCCG---------ACATACTATGGG--GAGAGCGTGATCGGTGCACTGGAAGACATAA
*: ***
:*:::**: ** **.***.**. ** **. ***:. :
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
----CACCGCGATGACCGGCCCCAATCCGCCCGAGGTCGCCGGCACCATCCTGGTCGCCC
CGCAAGCCACGGTGGATGA-----TTATACCCG-GGCAG-----------CCGGTCGCCC
..**.**.**.. *.
:*. .**** ** .*
* ********
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
CC-GCCGTCTGGGGCCGGCA--GGCC------ATGGGCTTCTTCCCGCGCGCC----GCC
ACAAACATCTGGAAGCGGGGGTGATCAAAGATTTGTGCATAAAA-CAGGCGCCGGACGTC
.* ..*.*****.. *** . *. *
:** **:*.::. *. *****
* *
CTGTGGATCACCTATACCCTCGTCCCCGGCATGGTCGTCCATCCGCCGCAGGATTTGGAC
CGGAGCGAGTTTTTTGCA--------CGGA----TC---TTTGATACACAGGATTTCGAG
* *:* .: : *:*.*.
***.
**
:* . .*.******** **
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
ATCCATCCATCCGACAACATCGAGATGCTGCGGGCGCTCGGCCGCGACCCGCTGGTCATC
CTCCCACTGG---------GCG------AGCTGGCTGCCGGCCGTTA-----------GA
.***.:* .
**
:** ***
****** *
.
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
AAGGGATCGCGGGTCGATGCGCTGGAGGGGTTGACCGACCTGATGGGCAGCGCGCTCG-ATCGGATCGCCG-----TGGACGGATGGGGTAACCTGTCTTCAAACACACCGATCACGTC
*: ******* *
** .* *.:*****:..* *:* * *:. .** **. *:**
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
----------------------------------ACGCCTGCCAGCA--TCTGCAAATCC
CTCACGATACCGTCCACAGGGTTGATGTCCTCCGACCACTGCCAACTGATCTGCCACGCC
** .******.*: *****.*. **
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
CGTCCCTGGTCC--TCTATGGCGCGCATGAGGAGGTGCTGCCA-CCCAAGCCGGTCGAGCTAGGGTTGGCCACTCCACGTCCAGCCAGAAGAGGGCCAGATTGCCGTCGCCAGGCAAGA
* :
* * ** ** * * * .**.:**.**** *:*. : ** :.***.* *.**
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
---------------CGGGCACTGAAGGAGTTCGA-----A----ACCGGC-----GGGC
GCCGCCATAAAGACATGGGCCCAATCAGCGTTCCATCGGTAATCGCCCAGCATGGTCTAT
****.*:.:..*.**** *
*
.**.**
.
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
GGCATGTCGTCGCCGTCTATCCCGACGGCTACCACATGCTGTTGCGTGACCTGAAGGGCA
GACAGGAAGTCGCCGTCTTAAACAAAGTCAGAGTCGGGCTATCCC-----CTGG--CG-*.** *:.**********::..*.*.* *:.. :*. ***.* *
***.
*
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
AACTGGTCGTCGACGACATCGTCGCCTGGATCGAAAACCCGAAGCTGCCGCTGGCCAGCG
--CTTGTAGTAAGCGACGTAGACGGCGTGTGC---------------------------** **.**...****.*.*:** * *: *
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_820
GCGCCGACCGCGCTCCAAGGGCCCTGCTCGCCTCCAAGTGA
-AGTCG------------------AGCATGCC--------.* **
:**: ***
Gambar 5.8 Hasil Penjajaran sekuen fragmen 820 Azospirillum sp. JG3
dengan Azospirillum sp. B510.
48
ATGCGGCGTAGCGGGTTGGCGGCTGTCGGCTTGGCGGCTGTTCTCGGGCTGGGGCTTCTG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CTTGGCGGCTGCGCCGCGGATTTCCAGCCGATGGGAGCGGCCGTCGTCGAGCCGCGGTTG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
AACGACCGGGGACTGATCGCCGCCGACGGATTCGAGCTGCCGATGCGTTCCTGGCTGCCG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
GCGGACGGCAAGGTCCGGGCGGCGGTGGTCGCCCTGCATGGCTTCAACGACTATTCCAAC
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
GCCTTCGACGGCGCCGGCCGCGACTTCGCCGCCGCCGGCATCGCCACCTACGCCTATGAC
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CAGCGCGGTTTCGGCGCCACCCGCGACCGCGGCGTATGGCCGGGCACACCGACCCTGGTC
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
AGCGACGCCCGCACCGCGGTCGAAATGGTGCGCCGACGCCATCCCGGCGTCCCGGTCTAT
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CTTCTGGGCGAAAGCATGGGTGGGGCGGTGGTGCTCACCGCGATGACCGGCCCCAATCCG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CCCGAGGTCGCCGGCACCATCCTGGTCGCCCCCGCCGTCTGGGGCCGGCAGGCCATGGGC
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
TTCTTCCCGCGCGCCGCCCTGTGGATCACCTATACCCTCGTCCCCGGCATGGTCGTCCAT
---------------------TGGATCACCTATACCCTCGTCGATTGGTTATTAG----********************* . * :*. *.*
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CCGCCGCAGGATTTGGACATCCATCCATCCGACAACATCGAGATGCTGCGGGCGCTCGGC
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
CGCGACCCGCTGGTCATCAAGGGATCGCGGGTCGATGCGCTGGAGGGGTTGACCGACCTG
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
ATGGGCAGCGCGCTCGACGCCTGCCAGCATCTGCAAATCCCGTCCCTGGTCCTCTATGGC
-AGAGCCTGGAGCTCGACGCCAGCCTGTTCCATGTC------------GGCCGC-----:*.**. *.**********:***:* : *: :.
* ** *
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
GCGCATGAGGAGGTGCTGCCA--------CCCAAG-------CCGGTCGAGCGGGCA-CT
----TAGTGCGGCGGCTGGCACGCCAGCACCCAGGGCATGGGCCGGGCCAGTTTCCACCT
::*:* .* **** **
****.*
**** * **
** **
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
GAAGGAGTTCGAAACCGGCGGGCGGCATGTCGTC-----------GCCGTCT-------GGTGGTGCAGGGCCATTGCTGGCTGCATATCGATGGCCAGGCGCAGCCGCTGCGACCTGG
*.:**:* : *.... ** *** ****.***:
****
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
ATCCCGACGGCTACCACATGCTGTTGCGTGACCTGAAGGGCAAACTGGTCGTCGACGACA
AGAGCGGCGATTCGGTGAACCTGTTGCGTGACCTGAAGA--------------------* . **.**. *. : *: ******************.
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
TCGTCGCCTGGATCGAAAACCCGAAGCTGCCGCTGGCCAGCGGCGCCGACCGCGCTCCAA
------------------------------------------------------------
Azo_sp_B510
Azo_sp_JG3_229
GGGCCCTGCTCGCCTCCAAGTGA
-----------------------
Gambar 5.9 Hasil Penjajaran sekuen fragmen 229 Azospirillum sp. JG3
dengan Azospirillum sp. B510.
49
50
membandingkan lipase A Ps. fluorescens dengan sesama lipase A dari Ps. fragi
yang hanya memiliki kemiripan 45%.
Analisis nukleotida dari kedua fragmen hasil ini juga dilakukan dengan
menggunakan software nucleotide BLAST dari NCBI. Azospirillum sp. JG3
merupakan bakteri yang diisolasi dari tanah dari golongan bakteri gram negatif.
Analisis nucleotide BLAST menunjukkan kemiripan ~90% untuk fragmen 230
bp dan ~70% untuk fragmen 829 pb (lampiran 5) dengan bakteri tanah gram
negatif lainnya, yaitu Pseudomonas sp, tetapi sayangnya enzim yang dikode
bukan dari golongan lipase melainkan merkuri reduktase dan AraC family
transcriptional regulator.
(A)
(B)
Gambar 5.10 Distribusi hasil BLASTing dari (A) fragmen 230 pb
(B) fragmen 829 pb.
51
Berikut ini adalah daftar kemiripan fragmen gen 230 pb dan 829 pb
dengan bakteri Pseudomonas sp.
Tabel 5.4 Hasil pensejajaran dengan BLAST dari fragmen 230 pb.
Deskripsi
Pseudomonas entomophila str. L48, kromosom,
sekuen lengkap
Pseudomonas putida HB3267, genom lengkap
Pseudomonas putida S16, genom lengkap
Pseudomonas putida GB-1, genom lengkap
Pseudomonas putida DOT-T1E, genom lengkap
Pseudomonas putida ND6, genom lengkap
Pseudomonas putida F1, genom lengkap
Pseudomonas putida BIRD-1, genom lengkap
Pseudomonas putida KT2440, genom lengkap
Pseudomonas protegens CHA0, genom lengkap
Pseudomonas protegens Pf-5, genom lengkap
Max
Score
EValue
274
2E-70
Max
Ident
(%)
90
260
255
248
246
246
246
242
237
210
210
3E-66
1E-64
2E-62
6E-62
6E-62
6E-62
7E-61
3E-59
4E-51
4E-51
88
87
86
86
86
86
86
86
85
82
Max
Score
EValue
271
241
230
226
226
6E-69
1E-59
2E-56
2E-55
2E-55
Max
Ident
(%)
76
74
74
73
73
menghasilkan enzim lain di samping lipase yang terdapat pada untaian DNA
52
kromosomnya. Hal ini tentunya memerlukan investigasi lebih lanjut. Kedua, dari
awal ada kontaminan bakteri lain yang terdapat pada kultur bakteri yang akan
diisolasi DNA kromosomnya. Dugaan terbesar adalah adanya Pseusomonas sp.
yang sama-sama merupakan bakteri tanah gram negatif. Dengan demikian untuk
penelitian selanjutnya perlu dilakukan uji kemurnian dari isolat bakteri
Azospirilium sp. JG3 seperti yang dilakukan oleh Nurosid et al. (2008) sebelum
dilakukan karakterisasi fragmen gen pengkode lipase maupun pengkode enzim
lainnya.
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Berdasarkan data yang telah diperoleh pada penelitian ini, maka dapat
disimpulkan beberapa hal berikut:
1.
2.
Pasangan primer AzoF3 (5 GGA TCA CCT ATA CCC TCG TC 3) dan
AzoR3 (5 CTT CAG GTC ACG CAA CAG 3) dapat mengamplifikasi
fragmen gen putatif lipase Azospirillum sp. JG3 dengan panjang fragmen
829 pb (0,8 kb) dan 230 pb (0,2 kb).
3.
sp. JG3
masing-masing memiliki kemiripan 55,59% (0,8 kb) dan 61,03% (0,2 kb)
dengan urutan nukleotida pengkode enzim asilgliserol lipase milik
Azospirillum sp. B510 (NC_013857).
6.2 Saran
Penelitian ini masih memerlukan investigasi lebih lanjut mengenai
kecocokan primer dengan cetakan DNA Azospirillum sp. JG3 dan disarankan
kedepannya untuk menggunakan degenerate primer yang disusun berdasarkan
urutan asam amino dari beberapa lipase bakteri. Bisa juga dalam penelitian
digunakan primer yang tetap disusun berdasarkan urutan DNA pengkode
asilgliserol lipase milik Azospirillum sp. B510 di mana urutan primer diambil
pada daerah yang terletak di antara daerah conserve.
53