BIOCHIMIE METABOLIQUE ET STRUCTURALE

(CHIM(CHIM-F-202)

Mme. Vronique Kruys &

Mr. Michel Vandenbranden

Syllabus ralis par Penninckx Sbastien, Roth Aurlie et

Grard Phidline pour lanne acadmique 2010 - 2011

Universit Libre de Bruxelles

FACULTE DES SCIENCES
1

Vronique Kruys
Laboratoire de Chimie biologique
IBMM, Gosselies
Tel : 02 650 98 04 ou 01
Mail : vkruys@ulb.ac.be

Michel Vandenbranden
Laboratoire de Structure et fonction
des membranes biologiques
Dpartement de Chimie
Tel : 02 650 53 66
Mail : mvbrand@ulb.ac.be

Ce syllabus a t ralis partir de nos notes du cours de Biochimie

mtabolique et structurale (CHIM-F-202), dinformations contenues dans
les livres de rfrence ou autres. Des erreurs de comprhension, des
fautes dorthographe ou des imprcisions peuvent sy tre glisses.
Restez critique !

Grard Phidline, Roth Aurlie & Penninckx Sbastien

THEME I : BIOCHIMIE STRUCTURALE ..

A) Description des macromolcules biologiques

Chapitre I : Les lipides

Chapitre II : Les oses
Chapitre III : Les acides nucliques ...

4
11
16

B) Biochimie des Protines ...

29

Chapitre I : Introduction .
Chapitre II : Structures des protines .
Chapitre III : Le reploiement des protines
Chapitre IV : La diversit des protines
Chapitre V : Les modifications post traductionnelles .
Chapitre VI : Analyse des protines ..
Chapitre VII : Les protines enzymatiques ...
Chapitre VIII : Systmes hormonaux et de rgulation ...

29
30
34
38
42
47
59
64

THEME II : BIOCHIMIE METABOLIQUE .

69

A) Catabolisme du glucose .

69

Chapitre I : Introduction .
Chapitre II : La Glycolyse ..
Chapitre III : Le cycle de Krebs .....
Chapitre IV : La chaine respiratoire
Chapitre V : La synthse dATP ....

69
72
81
91
102

B) Anabolisme du glucose et drivs .

113

Chapitre I : La gluconogense ...

Chapitre II : Le mtabolisme du glycogne.
Chapitre III : La voie des pentoses phosphates ...
Chapitre IV : Le mtabolisme des acides gras ....

113
123
134
141

EXAMENS DES ANNEES PRECEDENTES .

156

THEME I : Biochimie Structurale

A) Description des macromolcules biologiques
Chapitre 1 : Les lipides
Ce sont des molcules organiques insolubles dans leau, consistance huileuse ou
graisseuse. On peut les extraire par des solvants non polaires tels que le benzne.
Leurs fonctions sont multiples :
* Ce sont les composants principaux des membranes
* Il assure le stockage dnergie
* Il assure la transmission de signaux intra et inter - cellulaires (rle de messager
molculaire)
Leur classification se fait sur 2 critres : leur caractre saponifiable et leur polarit.

LIPIDES

Saponifiable

Polaire

Non - Saponifiable

Non polaire

Le caractre saponifiable indique que le lipide a t form partir dun acide gras. On
peut recrer un sel de cet acide gras en hydrolysant le lipide par une base forte.
Un acide gras est une molcule organique de la forme :
Saturs :
Insaturs:

CH3 (CH2) n COOH

o n est compris entre 4 et 36
CH3 (CH2) n CH = CH - (CH2) n - COOH

La premire partie de la molcule justifie ladjectif gras de son nom car plus la chaine
carbone est longue, plus elle est hydrophobe et donc assimilable une graisse. La fonction
acide carboxylique va donner le caractre acide au nom de la molcule.
Dans le cas des acides gras insatur, la double liaison va apporter une particularit la
molcule. Le plus souvent ce type de liaison est cis chez les acides gras, ce qui procure
une forme coude a la molcule. De manire gnrale, la prsence dune double liaison
complexifie larrangement spatial des molcules chimiques.
Il faut encore prciser qu pH physiologique, ces acides gras sont prsent sous leur forme
ionis (forme carboxylate).

1.1. Lipides saponifiables non polaires :

a. Les triacylglycrols : Esters forms partir de glycrol et de 3 acides
gras. Ils sont utiliss dans la fabrication des savons par
la saponification :
Triglycride + base forte
glycrol + savon (sels
dacide gras).
Sur limage ci contre, les 3 acides gras sont diffrents,
on a donc un carbone asymtrique. Cest trs important
dun point de vue biochimique puisque les molcules
ont des proprits diffrentes selon quelles soient de
configuration Lvogyre (L) ou Dextrogyre (D).
Les triglycrides reprsentent la famille des lipides la
plus abondante et forment un matriel de rserve chez
les animaux. Ceux-ci se distinguent les uns des autres
par la nature et la position des 3 acides gras qui
estrifient le glycrol. Ceux qui comportent le mme acide gras sur les trois
positions du glycrol sont appels triglycrides simples, les autres, mixtes.
Comment expliquer lexistence de graisses ou dhuiles temprature ordinaire ?
La conformation des acides gras saturs, dont la chane hydrocarbone est flexible,
est trs variable cause de lextrme libert de rotation des simples liaisons. Dautre
part, les acides gras insaturs prsentent une ou plusieurs angulations rigides dues
aux doubles liaisons.
Les graisses indiquent une saturation de la chaine carbone. Il y a une grande
possibilit dinteractions de Van der Waals ( courtes distances) entre les chanes
hydrophobes des diffrents acides gras. Ceci implique que les graisses sont solides
temprature ordinaire.
Inversement, les huiles indiquent la prsence dinsaturations. Les interactions de
Van der Waals sont diminues par de mauvais contacts entre plusieurs chanes (
cause de leur forme coude), donc il y a moins de cohsion entre les molcules. Ce
qui implique que les huiles sont liquides temprature ordinaire.
Le rle biologique des triacyglycrides est multiple :
* Stockage nergtique, existent dans la plupart des cellules vgtales et animales
sous forme de gouttelettes microscopiques dans des cellules spcifiques
(adipocytes ou tissus consommateurs dnergie)
* Ils contribuent la structure des membranes cellulaires.
* Ils jouent un rle de protection la surface de beaucoup dorganismes (phoques,
pingouins)

b. Les crides : Esters forms partir dun acide gras et dun alcool gras.
Ce sont les cires, composs non polaires et trs hydrophobes,
rsultant de lestrification de monoalcools gras longues
chanes (16 34 C) ou de strols par des acides gras
suprieurs (14 36 C).
Chauffes, les cires sont molles et souples, mais elles
durcissent en refroidissant.
Dans lorganisme, leurs fonctions sont lies leur caractre
trs hydrophobe. Elles sont trs abondantes dans le plancton
(o elles constituent du matriel de rserve). Elles assurent
aussi un rle de protection la surface de la peau, de la
fourrure (laine) et des plumes chez les animaux, des feuilles
et des fruits chez les vgtaux (cuticule).
Ex : - cire dabeille : ester palmitique dalcool gras
- Les plumes de canard sont recouvertes de crides, ce qui explique pourquoi il
nest pas mouill aprs avoir plong dans leau (rle dimpermabilisant)

1.2. Lipides saponifiables polaires :

a. Les phosphoglycrides : Lipides constitus dune molcule de glycrol
estrifie deux acides gras et greffe un
groupement phosphate.
Ce groupement phosphate modifie la polarit du
lipide (devient plus hydrophile quun simple
triacyglycride)
Le plus connu des phosphoglycrides est la
phosphatidylcholine dans laquelle le
trimthylthanolamine (= Choline) est rattach au
groupement phosphate par un
lien phosphoester. Grce lajout de la Choline, le lipide rsultant obtient une
extrmit polaire.
A cause de leur caractre amphipatique, les phosphoglycrides jouent un rle dans
la transmission des signaux intracellulaires et sont les constituants majeurs des
membranes cellulaires (bicouche lipidique).
b. Les sphingolipides : Composs forms partir de la
sphingosine (acide gras 18 carbones). Cet acide gras a
une particularit notable : une double liaison trans .
Quand celle-ci est sature, on parle alors de
dihydrosphingosine.
De manire gnrale, la structure de base dun
sphingolipide est la Cramide .
Lacide gras se fixe sur la fonction amine de la sphingosine
pour former un lien amide. La cramide est un

intermdiaire dans la formation de tous les sphingolipides. On ne le trouve pas tel

quel dans la membrane cellulaire.
Il existe 3 grands types de sphingolipides :
* Sphyngomyline : Cest le rsultat de lestrification dun groupement
hydroxyle de la cramide par de la phosphorylcholine.
Cette molcule est trs importante au niveau du cerveau, cest un lment
majeur des membranes entourant les fibres nerveuses (la gaine de myline).
Cette gaine permet un isolement lectrique de laxone du neurone, ce qui
augmente la vitesse de conduction de linformation.
Maladie : La sclrose en plaque est une maladie qui dtruit les gaines de
myline. Cette destruction est lie un dfaut dans la production de la
sphingomyline.
* Glycosphingolipides neutres (= crbrosides) : Il sagit de sphingolipides
comprenant leur extrmit polaire un ose. Le lien (dit ther ou osidique)
est effectu entre la fonction alcool port par le dernier carbone de la
sphingosine et le sucre.
Ce sont des constituants importants de la membrane cellulaire. Lose y est
toujours orient vers la surface.
* Glycosphingolipides acides (= gangliosides) : Glycosphingolipides neutres
portant plusieurs oses (relis entre eux par des liens thers) dont lun porte
une fonction carboxylate (COO-).
La succession des oses dans les gangliosides dfinie le groupe sanguin
humain (cfr. B) Biochimie des protines)
Maladie : Syndrome de Tay-Sachs. Cette maladie est lie labsence dans
lorganisme de l'enzyme hexosaminidase A, responsable de la dgradation du
ganglioside GM2. Du coup, on observe une accumulation de ce lipide dans le
cerveau, ce qui provoque un retard mental, une ccit, une motricit rduite
et enfin la mort vers 3 ans.
Si on sintresse lorganisation des lipides dans leau, on observe 2 possibilits :
Pour les acides gras, on observe la
formation dune micelle

Pour les phospholipides, on observe la

formation dune bicouche lipidique :
Le liposome. Cest la structure
thermodynamiquement la plus stable.

Le liposome fait penser lorganisation de la membrane cellulaire. En effet, celle-ci est

galement constitue dune bicouche lipidique. On la dcrit comme une mosaque fluide car
ses lipides constitutifs bougent horizontalement. Elle possde quelques caractristiques :
o Impermable aux ions car la partie interne est compltement hydrophobe,
cependant il existe des protines spcifiques transporteuses dions capable
de faire passer ceux-ci de lautre ct de la membrane.
o Laisse passer leau par effet de concentration
o Permable aux molcules hydrophobes polaires (telles que les hormones
strodes), car il y a des interactions possibles avec la partie hydrophobe qui
forme le cur de la membrane.
o Trs fine (5-6 nm)
o Flexible, fluide
o Isolant lectrique (lisolation augmente avec la quantit de lipides)
Revenons sur cette dernire proprit, la proportion des lipides et des protines est
variable et va spcialiser la membrane :
o 20% de lipides pour les membranes des mitochondries (peu isolant

favorise les changes).
o 80% de lipides dans les gaines de myline (isolant
dfavorise les
changes).

1.3. Lipides non saponifiables:

a.

Les terpnes : Substance naturelle comportant souvent un gout ou une odeur et

dont le polymre de base est lisoprne (= 2-mthyl 1-3 butadine). Il existe une
petite nomenclature chez ce type de lipides :
Un monoterpne rsulte de la polymrisation de 2 isoprnes
Un sesquiterpne rsulte de la polymrisation de 3 isoprnes
Un diterpne rsulte de la polymrisation de 4 isoprnes
Ex : le limonne (qui a une odeur de citron) est un monoterpne
Prenons un exemple plus concret : Le Rtinol (terpnes avec une fonction alcool
terminale) aussi appel vitamine A . La fonction alcool de celui-ci peut tre
oxyde en aldhyde et ainsi devenir du rtinal o toutes les doubles liaisons sont

trans. Grce laction de la rtinal isomrase, on va transformer la double liaison

trans C11 = C12 en cis. Ce 11 cis-rtinal en se combinant avec lopsine va donner la
rhodopsine (un pigment protique photosensible prsent dans la partie externe
des btonnets de la rtine).
Les doubles liaisons du cis rtinal sont conjugues : il y a donc une dlocalisation
des lectrons entre de nombreuses liaisons, ce qui permet une excitation par la
lumire. Il absorbe donc la lumire sous certaines longueurs dondes (rassembles
dans le visible). En prsence de lumire, la liaison 11 cis-Rtinal subit une
photoisomrisation pour donner le trans Rtinal. Ce changement de
configuration spatial (+/- 5 Angstrom) va induire un potentiel lectrique transmis
par les cellules nerveuses vers le cerveau.
La carence en vitamine A entrane un dveloppement anormal des os et du
systme nerveux central, une dgnrescence des reins et de diffrentes glandes
(strilit). Chez les adultes, un signe prcoce de la carence en vitamine A est la
ccit nocturne ou dficit dadaptation lobscurit.
b. Les strodes : Substances constitues dun strol (structure de base) auquel
sajoute une chaine carbone. Ex : Cholestrol, testostrone,
La structure de base, le strol, est
reprsente ci-contre. Le ol de strol
provient de la prsence dune fonction
alcool sur le carbone 3 du cycle A.
Le cholestrol est le strol le plus connu.
Il possde une structure compacte - rigide
et est insoluble dans leau.
Cest un prcurseur de nombreux autres strodes animaux (acide biliaire,
strogne, ). Notons que le cortisol et la testostrone, deux drivs du
cholestrol, ont une particularit qui les distingue des autres. Leur fonction alcool
a t oxyde en une fonction ctone.
Le cholestrol est prsent en grande partie dans la membrane cellulaire. En
interagissant avec les sphingolipides, il peut conditionner la fluidit de celle-ci.
Etant une molcule trs rigide, le cholestrol rduit la possibilit quont les lipides
de bouger les uns par rapport aux autres.
Intressons nous aux apports de cholestrol dans lorganisme. Celui-ci peut venir
des aliments que nous mangeons. Il est alors absorb au niveau de lintestin puis
dirig vers le foie afin que celui-ci lexpdie vers les organes appropris. A cot de
cela, toutes les cellules nucles synthtisent du cholestrol (essentiellement le
foie et les organes sexuels). Afin dtre transport, celui-ci est estrifi par un
acide gras. Il devient alors un cride.
Il est transport par des particules lipoprotiques (complexe lipide protine)
appeles LDL . Celles ci contiennent le cholestrol estrifi lintrieur. Il est
englob par des phospholipides hydrophobes (orients vers le cur pour
interagir avec le cride, lui-mme trs hydrophobe) et hydrophiles (orients vers
lextrieur).

Il existe en fait plusieurs moyens de transport de ce type :

o Chylomicrons : Ils transportent des triglycrides entre lintestin et les
diffrents organes via la circulation sanguine. Ce sont les plus grosses
lipoprotines (environ 1m de diamtre).
o VLDL : LDL en devenir
o LDL : transport du mauvais cholestrol. Sur la surface des cellules absorbant
celui-ci, il y a des rcepteurs qui interagissent avec ces complexes
lipoprotiques. Les LDL peuvent dverser leur cholestrol lintrieur de la
cellule sils ont reconnu le rcepteur correspondant. La prsence et le taux de
ces derniers sont donc trs importants ; si les cellules nen possdent pas, le
cholestrol se dpose nimporte o. A terme, cela peut provoquer
lartriosclrose et les risques dinfarctus lis. Enfin, la quantit de
rcepteurs nest pas fixe, elle dpend des besoins.
o HDL : Particule plus petite que le LDL et de nature diffrente (protines
diffrentes). Il soccupe du retour du bon cholestrol de membranes
endommages vers le foie ou autres cellules spcifiques.
Ainsi, un taux lev de LDL avec un faible taux de HDL indiquent des risques
dathrome.
De manire gnrale, les strodes sont trs nombreux car ils diffrent par le
nombre et la position des doubles liaisons, le type, le nombre et la position des
substituants, leur configuration ou par rapport au noyau (voir plus loin),
ainsi que par la configuration des cycles les uns par rapport aux autres.
c. Les Prostaglandines, Thromboxanes, Leukotrines : Ce sont les produits de la
dgradation de phospholipides membranaires en acide arachidonique par une
phospholipase (PIcA2). Celle-ci est active par un signal extracellulaire via un
rcepteur. On ne retrouve donc pas ces lipides tout le temps dans les cellules car
ils ne sont secrts que lorsque ce signal extracellulaire a t activ.
A cause de leurs longues chaines carbones, ce sont des molcules hydrophobes.
Elles sont aussi trs recourbes sur elles-mmes cause de leurs nombreuses
liaisons insatures.
Elles ont une activit biologique de nature hormonale ou rgulatrice.
A faible dose, elles abaissent la pression sanguine. Ces molcules sont galement
impliques dans les phnomnes inflammatoires. Les anti-inflammatoires
empchent en fait la libration de larachidonate, ce qui rend impossible la
synthse de prostaglandine et diminue donc linflammation.
Laspirine (acide actylsalicylique) bloque la synthse des prostaglandines, ce
qui fait disparaitre la sensation de douleur.

10

Chapitre 2 : Les oses

Les oses ou glucides (encore appels hydrates de carbone ) sont de la forme Cn(H2O)n Ils
ont de nombreux rles biologiques dont ceux de rserve nergtique (amidon, glycogne),
de lubrifiants et de structure (la cellulose constitue les parois des cellules vgtales).
Un ose est donc un monomre constitu dune molcule de sucre (de 3 8 C) avec des
fonctions organiques particulires (abondance de groupements hydroxyles, de fonctions
ctones ou aldhydes). De manire gnrale, les fonctions alcools (groupements polaires)
vont donner la possibilit dinteractions avec leau.
On diffrencie les glucides par le nombre de carbones qui les constituent (ex : pentose,
triose, ) et par leurs fonctions :
Ose + fonction aldhyde = aldose
Ose + fonction ctone = ctose
On divise les glucides en 2 classes :

2.1. Les oses simples ou monosaccharides :

Ce sont les aldoses et ctoses de 3 8 carbones.
Pour des questions de simplicit, ces oses sont classs selon le nombre de carbones de leur
molcule :
o 3 C : trioses
o 4 C : ttroses
o 5 C : pentoses
o 6 C : hexoses
o 7 C : heptoses
o 8 C : octoses
Les aldoses sont connus pour tre des molcules rductrices. Cette proprit est utilise
pour les distinguer des ctoses grce la raction de Fehling.

Le rsultat de ce test est rapide. En effet, la liqueur de Fehling (ractif de dpart : Cu2+) est
initialement bleue et prcipite en un dpt de couleur rouge brique (formation doxyde de
cuivre) uniquement en prsence d'une fonction aldhyde.
Si on sintresse aux proprits physiques, les oses simples ont des proprits de chiralit
due la prsence de carbones asymtriques. Pour rappel, si on a n carbones asymtriques,
on a au maximum 2n stroisomres qui ont des proprits physico-biologiques
diffrentes, notamment la manire dont ils dvient la lumire polarise. Les
monosaccharides sont reprsents en projection de Fischer dont les rgles sont simples :
o Le carbone le plus oxyd est mis au-dessus
o La numrotation des carbones, ce fait partir du carbone le plus oxyd.
o Pour dterminer le caractre D ou L, on observe le carbone asymtrique le
plus loign du carbone le plus oxyd:

11

D si le groupement hydroxyle est droite

L si le groupement hydroxyle est gauche
Prenons un exemple : Glycraldhyde (sucre le plus simple)

Ces 2 molcules sont des nantiomres optiques qui se distinguent par la position du
groupement hydroxyle sur le carbone asymtrique. On arrive les reconnaitre en
observant leur manire de dvier la lumire (le D-glycraldhyde fait tourner le plan de
polarisation vers la droite alors que le L-glycraldhyde le fait tourner vers la gauche). De
manire gnrale, on observe que lvolution a slectionn plutt les oses de configuration
D.
Il faut aussi prciser que sil ny a pas de carbone asymtrique, il ny a pas de configuration
L ou D.
A cot de cette reprsentation de Fischer, il existe aussi celle de Haworth. On passe de la
premire la deuxime en faisant une cyclisation intramolculaire. Concrtement, le
doublet de loxygne du groupement hydroxyle attaque le carbone le plus oxyd. Ainsi on
forme un hmiactal (si on a affaire initialement un aldose) ou un hmictal (si on a
affaire initialement une ctose). Nanmoins dans les deux cas, on cre un carbone
asymtrique au niveau du site de la cyclisation avec la rapparition des proprits de
chiralit. Dans ce cas, la dtermination de la configuration
D ou L est diffrente. Ainsi, si le groupement CH2OH du
carbone 6 est situ au dessus du plan, lose est de
configuration D. Dans le cas contraire, il est L. Le
groupement hydroxyle du carbone asymtrique sert
dterminer le caractre ou . Si ce groupement est en
dessous du cycle, lose est . Dans le cas contraire, il est .
Ex : Le D - Glucopyrannose (ci-contre)
A partir des cycles 6 carbones, il est ncessaire de faire la distinction entre deux types de
cyclisation. En effet, on a la possibilit de former des cycles 5 ou 6 sommets.
Si le groupement hydroxyle du carbone 5 ragit, on forme un pyrannose (htrocycle 6
atomes). Si le groupement hydroxyle du carbone 4 ragit, on forme un furannose
(htrocycle 5 atomes). Ces noms sont donns par homologie avec les noyaux organiques
pyranne et furane.
Bien que la formation de ces deux formes soit possible, on observe en gnral une
prdominance pour lune ou lautre. Cest le cas pour le glucose qui est prsent
majoritairement sous sa forme pyrannose car celle-ci minimise sa tension cyclique.

12

La configuration ou dun ose nest pas dfinitive. En effet, les sucres peuvent passer de
lun lautre par le phnomne de mutarotation. Ce passage de lun lautre ncessite
absolument le passage par la forme linaire du sucre. Limpossibilit de passer par cette
intermdiaire implique donc labsence de mutarotation. Il faut encore prciser que la
possibilit de changer de configuration par ce phnomne rvle un pouvoir rducteur de
ces composs.

2.2. Les oligosides :

A) Les diholosides (disaccharide) :
Ce sont les premiers types dosides. De manire gnral, un oside est une molcule
forme par lassociation dun alcool et dun (ou deux) sucre(s).
Lhmiactal et lalcool ragissent ensemble (ractivit du groupement hydroxyle de
lhmiactal avec lhydrogne de lalcool)
pour former un lien dit osidique ou
ther .
Ex : En faisant ragir le glucopyrannose
avec du mthanol, on obtient le Dmthylglucoside (ci-contre).
On remarque que le carbone anomrique
est encore asymtrique. Ainsi, les rgles de
configuration - restent applicable, tout comme celles pour D et L.
Cet exemple illustre aussi lexception pour la mutarotation des oses. En effet, il ny a
plus de mutarotation possible aprs la formation du lien ther car le passage la
forme linaire est impossible (la liaison osidique est trop stable pour tre rompue).
On pourrait donc dire que les osides ne subissent pas de mutarotation mais il existe
des exceptions. Si on considre que deux cycles sassocient ensemble et que le 2e
carbone anomrique est libre, alors
la mutarotation du 2e cycle est
possible.
Ex : Le maltose (ci-contre) la
possibilit de faire cette
mutarotation du 2e cycle.
Les diholosides sont en fait des disaccharides, soit la combinaison de deux oses
simples. En gnral la combinaison de ces cycles se fait par une liaison entre le
carbone anomrique du cycle 1 (C1) et le carbone n4 du 2e cycle. Cest le cas du
maltose (plus haut) qui est en fait la runification de deux glucopyrannoses.
Etudions un cas particulier : Le saccharose. Il sagit de lassociation dun glucose et
dun fructose (formation dun actal). Cest un glucide extrait de la canne sucre
ou de la betterave. On observe dans ce disaccharide, la prsence dune liaison 11
o les 2 carbones anomriques sont impliqus. Ainsi, le saccharose ne sait pas faire
de mutarotation. De ce fait, il nest pas rducteur.

13

B) Les polyosides (polysaccharide) :

Ce sont des substances de poids molculaire trs lev, rsultant de la
polymrisation de plusieurs oses (de 100 1000) et de taille trs variable.
Leurs rles sont multiples:
- matriel de rserve nergtique
- constituants de parois cellulaires (vgtaux)
- lubrifiant de cartilages dans les articulations
Il y a deux catgories de polysaccharides : les homopolyosides (un seul monomre
rpt plusieurs fois) et les htropolyosides.
1. Les homopolyosides :
a. Lamidon
Cest un matriel de rserve stock notamment dans les graines et les racines
des plantes. Il est constitu de deux homopolymres : lamylose (20%) et
lamylopectine (80%).
Lamylose : Comme la cellulose, elle est constitue dunits de glucose
(glucopyranose) lies entre elles par une liaison (1- 4). Cette liaison donne
une structure compacte la molcule.
Lamylopectine : La constitution des chanes est analogue celle de lamylose
mais la structure densemble de la molcule est beaucoup plus complexe.
Il y a plusieurs centaines de chanes, comportant chacune 20 25 units de
glucose lies par des liens (1-4), ces chanes tant runies selon un schma
ramifi par des liaisons glycosidiques de type (1-6) une chane principale
entoure en hlice. Cela donne une molcule compacte qui mne la
formation de granules. Il y a environ un embranchement tous les 12 30
oses.
Ainsi, lamidon est constitu de 2 homopolymres compacts qui vont
minimiser lespace. Ceci est assez pratique puisquil constitue les rserves
nergtiques principales des vgtaux.
b. Le glycogne
Il est produit et stock par les animaux pour constituer une rserve
nergtique (foie, muscles). Il correspond lamidon chez les cellules
vgtales. Structuralement, Il est analogue lamylopectine mais en plus
compact (structure hlicodale) et avec des ramifications plus frquentes
(tous les 10 glucoses).
c. La cellulose
Cest le polysaccharide de structure de la paroi cellulaire le plus abondant du
rgne vgtal (50% du carbone de la biosphre).
Cest un polymre linaire du D-glucose en (1-4). Le type de liaison est la
seule diffrence avec lamylose, mais cela a pour consquence la formation de
trs longues chanes (10000 glucoses).

14

Les fibres de cellulose sont trs diffrentes de lamidon du point de vue

structural : chane linaire et structure plane. Les fibres interagissent entre
elles par des liens hydrognes et par des interactions de Van der Waals entre
les carbones, du fait de la proximit des groupements. Ces interactions
entranent la rigidit et la rsistance de ces molcules (ex : rigidit du bois).
Le tube digestif de la plupart des mammifres ne scrte pas denzymes
capables dhydrolyser les liaisons (1-4), ils nassimilent donc pas la
cellulose. Seuls les ruminants utilisent la cellulose comme aliment grce des
bactries du rumen qui synthtisent des cellulases, capables dhydrolyser la
cellulose en D-glucose (molcule assimilable par lorganisme).
d. La chitine
La chitine est un homopolymre de N-actyl-D-glucosamine (glucose
modifi) liaison (1-4) (semblable la cellulose).
Cest un lment majeur de lexosquelette (carapace) des insectes et des
crustacs. Chez ces derniers, la duret de la carapace provient de
lincorporation de CaCO3 dans la matrice de chitine.

2. Les htropolyosides :
Les principaux reprsentants de cette famille de glucides sont les
glycosaminoglycannes (polysaccharide). On les retrouve le plus souvent
associs des protines dans le cartilage. Les glycosaminoglycannes
hyaluronates (drivs de lacide hyaluronique) sont lis aux protines par des
liaisons osidiques. Celles ci peuvent tre N-glycosidique si li l asparagine
ou O-glycosidique si li la srine ou un autre acide amin contenant des
fonctions alcools.
Dans le cartilage, ces structures fortement hydrates sont enveloppes dans un
rseau de fibres de collagne. Elles librent de leau (quelles rabsorbent par
aprs) sous leffet dune compression. Cette hydratation rversible donne au
cartilage sa capacit amortir les chocs.
Lautre grand reprsentant de cette famille est le peptidoglycanne. Celui-ci est
constitu dune fibre dacide hyaluronique de quelques milliers dunits
disaccharidiques (4000 40 000 angstrms) ainsi que dune centaine de core
proteins , chacune associe 50 polymres de sulfates de kratane ou de
chondrotine
Ces composs complexes sont la base de la paroi bactrienne. Celle-ci est
rigide grce au fait que les protoglycannes forment des filets entre eux.
Ces composs dterminent aussi le gram de la bactrie :
* Gram positif = Peptidoglycane avec pontage par un pentaglycocolle
* Gram ngatif = Peptidoglycane avec partage direct. Un simple lien amide
lie les deux ttrapeptides.

15

Chapitre 3 : Les acides nucliques

Les acides nucliques constituent le support de linformation gntique :
- LADN, Acide dsoxyribonuclique, constitue le gnome
- LARN, Acide ribonuclique, permet et rgule le flux de linformation gntique : celui-ci
est transmis via des ARN messagers depuis les gnes (ADN) jusquaux protines.

3.1. lments constitutifs :

Ce sont des nuclosides lis entre eux par des groupements phosphates.
* Le sucre : Cest un pentose, soit le 2-dsoxy--D-ribofuranose (pour lADN), soit le
-D-ribofuranose (pour lARN). La diffrence entre ceux ci rside dans le fait que le
dsoxyribose ne possde pas de groupement hydroxyle sur son carbone
2contrairement au ribose.
Notation : Les carbones de lose sont nots pour ne pas les confondre avec ceux
de la base (voir plus loin).
* Un nucloside : Cest une entit compose dune base et dun ose relis par une
liaison -N-glycosidique, cest--dire une liaison entre le N9 de la base purique et le
C1 du pentose ou une liaison entre le N1 de la base pyrimidique et le C1 du pentose.
Ces bases sont des cycles aromatiques de 2 types : - des purines
- des pyrimidines

Attention, si on considre les quatre units nuclosidiques de lARN, les noms deviennent
ladnosine, la guanosine, la cytidine et luridine.

Par extension, les quatres units nuclosidiques de lADN sont appele dsoxyadnosine,
dsoxyguanosine, dsoxycytidine et thymidine.
16

Notons que la dsoxyadnosine et la dsoxycytidine peuvent adopter une conformation syn

ou anti et peuvent passer dune conformation lautre en effectuant une simple rotation
autour du lien -N-glycosidique. Les deux autres composs nont quune conformation anti
cause dun encombrement strique entre le dsoxyribose et le carbonyle en C-2 qui
empche cette rotation.
* Les nuclotides : Un nuclotide est un nucloside uni un ou plusieurs groupes
phosphates par une liaison ester sur le carbone 5 du sucre, ou plus rarement sur le carbone
3.
Ce sont les units de base de lADN : dsoxyadnylate (dAMP), dsoxyguanylate (dGMP),
dsoxycytidylate (dCMP) et thymidylate (dTMP), et de lARN.
Afin de fixer les ides sur la nomenclature, voici un tableau rcapitulatif :

Base

Ribonucloside

Dsoxynucloside

Nuclotide ARN:
Ribonucloside 5' monophosphate

Nuclotide ADN:
Dsoxyibonucloside 5'
monophosphate

Abrviations des
Ribonucloside 5'phosphate
Mono

Di

Tri

Purines
Adnine

Adnosine

Dsoxyadnosine

Adnosine 5'-monophosphate
ou Acide adnylique

DsoxyAdnosine 5'-monophosphate
ou Acide Dsoxyadnylique

AMP

ADP

ATP

Guanine

Guanosine

Dsoxyguanosine

Guanosine 5'-monophosphate
ou Acide guanylique

DsoxyGuanosine 5'-monophosphate
ou Acide Dsoxyguanylique

GMP

GDP

GTP

Cytidine

Dsoxyciytidine

Citydine 5'-monophosphate
ou Acide cytidylique

DsoxyCitydine 5'-monophosphate
ou Acide Dsoxycytidylique

CMP

CDP

CTP

Thymidine

Thymidine 5'-monophosphate
ou Acide thymidylique

DsoxyThymidine 5'-monophosphate
ou Acide Dsoxythymidylique

TMP

TDP

TTP

Uridine 5'-monophosphate
ou Acide uridylique

DsoxyUridine 5'-monophosphate
ou Acide Dsoxyuridylique

UMP

UDP

UTP

Pyrimidines
Cytosine

Thymine

Uracile

Uridine

LADP et lATP sont forms par addition de groupes phosphates lAMP. Ceux-ci
forment alors une liaison anhydre (plus nergtique quune liaison ther) o est
stocke lnergie.

17

Les ATP-GTP sont des molcules riches en nergie, du fait de leur hydrolyse trs
exergonique, utilises dans les ractions ncessitant un apport nergtique :
LATP est utilis dans le mtabolisme et la GTP joue un rle dans la glycolyse et la
synthse protique.
La raction globale entre ces deux entits est :
GDP + ATP GTP + ADP

3.2. Structure de lADN et de lARN :

Les nuclotides de lADN et de lARN sont lis par des liaisons covalentes entre le groupe
phosphate 5 dun nuclotide et le
groupement hydroxyle 3 dun
autre nuclotide. Il sagit donc
dune liaison 3-5 phosphodiester.
Cette ossature est constitue dune
alternance de pentoses et de
phosphates, avec une charge
ngative
sur
chaque
pont
phosphodiester. Cela rend la
chane polaire.
Dans lADN, lextrmit 5 est en
gnral attache un phosphate et
un groupement hydroxyle libre est
fix lextrmit 3.
Par convention, on donne la squence dans le sens 5-3, cest aussi le sens dans lequel la
synthse seffectue.

3.3. Clivage des acides nucliques :

A) Mthodes chimiques
1) Hydrolyse acide complte de lADN et de lARN
Cette mthode consiste traiter un acide nuclique en milieu acide trs
concentr (HCL 12M) et le chauffer. Tous les liens phosphodiesters et Nglycosidiques entre les bases et les riboses se rompent.
ADN/ARN + H+ phosphates + base + ose
2) Hydrolyse acide mnage de lADN (dpurination)
Dans des conditions plus douces (pH 3) seules les liaisons N-osidiques des
purines sont hydrolyses.
ADN + H+ base + rsidu apurin
Cette raction a lieu grande vitesse chez les purines. Elle est par contre trs
lente, voire impossible chez les pyrimidines car le doublet dlectrons est
dlocalis par la fonction carbonyle

18

3) Hydrolyse basique mnage de lARN

Cette mthode consiste traiter de lARN
avec une solution de NaOH 25C. Il y a
alors rupture des liens phosphodiesters.
Cest le groupement hydroxyle 2 qui est
impliqu dans ce processus. Comme ce
groupement est absent de lADN, seul lARN
est sensible cette hydrolyse. Cela permet
de sparer lADN de lARN.
Lanion OH- vient dprotonner le groupement
hydroxyle 2, ce qui laisse un site 2-O- trs
nuclophile qui va pouvoir attaquer latome
de phosphore + du pont phosphodiester
voisin. Cela entrane la rupture de la liaison
5-phosphodiester et la formation dun
intermdiaire nucloside monophosphate 23 cyclique qui est son tour hydrolys pour
donner des nuclosides 2 ou 3monophosphates.

B) Mthodes enzymatiques :
Les enzymes qui hydrolysent les acides nucliques sont des nuclases. Ils sont prsents
dans la plupart des cellules pour intervenir lors du mtabolisme des acides nucliques.
On les trouve par exemple en grand nombre dans les organes qui scrtent des sucs
digestifs. Elles appartiennent la classe enzymatique des phosphodiestrases, cest-dire quils catalysent la scission hydrolytique des liaisons phosphodiesters. La coupure
peut se faire de part et dautre du phosphate car chaque phosphate est impliqu dans 2
liaisons diester.
Par convention, le ct 3 de la liaison est
le ct a et le ct 5 est le ct b .
Le clivage du ct a laisse le groupe
phosphate li en position 5, tandis que
le clivage du ct b laisse le groupe
phosphate li en 3.
Les nuclases peuvent tre spcifiques et sont classs selon plusieurs critres :

19

- Lieu du clivage : lintrieur de la chane (endonuclase) ou lextrmit

(exonuclase)
- Leur spcificit vis--vis du substrat : certains reconnaissent spcifiquement lADN
(les dsoxyribonuclases) et dautres lARN (les ribonuclases).
- Le type de coupure : en a ou b
Ex : Une hydrolyse exonuclase a commence par lextrmit 3 tandis quune hydrolyse
exonuclase b commence par lextrmit 5 .

1) Endonuclases de lARN ou de lADN

Les endonuclases clivent les liaisons lintrieur dun brin, formant ensuite plusieurs
petits fragments. Ils ne sont pas spcifiques dune squence de bases, sauf sil sagit
dendonuclases de restriction (voir plus bas)
Ex : la ribonuclase pancratique clive lARN en position b des pyrimidines. Il en rsulte
des oligonuclotides avec une extrmit pyrimidine 3-phosphate.
2) Exonuclases de lARN et de lADN
Les exonuclases clivent les liaisons phosphodiesters lextrmit de la chane.
La chane pouvant tre parcourue dans le sens 5 3 ou 3 5, nous avons la
possibilit de former deux produits diffrents.
Les 2 exemples montrent :
- La phosphodiestrase du venin de serpent clive lARN ou lADN dans le sens 3 5 en
position a. Elle commence donc lextrmit 3et va donner des NMP-5 (nucloside
monophosphat).
- La phosphodiestrase de la rate clive lARN ou lADN dans le sens 5 3 en position b.
Elle commence donc lextrmit 5 et donne des NMP-3.

Les phosphodiestrases du venin de serpent de la rate sont deux exonuclases qui

dgradent les polynuclotides en commenant par des extrmits diffrentes.

20

3) Endonuclases de restriction
Les enzymes de restriction reconnaissent des squences de bases spcifiques de
lADN et le clivent au niveau de positions dfinies.
Ces enzymes sont prsentes chez de nombreux procaryotes et ont comme rle de
cliver lADN tranger. Elles protgent ainsi les bactries de lattaque des virus ou
dautres parasites. LADN de la bactrie nest pas dgrad car les sites normalement
reconnus par lenzyme sont mthyls. Lendonuclase ne reconnat alors plus la
fonction et neffectue pas son clivage. On parle dans ce cas dun systme de
restriction-modification.
Un exemple bien connu dendonuclase de restriction est lenzyme EcoRI.
Cet enzyme reconnat dabord sa squence spcifique, appele site de restriction :
GAATTC (dans le sens 5 3). Il sagit dun site palindromique, cest--dire que la
squence nuclotidique reconnue, lue dans le mme sens, est identique sur les 2
brins. Elle va raliser un clivage dcal des 2 brins entre G et A.
On remarque que les extrmits 5 des fragments forms possdent un
prolongement monocatnaire. Les queues monocatnaires sont donc
complmentaires, collantes , et peuvent sapparier (mais ce nest pas le cas pour
toutes les enzymes de restriction).

3.4. Gnralit sur lADN:

Quoique lADN ait t dcouvert par Mischer en 1869, son rle gntique na t mis en
vidence quen 1944 par les tudes de Griffith sur des bactries, les pneumocoques (agents
pathognes de la pneumonie). Ils sont normalement entours dune capsule de
polysaccharides qui les protge contre les mcanismes de dfense de lhte, et contribue
donc les rendre infectieux.
Il existe des souches S (ou lisses) qui possdent cette capsule et sont donc pathognes, et
des souches R (ou rugueuses), qui ont perdu leur capsule et sont inoffensives.
Une injection de S morts chez des souris na aucun effet.
Une injection de R vivants na aucun effet non plus.
Par contre, on constate en 1928 que linjection de S morts et de R vivants est mortelle pour
la souris et on retrouve dans son cadavre des S vivants. Un facteur transformant est donc
pass entre les S inactivs et les R et les a transforms en S virulents.
Par cette exprience, Griffith a mis en vidence le principe dun change de gnes entre les
bactries.
Plus tard, Avery, Mc Carthy et Mc Leod vont chercher do vient cet change de gnes.
Pour ce faire, ils traitent le mlange de souches R vivantes et S mortes avec diffrentes
enzymes (protases, lipases, ) quils injectent dans des souris. Ils observent que seule la
dsoxyribonuclase empche la transformation des souches S mortes en S vivantes. Ils en
21

concluent que seul lADN est capable dinduire une transformation dans la bactrie. Ils
viennent en fait de dcouvrir que lADN est le support de linformation gntique.
A partir de ce moment l, on a voulu dcouvrir la structure de lADN :
On savait dj depuis 1920 que lADN tait un polymre de nuclotides. Chargaff dcouvre
quil existe diffrents nuclotides composs de 4 bases diffrentes. Il va chercher
dterminer le pourcentage de ces bases.
Il conclue de ces expriences que :
- La proportion de A = proportion de T et la proportion de G = proportion de C
- En consquence, la somme des pourcentages de A et G = la somme des
pourcentages de C et T.
- La proportion de bases A/T et G/C varie dune espce une autre mais est
identique au sein dune espce.
Un autre bon en avant t la dcouverte de leffet hyperchrome par Rmi Thomas (ULB).
Le spectre dabsorption de lADN
natif nest pas le mme que celui du
mme ADN dnatur. Ce dernier a
une absorption 260 nm plus
leve que celle de lADN natif.
Laugmentation de labsorption UV
observe lors de la sparation des
2 brins dADN est appele leffet
hyperchrome.
Les interactions entre les bases
dun acide nuclique ont pour effet
de diminuer labsorption de lumire UV compare celle dune solution avec la mme
concentration de nuclotides libres. Labsorption diminue davantage quand deux brins
dacides nucliques sont lis : cest leffet hypochrome. Ici, la dnaturation de la double
hlice a pour effet daugmenter labsorption : Cest leffet hyperchrome.
Il y a une rorganisation de la molcule dADN : les interactions entre les bases sont
modifies.
L'absorption de l'ADN natif, 260 nm, en fonction de la temprature (courbe de fusion),
prsente l'allure d'une sigmode : le point d'inflexion de cette courbe est la temprature de
fusion de la molcule, note Tm. Il sagit de la temprature laquelle lADN est moiti
droul. A Tm, laccroissement dabsorbance de lchantillon vaut la moiti de
laccroissement dabsorbance accompagnant la dnaturation complte de lADN.
Lors d'un refroidissement lent, l'absorption suit la courbe de fusion en sens inverse. Lors
d'un refroidissement rapide, l'absorption ne prend pas la mme courbe de fusion, mais suit
plutt une autre courbe qui n'aboutit pas la mme valeur originale de l'absorption, mais
une valeur plus leve : c'est le phnomne d'hystrsis.
Ltude de la diffraction de RX a aussi contribu au dveloppement dun modle de la
structure de lADN. En effet, Franklin conclue de ces expriences de diffraction quil existe
deux priodicits :
- une de 0,34 nm (entre deux bases)
- une de 3,4 nm (sur un tour, ce qui correspond 10 tours)
Celles ci indiquent la prsence dune hlice.
22

Enfin, en 1953, Watson et Crick tablissent un modle de la double hlice dADN

Les 2 brins dADN senroulent en hlice autour dun axe commun. Les brins sont
antiparallles, cest--dire quils sont en orientation opposes : 5-3 et 3-5. Cest la
complmentarit des bases et les ponts hydrognes qui permettent lhlice de garder sa
structure. Il y a 2 ponts hydrognes entre ladnine et la thymine et 3 ponts hydrognes
entre la guanine et la cytosine. Le fait quA soit toujours appari avec T et G avec C explique
les conclusions de Chargaff.
- Le squelette sucre-phosphate est
la face externe de lhlice. Les bases
sont lintrieur de lhlice
- Les bases sont perpendiculaires
laxe de lhlice.
- Un tour dhlice

= 10 nuclotides
= 34 angstrms

- Diamtre de lhlice = 20 angstrms

Aprs avoir perc le mystre de sa structure, les scientifiques se sont intresss aux rles
que joue lADN. Cest ainsi quen 1968, Nirenberg et Khorona reoivent le prix Nobel de
mdecine pour avoir dcouvert la correspondance entre les codons de lARN messager et
les acides amins : le code gntique. Celui-ci est universel.
Chaque acide amin dune protine est cod selon des rgles prcises par 3 nuclotides qui
forment un codon.
Ex : Le codon GUG est traduit en valine
LADN peut tre dnatur par chauffage ou dans des conditions de pH extrmes. Dans ces
conditions, cest la rupture des liens hydrogne entre les bases dune paire qui provoque le
droulement de la double hlice pour former deux brins spars. Les liaisons covalentes de
lADN ne sont quant elles pas casses. La dnaturation est rversible : on parle alors de
renaturation
La renaturation de lADN se produit lorsque la temprature et le pH reviennent des
valeurs normales. Dans ce cas, et si la dnaturation est incomplte, les deux brins se
remettent ensemble spontanment.
Si les deux brins sont totalement spars, ils vont dabord se retrouver par des collisions au
hasard pour former un court segment de double hlice. Ensuite, les bases apparies vont
successivement sassembler jusqu former la double hlice (modle dune tirette).
On peut finalement expliquer leffet hyperchrome.
Au plus lADN contient des paires de bases G C, au plus sa Tm est leve. En effet, ces
paires sont lies par 3 liens hydrognes, contrairement aux paires A = T qui nen ont que 2.
Plus dnergie est donc ncessaire pour dissocier les paires G C que les paires A = T. Ainsi,
la Tm dune molcule dADN peut indiquer sa composition en bases. On peut alors, si la
dnaturation a lieu dans des conditions bien contrles, dnaturer les rgions contenant
les paires A = T tandis que le reste de lADN reste attach. Labsorbance est elle aussi

23

modifie : celle des paires A = T est plus grande que celle des paires G C car les lectrons
sont plus facilement excits.

a) La courbe de dnaturation varie selon le type de paires prsentes.

b) Tm augmente linairement avec le pourcentage de G-C prsent dans lADN

Pour la rplication de l'ADN, trois modles ont t proposs:

La rplication conservative : A partir d'une molcule d'ADN bicatnaire "mre", on

forme une nouvelle molcule d'ADN bicatnaire totalement no-forme.
La rplication semi-conservative : Chacun des deux brins de la molcule d'ADN
bicatnaire "mre" sert de matrice pour la formation d'un nouveau brin
complmentaire. Chaque nouvelle molcule "fille" ne conserve donc que la moiti de
la molcule "mre".
La rplication dispersive : Aucun brin ne reste intact, les nouveaux brins sont
constitus la fois d'ADN de la molcule mre et d'ADN noform.

Ces 3 thories taient envisageables jusqu ce que Meselson et Stahl mettent au point une
exprience qui allait confirmer la rplication semi-conservative :
L'azote est un constituant majeur de l'ADN. L'azote 14 (14N) en est, de loin, l'isotope le plus
rpandu sur terre, contrairement l'azote 15 (15N) considr comme lourd. Ce dernier
n'est pas radioactif, juste plus lourd que l'isotope commun, car il contient un neutron
supplmentaire.
Des bactries 'Escherichia coli sont cultives dans un milieu comportant du 15N. Lorsque
l'ADN est extrait de ces cellules puis centrifuges sur un gradient salin de densit, l'ADN
migre jusqu'au point o sa densit est gale celle de la solution saline.
Aprs cela, les souches d'E. Coli pralablement cultives en milieu comportant du 15N, sont
remises dans un milieu normal, comportant du 14N, le temps d'une unique division
cellulaire. L'ADN de ces bactries est ensuite extrait puis centrifug pour comparer les
rsultats. Sa densit s'avre tre
intermdiaire. Si la rplication avait
t conservative, il serait apparu
une quantit quivalente d'ADN
lourd et d'ADN lger, mais pas
d'ADN hybride de densit
intermdiaire, excluant ainsi la

24

rplication conservative.
Le rsultat pouvait cependant correspondre une rplication soit dispersive, soit semiconservative. Dans ces deux modles, l'ADN tant constitu d'une quantit quivalente
d'azote lourd et d'azote lger, responsable d'une densit intermdiaire.
Dans la suite de l'exprience, des cellules cultives en milieu contenant du 15N, sont ensuite
cultives en milieu normal 14N, le temps de deux cycles cellulaires. Le rsultat obtenu est
une quantit quivalente d'ADN de deux densits. L'une correspondant la ADN de densit
intermdiaire retrouv lors de la prcdente partie de l'exprience, l'autre correspondant
des cellules cultives exclusivement en milieu contenu du 14N. Ce rsultat permet
d'infirmer le modle dispersif qui aurait donn une densit
intermdiaire, infrieure celle des cellules s'tant divise une
seule fois, mais suprieure celle des cellules cultives
exclusivement en milieu contenu du 14N, la quantit 15N tant
rpartie sur de plus en plus de brins d'ADN.
Le rsultat de ces expriences concorde donc avec le modle
semi-conservatif de la rplication de l'ADN, la proportion
d'ADN lger augmentant avec le nombre de gnration s'tant
divises dans le milieu contenu du 14N.
Concrtement, cette exprience nous apprend que lors de la
rplication de lADN, un brin parental sert de modle la
rplication dun nouveau brin. Ainsi, lorsque lADN est
rpliqu, une des chanes de chaque molcule dADN fille est
transmise de lADN parental tandis que lautre est synthtis
de manire complmentaire.
Aprs avoir perc le mystre de sa rplication, les scientifiques se sont penchs sur une
manire de dterminer la squence de lADN.
Le squenage complet de lADN permet danalyser sa structure et son rle dans
lexpression des gnes.
On utilise surtout la mthode de Sanger, un procd enzymatique utilisant lADNpolymrase. Elle synthtise le brin complmentaire au brin quelle lit. Nanmoins, il faut
connatre une petite partie de lADN car elle ne sait pas commencer un brin, il lui faut une
amorce (oligonuclotides).
Le mme procd est utilis de manire simultane
sur quatre mlanges ractionnels.
En plus des 4 bases azotes, chaque mlange
ractionnel contient une petite quantit de
didoxynuclotides (voir ci-contre) diffrents pour
chaque mlange. Ils se distinguent des nuclotides
classiques par le fait quils contiennent des
hydrognes la place des groupements
hydroxyles. Cela bloque la croissance de la nouvelle
chane car elle na pas le groupement hydroxyle-3 terminal ncessaire la formation de la
liaison phosphodiester suivante. La concentration de didoxynuclotides est assez faible
pour que la terminaison de la chane ne seffectue quoccasionnellement. La polymrase
insre donc parfois le bon nuclotide, et parfois le didoxynuclotide.

25

Par exemple, si du ddCTP (didoxynuclotide de la cytosine) est prsent, on obtient des

segments de longueurs diffrentes, mais tous se terminent par une extrmit C-3. Le
ddCTP nest bien sr
insr que l o G
est localis dans
lADN squencer.
On effectue la mme
opration avec le
ddCTP, ddATP,
ddGTP et ddTTP.
Il
suffit
aprs
dutiliser
des
fluochromes
pour
diffrencier les 4
didoxynuclotides :
ils
deviendront
fluorescents une
longueur
donde
spcifique.
On ralise alors une
lectrophorse sur gel dnaturant ou en capillaire pour sparer les brins. Les bandes
dADN spares sont alors dtectes par leur fluorescence lorsquelles sortent du gel. La
squence de couleurs donne aprs traitement par un ordinateur la squence des bases de
lADN.
 Cette mthode est aussi appele raction de terminaison de chane.

3.5. Gnralit sur lARN:

L'acide ribonuclique, ou ARN, est une molcule biologique trouve dans pratiquement
tous les organismes vivants, y compris certains virus. L'ARN est une molcule trs proche
chimiquement de l'ADN car il est compos des trois mmes constituants ; savoir un ose,
un groupement phosphate et une base (Guanine,
Cytosine, Uracile et Adnine). La diffrence
structurale la plus importante entre les deux
molcules est que lARN est constitu dun simple
brin.
Nanmoins, il peut faire des appariements
intramolculaires de type Watson-Crick car il y a
localement des rgions o des appariements de
bases complmentaires sont possibles grce aux
liaisons hydrognes. Le simple brin peut donc, lui
aussi, se reployer.

26

Il existe diffrents types dARN :

ARNm (- messager) : sont de tailles diverses et sont constitus de 75 3000
nuclotides. Ils constituent 2 % des ARN synthtiss. Ils servent de matrice la
synthse des protines.
- ARNm procaryotes : un mme ARN peut mener plusieurs protines : on parle
alors dARN polycistronique.
Structure :
5 triphosphate Squence - extrmit 3
- ARNm eucaryotes : Souvent, un ARNm code pour une protine : on parle alors
dARN monocistronique.
Structure : 5 coiffe Squence extrmit 3avec un polymre dadnosine
La coiffe comprend une base (souvent G) avec un mthyle ajout sur lazote en
position 7 (7-mthyl-guanosine) et un lien triphosphate 5-5 (trs inhabituel, le plus
souvent, il sagit dun lien 5-3). Seuls les ARNm contiennent cette coiffe. Cela
permet donc de les distinguer des autres ARN. Le rle de cette coiffe est de le
protger et de participer lunion de lARNm et du ribosome.
Lextrmit 3 est appele queue poly-A (succession de ribonuclotides de type
adnosine). Elle joue plusieurs rles essentiels au cours des diffrentes tapes de la
vie d'un ARN messager. Elle intervient en particulier dans la protection contre la
dgradation et le transport nuclo-cytoplasmique, c'est--dire le passage du noyau
vers le cytoplasme.
ARNt (- de transfert) : Ils ont des tailles plus homognes et transportent les acides
amins sous une forme active jusquau ribosome.
Cette macromolcule est constitue denviron 75 nuclotides, ce qui en fait le plus
petit des ARN.
Un acide amin est attach une molcule dARN de transfert spcifique lextrmit
3. Celui-ci peut dcoder un ARN messager
grce la boucle de lanticodon et la
complmentarit des bases.
Ils ont tous des caractristiques communes :
- Ils peuvent tre reprsents selon le
modle de la feuille de trfle (voir cicontre) dans laquelle une grande partie
des rsidus sont apparis par leurs
bases.
- Ils contiennent tous des bases
inhabituelles : certaines sont des drivs
mthyls de A, U, C ou G. La mthylation
donne un caractre hydrophobe
certaines rgions de lARN, ce qui permet

27

de diffrencier les ARN de transfert les uns des uns.

- Il y a 5 rgions spcifiques : lextrmit 3 (bras accepteur o lacide amin est fix)
compos des bases CCA, la boucle TC, le bras supplmentaire, la boucle de
lanticodon et la boucle DHU.
- Lextrmit 5 est phosphoryle

ARNr (ribosomial) : Ce sont les plus abondants puisquils constituent 80 % des ARN
synthtiss. Ils ont un rle la fois catalytique et structural dans la synthse des
protines.
Ils sassocient celles-ci pour former les ribosomes, qui terme produiront des
protines. Pour ce faire, il y a association de lARN messager, porteur de
linformation gntique et de lARN de transfert, chargs dacides amins. Il forme
un lien peptidique.
Les ribosomes sont soit libres dans le cytoplasme, soit lis au rticulum
endoplasmique. Chez E. Coli, il y a trois types de ARNr distingus selon leur
proprit de sdimentation (qui dpendent entre autres de leur masse, leur forme,
): 23 S, 16 S et 5 S (S =Svedberg). Une molcule de ces trois espces est prsente
dans chaque ribosome.
Les ribosomes des eucaryotes sont diffrents de ceux des procaryotes : ils sont plus
gros et contiennent quatre sortes dARN au lieu de trois.

28

B) Biochimie des protines

Chapitre 1 : Introduction
Les protines sont des polymres composs dun ensemble d'acides amins relis entre eux
par des liens peptidiques. Cette assemblage est rgit par l'information gntique et se
prsente sous cette forme :

Cette raction de polymrisation forme terme une chaine polypeptidique. Il existe deux
voies de synthse diffrentes y menant :
* Synthse sur les ribosomes par traduction d'une squence gntique.
* Synthse peptidique non ribosomal. En effet, chez les bactries et les champignons, il
existe une synthse peptidique originale indpendante des ribosomes. Celle-ci est effectue
par de gros complexes enzymatiques appels synthtases ou NRPS (Non Ribosomal
Peptide Synthtase).
Ces deux voies mnent la synthse de grosses molcules organiques appeles :
protines . Celles-ci ont des fonctions trs diverses qui jouent un rle primordial dans le
fonctionnement et la structure de la cellule. Selon sa fonction, une protine aura une
localisation et une structure spcifique.
Parmi toutes les fonctions que peuvent effectuer ces composs chimiques, citons les
principales :
- Catalyse enzymatique (synthses et dgradations)
- Cohsion entre cellules ou tissus (constituant de la peau, des tendons )
- Senseur et transducteur de signal (rcepteurs du gout, toucher, hormones )
- Transport de molcules
- Mouvement intracellulaires et intercellulaires
- Dfense et systme immunitaire
- Rgulation des gnes et du mtabolisme.
 Les protines sont donc nombreuses, varies et occupent des fonctions diffrentes.
Grce Swiss-Prot (= base de donnes biologiques de squences protiques), on sait
que le nombre dacides amins dans une protine varie entre 2 (le plus peptide) et 35213
(plus grosse protine connue ce jour). On observe nanmoins un pic aux alentours de 200
acides amins. Cest pourquoi, on dfinit les polypeptides (ou protines) comme des
longues chaines dacides amins.

29

Chapitre 2 : Structures des protines

Nous pouvons distinguer 4 niveaux diffrents de structure dans les protines.

Structure primaire :

Les acides amins sont les units structurelles de base des protines (cfr. introduction).
La structure primaire de la protine est donc dtermine par la succession prcise dun
nombre particulier dacide amin. Cette squence est lue conventionnellement de
l'extrmit N terminale l'extrmit C terminale.
Toutes les protines biologiques sont construites partir des 20 acides amins
existants. Leur grande diversit vient de leur capacit de former des polymres varis
par des assemblages simples de molcules possdant un caractre acido-basique
particulier. Pour comprendre la structure des protines, nous devons donc dabord
comprendre la structure de ces constituants.
Les acides amins ont une structure commune comprenant un groupement amine (NH2), un groupement acide carboxylique (-COOH) et une chaine latrale spcifique (R)
place sur un carbone central. Ce dernier est donc un carbone asymtrique, qui
possde des proprits de chiralit. Il existerait donc pour chaque acide amin, une
conformation L et une conformation D. Nanmoins, de rares exceptions prs, le
monde vivant ne comporte que les acides amins lvogyres.
Prcisons aussi quau pH physiologique (neutre), les acides amins sont sous forme de
zwitterions : les deux groupes sont chargs (lamine est donc sous forme NH3+ et lacide
carboxylique sous forme COO-)
La seule exception cette structure standard est la Proline qui ne possde quune
extrmit COO-. Ceci sexplique par le fait que lazote de l'extrmit amine est utilis
dans un cycle. Cette structure particulire introduit des contraintes angulaires dans les
chaines polypeptidiques.
On peut rassembler les 20 acides amins en 5 classes distinctes selon les proprits
engendres par le groupement R :
- Les acides amins aliphatiques : regroupent les acides amins ayant comme
groupement R, une chaine hydrocarbone aliphatique. Ils ne sont pas solubles dans
leau et ont tendance se replier sur eux mme pour sisoler au maximum de leau.
Ils sont au nombre de 6 : Alanine, Glycine, Valine, Leucine, Isoleucine, Mthionine.
- Les acides amins aromatiques : regroupent les acides amins ayant comme
groupement R, un cycle aromatique. Ils ne sont pas solubles dans leau et sont au
nombre de 4 : Proline, Phnylalanine, Tyrosine et Tryptophane.
La Proline est un cas particulier car cet acide amin arrive cycliser le carbone alpha
avec son extrmit N terminale. Ceci en fait une molcule trs hydrophobe.
Il est trs facile de distinguer les acides amins aromatiques entre eux par des
mthodes de spectrophotomtrie. A une longueur donde de 280 nm, ces acides amins
absorbent une quantit diffrente de lumire.

30

- Les acides amins hydroxyls : regroupent les acides amins ayant comme
groupement R, une chaine hydrocarbone avec un groupement hydroxyle terminal.
Grce ce groupement, ces acides amins sont polaires. Ils sont au nombre de 2 : Srine
et Thronine.
- Les acides amins basiques : regroupent les acides amins ayant comme groupement
R, une chaine hydrocarbone basique.
Ils sont au nombre de 3 : Lysine, Arginine et Histidine.
Ces bases se protonnent des pH proches de 7. Par exemple, on retrouve lHistidine
dans les membranes des virus. Etant donn quelle se protonne des pH infrieur 6, le
virus sait savoir quand il est en milieu acide.
- Les acides amins carboxyles : regroupent les acides amins ayant comme
groupement R, une chaine hydrocarbone avec un groupement acide carboxylique
terminal. Ils sont solubles dans leau et sont au nombre de 4 : Aspartate, Glutamate,
Asparagine et Glutamine.
Prcisons que pour les deux premiers, on observe une fonction carboxylate terminale
pH physiologique (charg pH 7) ; alors que pour les deux seconds, il sagit dun
groupement acide carboxylique (globalement neutre pH 7).
La cystine est un acide amin particulier qui possde un groupement sulfhydrile trs
ractif. En prsence dune 2e cystine, on observe une oxydation du groupement
sulfhydrile avec formation dun lien disulfure (trs stable). Cet acide amin joue donc
un rle important dans la structure des protines, car elle permet l'tablissement de
forts liens disulfures entre rsidus Cystine dune chaine polypeptidique.

Structure secondaire :

Cette structure dcrit le repliement local de la chane principale d'une protine. Dans le
lien peptidique, deux doubles liaisons (C = 0 et C=N) offrent une dlocalisation possible
pour les lectrons. La rotation autour du lien C N est donc impossible et le lien
peptidique est plan. Au vu de cette dernire particularit, la rpartition spatiale de
deux rsidus adjacent peut tre caractrise par deux angles : l'angle form par les
liaisons C et N et l'angle dlimit autour de la liaison C et C. A cause des
encombrements striques importants entre les substituants de la chaine principale,
seul un ensemble restreint de combinaisons de
valeurs de et sont autorises. Les
combinaisons possibles sont reprises dans le
diagramme de Ramachandran. Dans ce diagramme,
seules quelques zones sont permises.
Ces diffrentes zones correspondent aux
diffrentes classes de structures secondaires
La zone 1 = feuillet
La zone 2 = hlice
La zone 3 = hlice gauche

31

* Les hlices : Il y a conformation en hlice lorsque le

squelette principal de la protine adopte un repliement
hlicodal priodique o les groupements R des acides
amins sont rejets vers l'extrieur. Dans l'immense
majorit des cas, cette hlice tourne dans le sens horaire.
Elle est alors dite droite . Inversement, lorsqu'une
hlice tourne dans le sens anti-horaire, elle est dite
gauche (voir plus loin). On observe une prdominance
de lhlice droite car elle permet de minimiser les
rpulsions des acides amins L.
La stabilit relative de ces assemblages est due aux liens
hydrognes entre les groupements amines et acides
carboxyliques des acides amins de tours successifs. Ces
liens se font paralllement l'axe de l'hlice. Cette
structure est nanmoins fragile car sa stabilit peut tre
perturbe par la prsence de charges ou de gros
radicaux dans les chanes latrales des acides amins.
On peut observer lapparition dun coude dans certaines hlices alphas. Ce qui indique
la prsence dun acide amin particulier (la Proline) dans lhlice. Dans cet acide amin,
latome dhydrogne na pas la bonne inclinaison pour former la courbure de lhlice car
il fait partie dun cycle rigide empchant la rotation de la liaison C N et la formation
dun lien hydrogne.
On retrouve ces hlices alphas dans de nombreuses protines comme par exemple : le
Glucagon ou encore la myoglobine.
* Le Brin ou Feuillet : Le brin est une structure priodique tendue o les liaisons
hydrognes qui le stabilisent se font entre rsidus distants plutt qu'entre rsidus
conscutifs, comme dans le cas de l'hlice . En fait, un brin seul n'est pas stable. Il a
besoin de former des liaisons hydrognes avec d'autres brins pour se stabiliser. On
parle alors de feuillets .
Les groupements R des acides amins sont localiss alternativement en haut et en bas
du plan de ce feuillet. En gnral, cette disposition permet de former une face
hydrophobe et une face hydrophile de part et d'autre du plan. Attention, les feuillets
ne sont pas plans au sens gomtrique du terme, ils prsentent en fait un plissement
sur leur surface, avec des plis alternativement orients vers le haut et vers le bas.
Lors de l'agencement de
deux brins adjacents
dans un feuillet, deux
topologies sont
possibles : soit les deux
brins ont la mme
orientation, soit ils ont
des orientations
opposes. Dans le
premier cas, on parle de brins parallles et dans le second, de brins antiparallles.
Ce dernier cas est moins stable que le premier. En effet, la position des groupements
C=O et N-H est moins favorable l'tablissement des liens H. En consquence, les

32

feuillets antiparallles ne comportent gnralement que deux brins dont l'cartement

est plus important que dans les feuillets parallles.
Les feuillets sont peu flexibles. Il est donc ncessaire de les coupler avec d'autres
structures secondaires (tournant,...) pour que la protine puisse adopter une forme plus
dense.
Exemple de protine riche en feuillets bta: la superfamille des immunoglobulines.
* Hlice gauche : Ce type dhlice est forme par la rpulsion des cycles de la Proline
sans liaisons hydrognes intracatnaires.
Ex : Les trois hlices constitutives du collagne sont des hlices de ce type.

Structure tertiaire :

Ce 3e niveau correspond au repliement de

la chaine protique dans lespace.
Les chaines latrales des acides amins
peuvent intervenir dans le reploiement de
la chaine polypeptidique par leurs
interactions mutuelles. Ainsi, on peut
observer tout une srie dinteractions :
* Effet hydrophobe : cest un effet
thermodynamique que tout le monde
connait. Si on met 2 gouttes dhuile dans de leau, celles-ci ne se solubilisent pas car
elles ne sont pas polaire (chaine hydrophobe). On observe alors que les deux gouttes se
rejoignent pour ne former plus quune seule tache.
Pourquoi se sont elles rapproches ?
Ensemble, la surface totale en contact avec leau est plus petite que si on considrait les
deux taches sparment. Ainsi, on libre
des molcules deau qui ne participent
plus la solvatation de lhuile. Ceci va
donc augmenter lentropie de leau et
diminuer lnergie libre de Gibbs. La
runion des deux gouttes dhuile est
donc spontane.
Cet effet hydrophobe est aussi prsent
dans la chaine polypeptidique et se produit entre des acides amins de la famille
aliphatique. Grce la base de donnes Swiss-Prot , on sait que ces acides amins
sont largement reprsents dans les protines (+/- 40 %). Ainsi, leffet hydrophobe est
une des grandes interactions menant la structure secondaire des protines.
Les 2 acides amins aliphatiques sont lis par des forces de van der Waals. Ces forces
agissent sur des courtes distances (env. 7 Angstrms entre les atomes) et obissent au
potentiel de Lennard-Jones).
* Les ponts salins : Il sagit dune interaction lectrostatique entre le groupement
carboxylate dun acide amin et le groupement amine dun autre acide amin. Etant
donn qu pH physiologique, la plupart dentre eux sont sous la forme zwitterion, les

33

ponts salins peuvent tre effectus entre la plupart des acides amins. Ces ponts salins
sont rgit par la force de Coulomb :

F=

1
4 0

q1 .q 2
r

La dpendance en r de la force en fait une force a longue porte (compare aux autres
forces comme les forces de dispersion de van der Waals).
* Ponts hydrognes : Dans les protines, les liens H sont habituellement forms entre
les groupements amine ou hydroxyle (donneur) et un atome dazote ou doxygne
(accepteur). Lnergie de ce type de liaison est relativement faible ~3-7 kcal/mol mais
cette valeur dpend de la distance donneur-accepteur ainsi que de langle entre le lien H
et lacide amin.
* Liaisons covalentes : Le plus bel exemple de liaisons covalentes est le pont disulfure.
Celle-ci est trs stable et rsulte de loxydation de deux acides amins particuliers : La
Cystine. Ce type de liaison une force de ~ 10-100 kcal/mole.
* Liens non-covalents : Les atomes dans les protines peuvent interagir aussi de
manire non covalente, par des forces attractives et rpulsives entre eux. Chacune de
ces forces est beaucoup plus faible ( 10 kcal/mole) que les liens covalents et peine
plus forte que l'agitation thermique. Ce qui rend les protines flexibles et capables
dinteragir de manire rversible entre elles. Ce sont ces interactions qui entrainent une
dnaturation facile.

Structure quaternaire :

La structure quaternaire n'est utilise que pour dcrire des protines comportant
plusieurs chaines polypeptidiques. Ce niveau structurel dcrit l'agencement spatial des
diffrentes chaines qui composent la protine (qui constituent souvent des sous-units
diffrentes appeles monomres).
Ex : Lhmoglobine est constitue de 4 sous-units (2 monomres alphas et 2
monomres Betas)

Chapitre 3 : Le reploiement des protines

Les nombreux scientifiques qui se sont intresss la structure des protines, ont
galement travaill sur leur dnaturation. En effet, on peut artificiellement drouler une
protine dj reploye (dnaturation) et la laisser se reployer nouveau. Lutilit
principale de cette manipulation est de voir comment cette protine se renature. Pour ce
faire, on peut utiliser plusieurs moyens :

34

Utilisation dagents dnaturants (comme lure ou le chlorure de guanidine) qui

perturbent les liens hydrognes et la structure du solvant haute concentration.
Elvation de la temprature. Elle engendre une agitation thermique des atomes de la
molcule. Celle-ci qui provoque une rupture des interactions faibles, comme les
liaisons hydrognes, qui stabilisent la structure spatiale.
Modification du pH du milieu. Ceci entraine une modification des charges portes
par les groupements ionisables. Ainsi, on altre les liaisons ioniques et hydrognes
stabilisant la structure spatiale.
Utilisation dagents rducteurs de thiols (2-mercaptothanol). Ils permettent la
rupture des ponts disulfures et peuvent ainsi contribuer fragiliser la structure
tertiaire ou quaternaire des protines.

En sintressant ce phnomne de renaturation, Christian Anfinsen dcouvrit que :

L'activit d'une protine dpend de sa conformation (structure 3D)
Pour une protine donne, il existe une conformation qui possde une nergie
libre plus petite que nimporte quel autre tat conformationnel dans des conditions
environnementales donnes. Cest vers cet tat que la protine voluera
spontanment en se reployant.
La seule information que la cellule possde c'est la squence (menant de lADN la
chane polypeptidique). C'est donc cette squence qui dicte la conformation.
Toutes ces observations lui viennent de ces travaux sur la dnaturation de la ribonuclase
(une protine enzymatique):
Si on met la molcule en prsence dagents dnaturants (ure et mercaptothanol), celle-ci
se dnature. Ensuite, il dcide dliminer
ces agents dnaturants et dobserver la
renaturation.
Il enlve dabord le mercaptothanol. Les
ponts disulfures se reforment mais dans
une conformation o lactivation de
lenzyme est impossible. En enlevant par la
suite lure, il remarque que la protine
reprend sa conformation initiale. Lenzyme
est alors active.
Par consquent, on peut en dduire
qu'aprs une dnaturation, l'information
rgissant son activit est toujours prsente.
Anfinsen a donc mis en vidence que ce
sont les acides amins qui dterminent le
rle catalytique des enzymes.
Il clture ses travaux en affirmant que toute chaine polypeptidique contient dans sa
squence l'information ncessaire pour donner une conformation finale unique dans des
conditions environnementales dtermines . Cette affirmation est connue sous le nom de
rgle dAnfinsen. Actuellement, nous savons que celle-ci doit tre nuance par les acquis
plus rcents sur le reploiement (celui-ci dpend aussi souvent dinteractions avec dautres
protines) ainsi que par les conditions exprimentales pas toujours ralistes.

35

Une chane polypeptidique l'tat dnatur peut en principe explorer tout lespace
conformationnel. Pourtant seule une conformation, la conformation finale la plus stable est
retenue. Si la chaine polypeptidique explorait vraiment toutes les conformations possibles,
cela prendrait un temps extrmement long. Celui ci serait incompatible avec le cycle de vie
des protines.
Dans ce cas, comment les protines trouvent-elles leur conformation finale aussi
rapidement ? Cest le paradoxe de Levinthal.
En ralit, ltat intermdiaire (entre le dbut du reploiement et la structure finale) des
zones de la chaine se rarrangent pour former localement des structures secondaires
typiques (hlices, plans, ). Une fois ces structures secondaires formes, le reste de la
chaine peut se rarranger, en tenant compte des contraintes imposes par la formation de
ces structures secondaires. Le passage de l'tat initial l'tat final reploy se fait donc par
le passage d'une suite d'tats intermdiaires mtastables.
Ceci peut galement tre interprt thermodynamiquement. On parle alors de thorie du
paysage nergtique . On illustre celle-ci par un entonnoir dont le sommet reprsente les
polypeptides non replis et la base reprsente les molcules qui ont atteint la conformation
native. Le diamtre de lentonnoir diminue au cours du reploiement car la diversit des
conformations se rduit et leur niveau dnergie diminue. Une protine dploye a donc
tendance se diriger vers sa conformation native N (correspondant ltat dnergie
minimal). Elle peut y arriver de deux manires :
* En une seule tape. Ceci nest valable que pour des
protines trs petites et simples.
Sur la figure ci-contre, la protine A illustre cette
manire dy arriver.
* En plusieurs tapes. Cest ce que lon observe pour la
plupart des protines. Elles passent progressivement
par des stades moins nergtiques en formant des
intermdiaires de plus en plus stables.
Sur la figure ci-contre, il sagit de la protine B.

Jusqu prsent, nous avons considr des renaturations in vitro or les conditions
environnementales ne sont pas les mmes lintrieur de la cellule.
Ex : Les protines sont synthtises trs rapidement par les ribosomes (Chez lE coli, on
parle de 1000 protines par seconde avec seulement 35000 ribosomes). En thorie, leur
reploiement pourrait commencer ds que le 20e acide amin a t enchan (moment o la
chaine sort du ribosome). L'environnement intracellulaire est donc trs encombr et les
protines doivent se replier dans ce milieu surpeupl.
Une erreur dans le reploiement est donc envisageable vu le milieu dans lequel il se droule.
Un mauvais repliement aurait des consquences graves pour lorganisme : Si la protine
nacquiert pas sa fonction normale, elle peut former des agrgats et si ceux-ci ne sont pas
limins, ils peuvent entraner des pathologies plus ou moins grave.
Cest le cas des prions, un type dagent pathogne constitu dune protine ayant adopt un
repliement anormal, entrainant la formation dagrgats. Ceux-ci sont les agents causals

36

responsables des maladies prion (maladie de Creutzfeldt-Jakob ou de la vache folle,

lencphalopathie spongiforme bovine, ) qui se caractrisent par une dgnrescence du
systme nerveux central. Par exemple, la maladie de la vache folle est due un mauvais
reploiement de la partie droite de la protine prion qui interagit avec la partie gauche.
Lorganisme se dfend par rapport tous ces effets nfastes en mettant sur pied des
systmes cellulaires protecteurs contre les mauvais reploiements.

Association des chaines polypeptidiques avec des chaperons :

Les reploiements des protines peuvent tre assists par d'autres protines : les
chaperons. Ceux-ci peuvent donc interagir avec la chaine polypetidique en cours de
formation (ou noforme) pour favoriser le bon reploiement de la protine.
Diffrents modes d'interactions sont possibles.
a) Soit la protine chaperon interagit avec la chaine synthtise par le ribosome, en
se fixant sur des rgions particulires (souvent hydrophobes) pour en empcher le
reploiement. Ce blocage vite un reploiement trop rapide, tant que la chaine n'est
pas assez longue. Une fois que la squence synthtise est assez importante pour
que la zone adopte une bonne configuration, le chaperon libre la protine, qui se
reploie seule. Ce type de chaperon est appel HSp70.
b) Soit la protine interagit activement avec la protine synthtise dont la
configuration est maintenue dplie par les premiers chaperons. Celle ci est
transfre dans un deuxime complexe de chaperons (ex : groEL + groES). Ces
complexes empchent toujours les interactions avec les autres protines, mais force
la chaine adopter sa configuration native. Une fois la protine reploye
convenablement, elle est libre dans le milieu. Ces complexes de chaperon sont
appels Chaperonines (ou HSp60).

Dgradation des protines mal reployes par slectivit :

Les protines mal reployes induisent une mauvaise conformation aux protines
saines par interaction. La propagation du mauvais reploiement tant importante, il
est donc crucial pour les cellules d'liminer les protines mal reployes.
Il existe diffrentes voies de dgradation des protines. Soit des voies non
spcifiques, comme la dgradation dans les lysosomes, soit des voies slectives.
Une de celles-ci, ATP-dpendante est la dgradation par l'Ubiquitine. Lors de celle-ci,
une molcule dUbiquitine vient se fixer sur la protine. Par la suite, d'autres
molcules se polymrisent sur le premier rsidu. Cette squence est alors reconnue
par un protasome (complexe de protine qui fixe les chaines polypeptidiques
portant les rsidus dUbiquitine). Ces complexes clivent la chaine marque en les
acides-amines qui la composent et libre les rsidus d'Ubiquitine qui peuvent
nouveau marquer une nouvelle chaine.

37

Chapitre 4 : La diversit des protines

Les protines peuvent prendre toute une srie de formes particulires. Le plus souvent, il
sagit de protines dites globulaires. Elles sont caractrises par une forme
approximativement sphrique. Elles peuvent tre schmatises comme des assemblages de
curs hydrophobes spars de la solution (et entre eux) par un squelette form par la
chaine polypeptidique portant des acides amins hydrophiles orients vers l'extrieur.
Cette structure qui rassemble les groupes R hydrophobes l'intrieur de la protine met
ces derniers l'abri du solvant, ce qui stabilise la molcule.
A cot de cette grande famille, il existe aussi des protines formant des fibres (protines
fibrillaires). Cest le cas par exemple du collagne, de lactine et de la myosine.
Collagne : Si on observe le collagne de plus prs, on peut observer quil est
compos de 3 hlices polypeptidiques associes. Ces chanes sont relies par des
liaisons hydrognes et des liaisons covalentes. Le collagne constitue environ 25%
du poids total des protines du corps humain, c'est donc la plus abondante. Il existe
plusieurs types de collagne. Ceux-ci ont des structures diffrentes et se retrouvent
dans des organes particuliers.
L'lastine est une autre protine fibrillaire qui ressemble au collagne. Elle est
faiblement structure et forme des assemblages moins rigides que le collagne (d'o
son nom: lastine).
Le collagne est d'abord synthtis comme tropocollagne, dont les extrmits ne
sont pas structures. Ces extrmits sont enleves par clivage (grce des
peptidases), laissant seulement la partie structure. Les fibres de collagne sont
ensuite modifies et s'assemblent en grand nombre. Ces assemblages sont
consolids par des liaisons covalentes entre fibres (liens aldol) et sont regroups en
faisceaux.
Actine : Elle est prsente dans toutes les cellules du corps, et spcialement dans les
cellules musculaires. L'actine est essentiellement globulaire mais s'assemble
linairement pour former une fibrille. Dans la contraction musculaire, l'actine
polymrise se lie une autre protine, la myosine. Cette dernire possde une
partie strictement fibrillaire et
une extrmit globulaire (tte de
myosine). Elle peut s'accrocher
au polymre d'actine et le fait
coulisser par rapport elle. A
l'autre bout du filament d'actine,
un autre filament de myosine fait
la mme chose de faon
symtrique. Les deux filaments
de myosine se rapprochent donc
l'un de l'autre, c'est la
contraction musculaire.
Autre exemple de protines formant des fibrilles: la soie de fil d'araigne.
Chaque fil est form d'un assemblage de fibrilles dont le motif de base est une
protine en feuillets beta formant le module rigide connecte d'autres modules en
beta par une partie non structure de la chane polypeptidique. La partie structure

38

donne la solidit alors que la partie non-structure donne l'lasticit. La cohsion

dans le module rigide provient des nombreux liens hydrognes stables entre les
brins beta.
Sur la surface des cellules, on trouve beaucoup de protines qui forment des filaments. Le
cytosquelette en est galement compos. Ces filaments flexibles permettent au
cytosquelette davoir des mouvements contrls.
Il existe une troisime famille de protines : Les protines membranaires. Comme leur
nom lindique, elles sont localises proximit des membranes de la cellule. A cot de la
membrane cellulaire, on peut aussi citer :

Le rticulum endoplasmique : organite prsent dans les cellules eucaryotes. Il est

constitu d'un rseau membraneux tendu faisant des feuillets partout dans la
cellule. La membrane spare le lumen du rticulum du cytosol. Une partie du RE est
couverte de ribosomes qui assemblent les acides amins en chanes protiques
suivant l'information venue du noyau.

Les mitochondries sont entoures dune membrane. Elles se composent de 2

membranes mitochondriales, une externe et une interne, spares par un espace
intermembranaire. La membrane interne forme des invaginations qui apparaissent
sous forme de crtes ou repli. Ces crtes augmentent la surface de la membrane et
donc la capacit de phosphorylation oxydative. Grce cette caractristique, on peut
dduire que si une mitochondrie possde beaucoup de crtes c'est que la cellule
peut rcuprer une grande quantit d'nergie et donc pourra produire plus d'ATP
(nergie contenue dans la liaison phosphate-phosphate).
Les protines membranaires sont des protines particulires qui possdent des zones
fortement hydrophobes incluses dans les couches de phospholipides des membranes. Soit
la protine ne possde qu'une courte rgion mdiane insre dans la membrane et elle est
alors dite priphrique, soit elle traverse de part en part la membrane (ou une extrmit
fixe dans la membrane) et elle est alors dite intgrale.
Etudions la topologie de ces protines membranaires :

(a) On observe des interactions par une hlice hydrophobe transmembranaire. La

chaine latrale de la protine est hydrophobe.
(b) On observe des interactions par plusieurs hlices
transmembranaires. Les chaines latrales sont hydrophobes.

hydrophobes

39

(c) On observe des interactions par un tonneau transmembranaires. Les chanes

latrales hydrophiles se situent lintrieur de ce tonneau et les chanes latrales
hydrophobes sont lextrieur. Ce tonneau transmembranaire constitue un canal
prfrentiel pour toute une srie de substances.
 (a), (b) et (c) sont donc des protines membranaires intrinsques
(situes l'intrieur de la membrane cellulaire)
(d) On observe des interactions par une hlice amphipathique (possde la fois un
groupe hydrophile et un groupe hydrophobe) parallle au plan de la membrane. La
chaine hydrophobe des acides amins se dirige vers lintrieur de la bicouche
lipidique tandis que la chaine hydrophile se dirige vers lextrieur.
 (d) est une protine membranaire extrinsque.
(situe l'extrieur de la membrane cellulaire)

Intressons nous au transport des protines.

Les protines destines la scrtion sont
synthtises sur des ribosomes lis au
rticulum endoplasmique (RE). Les chanes
polypeptidiques sont transfres [= la
translocation] dans le lumen du RE. Des
vsicules se forment par bourgeonnement du
RE et migrent vers lappareil de Golgi avec
lequel elles fusionnent. Un transport existe
galement tout au long des diffrents
compartiments de lappareil de Golgi. Une
partie de celui-ci produit des vsicules de
scrtion par bourgeonnement. Ces dernires
fusionnent avec la membrane externe de la
cellule pour relarguer leur contenu l'extrieur.
Comment le systme d'exportation fait-il la
diffrence entre une protine destine tre
scrte et une protine qui doit rester dans le
cytoplasme ?
On constate exprimentalement que les
protines scrtes possdent leur extrmit N-terminale (le dbut de la squence) une
portion de squence particulire, prsente aprs leur sortie du ribosome mais perdue
aprs leur passage dans le rticulum endoplasmique. Cette squence est appele la
squence signal . Elle contient en gnral un enchanement d'acides amins plutt
hydrophobes encadr aux 2 extrmits par un petit nombre d'acides amins hydrophiles.
La longueur de la squence signal est en gnral d'environ 15 30 acides amins (souvent
une vingtaine).

40

Pour une protine scrte, la chane polypeptidique fabrique par le ribosome traverse la
membrane lipidique du rticulum endoplasmique au travers d'un systme de passage
compos d'un complexe de protines appel le translocon (unit fonctionnelle de la
translocation).
Ce translocon ne se met en marche que pour les protines possdant la squence signal. Il
possde un tunnel permettant de faire passer la chaine de la protine dans le lumen.
On distingue 2 mcanismes de translocations :
* La translocation Co-traductionnelle : Elle consiste en la traverse du translocon pendant
la synthse du reste de la chane
polypeptidique. Ce mcanisme
est particulier car le processus
de synthse de la protine et le
transfert travers le translocon
se font simultanment. Aprs
que la squence signal ait t
synthtise par le ribosome libre,
celui-ci est fix (par des
protines de la membrane du
rticulum
endoplasmique)
associes aux translocons. Ceuxci vont reconnaitre la squence
signal que porte la protine qui est en train dtre synthtis. Le ribosome est donc fix la
paroi du rticulum endoplasmique rugueux. L'extrmit N-terminale de la chaine en cours
de formation pntre dans le translocon, ce qui lui permet de passer dans lumen du
rticulum. Au moment du passage, la squence signal est clive par la signal peptidase.
Au moment o elle est dans le lumen, la chane peptidique commence se replier. Le
repliement de cette protine est assist par les chaperons galement prsents dans
lorganite.
* La translocation post-traductionnelle: La
chane polypeptidique est synthtise
compltement par le ribosome dans le
cytoplasme. Cette synthse seffectue avant
la translocation. Leur conformation est
bloque par les protines chaperons qui les
empchent de se reployer ; ceci est
ncessaire sinon la protine ne pourrait
traverser le translocon cause de son
reploiement. La squence signal qu'elles
portent leur permet de s'engager dans les
complexes de transfert qui sont situs dans
la membrane. La translocation commence
par le passage travers le translocon de la
squence signal N-terminale. Celle-ci est immdiatement clive par une enzyme spcifique,
la signal peptidase. La chaine continue sa progression et se lie des chaperons dans le
lumen du RE. Le transfert se fait donc par un mcanisme de roues dentes (la chaine est
peu peu libre par les chaperonines du cytosol et s'enroule autour de chaperons dans le
lumen). Une fois le transfert termin, Les chaperons libre la chaine polypeptidique. Ainsi,

41

la protine adopte sa configuration native et peut subir d'autres modifications posttraductionnelles et tre transfre.
Remarque : La signal peptidase intervient pour couper la squence signal. Ceci explique
pourquoi cette squence n'est plus prsente sur les protines analyses aprs leur
translocation.
Toutes les protines qui passent par le translocon ne sont pas ncessairement
compltement transloques. Certaines, qui possdent dans leur squence une suite
d'environ 20 acides amins trs hydrophobes, restent cales dans la membrane. Une
telle squence est appele
stop transfer sequence . Cette
squence hydrophobe se glisse
latralement
hors
du
translocon pour venir se placer
entre les lipides de la
membrane du rticulum (ceci
est possible parce que le
translocon est un ensemble de
protines qui peuvent s'ajuster
les unes par rapport aux
autres, ce n'est pas un tunnel
rigide). Une telle protine
devient donc une protine
membranaire puisqu'elle
reste insre dans la membrane. Lorsque le rticulum forme des vsicules de transport qui
migrent vers lappareil de Golgi, ces protines peuvent ventuellement faire partie de la
membrane de ces vsicules et accompagnent donc le trafic de vsicules dans la voie de
scrtion. Certaines protines membranaires atteindront ainsi le Golgi, d'autres iront via
les vsicules de scrtion jusqu' la membrane externe de la cellule dont elles feront alors
partie.
Remarque : Lorsqu'on a plusieurs squences stop transfer , on obtient une protine
membranaire avec plusieurs segments transmembranaires.

Chapitre 5 : Les modifications post-traductionnelles

Les modifications post-traductionnelles sont des modifications de la structure de la
protine (primaire ou tertiaire) en gnral covalentes, qui modifient la fonction ou l'activit
de la protine. Ces modifications post-traductionnelles gnrent une grande diversit, car
grce elles, le nombre de protines diffrentes chez l'homme, estim 300.000 est 10 fois
suprieur au nombre de gnes codants. Des centaines de modifications ont t dcrites
mais nous ne parlerons ici que de certaines dentre elles (les plus importantes). La
glycosylation, la phosphorylation, lattachement dun lipide sont les modifications les plus
couramment dcrites

42

5.1)

Les Glycosysations :

La glycosylation est lajout dun sucre sur une protine pour former une glycoprotine.
Cet assemblage de sucre(s) seffectue sur certains acides amins bien prcis. Outre la
cration de diversit dans le protome, les groupements osidiques influent sur la
stabilit et la solubilit de la protine. Les sucres, qui peuvent galement tre utiliss
comme squence signal pour l'adressage de la protine, jouent un rle primordial dans
les mcanismes de reconnaissance intercellulaires.
La glycosylation se droule dans le rticulum endoplasmique rugueux et est termine
dans lappareil de Golgi. Les protines doivent donc en principe passer dabord par la
translocation avant d'tre glycosyles. Par consquent, en gnral, il rare dobserver
des glycoprotines non-exportes (situes dans le cytosol).
On estime que dans la plupart des cas, un systme de protines chaperons contrlant le
reploiement de la protine seffectue pendant leur glycosylation.
Il existe 2 types principaux de glycosylation chez les eucaryotes:
o O-glycosylation : lassemblage des sucres se fait sur un groupement hydroxyle
port par une srine, une thronine ou un acide amin modifi: l'hydroxyproline
ou l'hydroxylysine (p.ex. Dans le collagne).
La O-glycosylation s'effectue par l'attache directe de sucres (fournis sous forme
de conjugus des nuclotides phosphoryls) catalyse par des
glycosyltransfrases. Un sucre est fix au dpart sur l'oxygne d'un groupe
hydroxyle d'un acide amin qui en possde. Les sucres suivants sont enchans
tape par tape les uns aux autres.
Le contenu en sucres des glycoprotines de surface des cellules comme la
glycophorine prsente sur les globules rouges dfinit les groupes sanguins A, B
et O. Le choix des sucres dpend des glycosyltransfrases disponibles chez un
individu (ce qui dpend de l'hritage gntique en fin de compte). Tous les
individus possdent le motif commun minimum du groupe O. Le groupe A est
dfini par la prsence d'une N-acetylgalactosamine additionnelle. Le groupe B
est dfini par la prsence d'un galactose additionnel.
Les htrozygotes a/b, o/a, o/b, hritent de versions diffrentes de leurs 2
parents.
Cette glycosylation se droule dans le trans-Golgi (partie spcifique de lappareil
de Golgi).
o N-glycosylation : Contrairement la O-glycosylation, la N-glycosylation permet
de fixer des groupements de sucres bien plus importants. Au cours de cette
raction, un oligoside se lie un acide amin particulier : asparagine. Lors de la
synthse de la protine, celle-ci est transfre dans le lumen du rticulum
endoplasmique rugueux. L, un donneur doses insr dans la membrane, le
dolichol diphosphate (lipide trs long), transfre le sucre qu'il porte sur une
asparagine spcifique de la chaine en cours de formation. Le dolichol est charg
de sucres par tapes successives dans le cytosol car c'est l que les sucres sont
disponibles. Ensuite, il bascule et prsente ses sucres de l'autre ct de la
membrane du rticulum.
La structure ajoute contient de nombreux sucres appels mannoses .

43

Cest pourquoi on dit que la glycoprotine est ce stade dans un tat: high
mannose : c'est la premire tape de la N-glycosylation.
Cette tape se termine lorsque les 3 glucoses prsents en bout de chane sont
coups. Cette coupure correspond une tape de contrle: si la protine est
correctement glycosyle et si sa structure est correctement replie, elle perd
dfinitivement ces trois glucoses.
Les 2 glucoses de l'extrmit sont enlevs et ne reste qu'un glucose dans une
premire tape. Ensuite, une protine chaperon particulire, (la calnexine),
contrle l'tat de repliement de la protine ainsi que la prsence du glucose. Ce
glucose est alors enlev et la protine, si tout va bien, est libre pour tre
conduite vers la voie de scrtion (transfert dans un dictyosome de l'appareil de
Golgi). Dans chaque compartiment de l'organite, le sucre est modifi. Aprs son
passage dans lappareil de Golgi, la protine est transporte par des vsicules de
secrtions vers diffrents lieux de la cellule.
Il existe un systme de contrle de qualit qui rattrape les protines mal replies
et mal glycosyles. Ce systme rajoute alors un glucose, ce qui remet la protine
dans un cycle de contrle par la calnexine. Ce systme fonctionne jusqu' ce que la
protine soit correctement glycosyle. Un tel systme de contrle impliquant la
fois des chaperons et des activits enzymatiques est assez gnral dans les
diffrents mcanismes de modification post-traductionnels.
Notons encore que :
 Contrairement ce que lon pensait, des mcanismes de O- et N-glycolysation trs
semblables ceux des eucaryotes ont t dcouverts chez les bactries.
 Il est galement devenu de plus en plus vident que de nombreuses protines du
cytoplasme et du noyau sont glycosyles.
Ex : Les protines faisant partie de la chromatine.
Des systmes de glycolysation qui ne dpendent pas du passage dans la voie de
scrtion ont donc t mis en vidence. Le plus connu est un mcanisme de Oglycosylation permettant une glycosyltransfrase dajouter le sucre Nacetylglocosamine.
44

 En dehors des voies de scrtion, la O-glycosylation par la N-acetylglocosamine est

une glycosylation incomplte et rversible
Les protines de la voie de scrtion vont-elles toutes vers la membrane externe ? Existe-til des systmes dadressage vers dautres compartiments ? Quels sont ces autres
compartiments ?
Il existe bien des systmes dadressage. Lors de ceux-ci, il y a lajout dune tiquette sur
la protine.
Prenons un exemple dadressage : ltiquette mannose6-phosphate des enzymes du lysosome.
Les prcurseurs des hydrolases du lysosome quittent le
rticulum endoplasmique et vont dans lappareil de
Golgi. Dans la partie cis de celui-ci, il y a addition de
phosphate au mannose. On obtient alors le mannose-6phosphate (M6P). Ensuite, il est envoy dans la partie
trans du Golgi. Cest l quun rcepteur M6P vient se lier
MANNOSE-6-PHOSPHATE 1
lui. Il sera alors transporter dans une vsicule de
transport vers le lysosome. Grce au pH acide des lysosomes, il va y avoir une
dissociation entre le rcepteur et le M6P (Les lysosomes contiennent des pompes
protons permettant le maintien l'intrieur de ceux-ci d'un pH compris entre 3,5 et 5).
Le phosphate est alors enlev et on a une hydrolase mature. Le pH acide est
indispensable au fonctionnement de ces hydrolases. Pour finir, les rcepteurs sont
recycls. Ils quittent le lysosome et retourne dans le Golgi o ils seront rutiliss.

5.2)

La formation des ponts disulfures :

Dans la cellule, il faut une formation et un cassage rapide des ponts disulfures. Un pont
disulfure (lien S-S) est un lien covalent fort form par loxydation de deux cystines
dans une squence peptidique (ou protine). La molcule rsultante de la liaison de
deux cystines est la cystine. C'est une liaison ncessaire la stabilisation de la
structure de certaines protines. Dans les protines contenant un grand nombre de
cystines, l'agencement correct des ponts disulfures ncessite parfois l'intervention
d'une enzyme spcifique. La formation des ponts S-S est catalyse par la protine Dsb
(Disulfide bridge-forming protein ) dans les bactries au niveau du priplasme (gram -)
et par PDI (protein disulfide isomerase) au niveau du rticulum endoplasmique dans les
cellules eucaryotes.
La formation de ponts disulfures est effectue dans des environnements oxydants tels
que le lumen du rticulum endoplasmique par les protines qui sy trouvent. Le
cytosol des cellules est en effet un environnement trs rducteur, et consquemment
les protines cytoplasmiques contiennent donc peu ou pas de ponts disulfures. On en
trouve surtout dans les protines exportes dans d'autres compartiments cellulaires ou
hors de la cellule, cest--dire les protines empruntant la voie de scrtion.
Et chez les bactries ?

45

Pour rappel, Il existe de 2 sortes de bactries:

Gram ngatif : Ces bactries ont 2 membranes (une intrieure et une extrieur)
et entre celles-ci se trouve un espace priplasmique et des peptidoglycanes.
Gram positif : ces bactries ont une membrane, une couche forme de
peptidoglycanes et entre elles, un espace priplasmique.
Dans ce systme, la protine
prsente dans le priplasme (ou
espace priplasmique) va former
des ponts disulfures grce la
prsence
dune
protine
oxydante qui va se rduire et
ouvrir ses ponts disulfures. De
plus, une autre protine prsente
dans le milieu, la DsbC, va jouer
un rle de catalyseur et de
chaperon pour la formation de la
bonne liaison disulfure.

5.3)

Clivage protolytique :

Le clivage protolytique consiste scinder une chaine polypeptidique en entits

distinctes ou enlever une partie de la chaine. L'enlvement d'acides amins cre de la
diversit (Ex : la Met-amidopeptidase enlve la mthionine du N-terminal de sorte que
toutes les chanes ne commencent pas par une mthionine) et peut permettre d'activer
la protine un endroit prcis dans la cellule (ex : protines de digestion actives dans
l'intestin). Les squences excises sont souvent, soit la mthionine N terminale
apporte par le codon d'initiation de la transcription, soit la suppression d'une
squence signal qui servi pour l'adressage de la protine.

5.4)

Ancre lipidique :

Certaines protines membranaires sont fixes la bicouche phospholipidique, non pas

par une squence d'acides amins hydrophobes incluse dans celle-ci, mais sont
directement lies de manire covalente une ancre lipidique (GPI ou
glycosylphosphalitylinositol. Il sagit dun complexe constitu dun oligosaccharide, de
deux chaines polypeptidiques hydrophobes et un thanolamine).

46

Les protines fixes ce lipide

proviennent de protines
transmembranaires normales.
Celles-ci comportent une
squence type dans le lumen du
rticulum endoplasmique. Cette
squence signal peut tre
reconnue par une enzyme
particulire, la transamidase.
Celle-ci supprime la squence
signal du stop-transfert et clive
la chaine entre sa partie incluse
dans la membrane et la partie
reploye dans le lumen. Cette
partie reploye est alors
transfre sur une ancre lipidique GPI prforme dans la membrane.
Ces protines sont gnralement plus mobiles que les protines transmembranaires. En
effet, ces dernires sont souvent en interaction avec le cytosquelette dans leur partie
interne la cellule. Les protines fixes sur les ancres lipidiques peuvent donc diffuser
d'avantage dans la bicouche phospholipidique.

5.5)

Isomrisation des prolines :

Le reploiement des protines est parfois limit par la rotation des prolines.
L'isomrisation cis-trans des prolines est en effet relativement lente et gne donc une
adoption rapide par la protine de sa configuration native. Il existe donc une srie
d'enzymes, les peptidyl-prolyl isomrases, qui catalysent l'isomrisation de ces rsidus
de manire spcifique ou non. Ces oprations d'isomrisation, ainsi que l'assemblage de
plusieurs sous units protiques, se droulent dans le lumen du rticulum
endoplasmique.

Chapitre 6 : Analyse des protines (Dtection et Purification)

Les protines dans une cellule, un organisme ou un fluide biologique sont nombreuses.
Si on veut en tudier une en particulier, il faut la plupart du temps lisoler, la purifier. Cela
demande llaboration de techniques particulires.
Purifier une protine est utile pour analyser sa squence, ses modifications posttraductionnelles (en comparant avec la squence du gnome si disponible), son activit
biologique. Ainsi, on peut terme dterminer sa structure et chercher des applications
celles ci (recherche, production, buts industriels).
Vu les sources importantes et leurs applications, les protines sont produites lchelle
industrielle.

47

Pour information, voici quelques sources de protines :

Enzymes protolytiques, lipases: appareils digestifs issus des abattoirs, latex de
papaye.
Xylanase pour l'industrie papetire extraite de microorganismes
Facteurs de coagulation, certaines vitamines: sang, cultures cellulaires
Anticoagulants, thrombolytiques: extraits de cultures cellulaires, extraits de
sangsues, de la salive de tiques.
Production en levures d'antignes pour vaccins hpatite B.
Exemples dutilit des protines lchelle industrielle :
Procds enzymatiques de plus en plus frquents dans le secteur de la chimie (des
millions de tonnes d'enzymes sont utilises chaque anne).
Production de vitamines, nutriments.
Production de vaccins sous-unitaires .
Production de protines usage thrapeutique ou diagnostique pour les hpitaux.
Production de protines pour la recherche industrielle et acadmique.
La purification doit se faire en utilisant les proprits intrinsques diffrentielles des
protines. Il existe diffrentes mthodes que nous allons dtailler :

6.1)

Mthodes de sparation

a) Llectrophorse non-dnaturante ou Focalisation isolectrique :

Chaque protine a une charge propre : Si celle-ci possde un excs de chaines latrales
charges positivement, alors la protine sera globalement charge positivement. Si par
contre, ses chaines latrales sont charges ngativement, alors elle sera globalement
charge ngativement.
La technique de l'lectrophorse est fonde sur la diffrence de vitesse de migration
entre les molcules soumises un champ lectrique constant. Les molcules anioniques
(-) migrent vers l'anode (+) et les molcules cationiques (+) se dplacent vers la cathode
().
Dans un milieu donn, la sparation des protines se fait en fonction de leur charge
lectrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Mais pas seulement,
la sparation dpend galement du pH dans lequel se trouve la protine. Au pH
isolectrique dune protine, celle-ci a une charge globale neutre. Elle nest donc pas
attire par les diffrentes bornes. Il faut savoir que chaque protine a un pH
isolectrique propre (idem que les acides amins). Le pH isolectrique dune protine
dpend des pKa des acides amins qui la compose et des modifications posttraductionnelles quelle a subie.
On peut donc jouer sur le pH en introduisant un gradient pH. Les protines vont alors
migrer dans le champ lectrique jusqu ce quelles soient respectivement leur pH
isolectrique. Cela permet donc une premire sparation des protines. Cependant, cela
nest pas suffisant car chaque bande mise en vidence peut cacher plusieurs protines

48

qui auraient le mme (ou proche) pH isolectrique. On a donc besoin dune autre
mthode pour pouvoir les sparer. Cette mthode de sparation sert donc dterminer
le pH isolectrique de la protine en sparant les diffrentes isoformes de la protine.
b) Llectrophorse dnaturante :
Lors de cette lectrophorse, les protines vont tre mises en prsence de SDS
(dodcylsulfate de sodium). Ce dernier se fixe sur les protines par interactions
ioniques et par effet hydrophobe suivant les rgions de la protine. La rpulsion
lectrostatique des ttes polaires du SDS entrane le droulement du polypeptide et
donc une dnaturation de la protine. Pour faciliter le droulement complet, on ajoute
souvent un rducteur des ponts disulfures (DTT).

Par lajout de SDS, on donne une charge ngative la protine. Elle

va donc avoir tendance migrer vers la borne positive dans le
champ lectrique. La migration dpend de la taille et de la densit
de charge de la protine. Sachant quen gnral, 1,2 gramme de
SDS vient se fixer sur 1 gramme de protine, la densit est souvent
constante. (Attention : cette rgle de masse du SDS nest pas
toujours respecte). Les petites protines migrent plus facilement
vers la borne positive. On a donc un rapport charge/masse totale
assez constant.
Cest donc finalement la taille de la protine qui dtermine sa
vitesse de migration travers le gel. On obtient alors une
sparation en fonction de la taille (et donc de la masse
molculaire).

On parle de masse molculaire apparente puisque certaines

protines peuvent scarter du comportement habituel et leur masse molculaire relle
est donc mal value par la technique du gel au SDS. La distance de migration est en
gnral une fonction linaire du logarithme de la masse molculaire.
Le dodcylsulfate de sodium permet donc de dterminer le poids molculaire apparent,
la prsence de modifications post-traductionnelles ainsi que la prsence de clivage chez
les protines. Le SDS permet galement de contrler (en partie) la puret de la protine.

49

C) Gels deux dimensions :

Le gel 2D correspond la combinaison des deux mthodes de focalisation lectrique et
de l'lectrophorse en gel dnaturant.
1re dimension : sparation suivant le pH (le champ est appliqu horizontalement). Si on
place des protines dans un gradient de pH, elles migrent vers leur pH isolectrique. Le
tampon de solubilisation des protines contient notamment :
* Un agent chaotropique (ure) :
Un agent chaotropique est une
molcule qui dtruit la structure
spatiale.
* Un agent rducteur (par exemple
du dithiothritol (DTT)) : le but est
de casser les ponts disulfures.
* Un dtergent non charg ou
zwitterionique : les protines
doivent rester solubles pendant la
migration.

2nd dimension : On place la premire

dimension au-dessus de la seconde laquelle on applique du SDS pour effectuer une
seconde lectrophorse.
Cette fois, le champ est appliqu verticalement. Les protines migrent alors de la
premire dimension la seconde et se sparent suivant leur masse molculaire
apparente.
Attention : il ne faut pas que les protines soient replies car elles peuvent dans ce cas
en cacher dautres et certaines charges peuvent tre masques (voir tampon de
solubilisation).
Le gel 2D spare un grand nombre de protines et permet de :
 Visualiser un grand nombre de protines (~2000 spots en routine).

Limitation : faible reprsentation des protines hydrophobes, des
protines ayant des pH isolectriques bas ou levs et des masses
molculaires petites ou grandes.
 Etudier le protome dun organisme, dun tissu, dune cellule ou dun organite.
Le protome est l'ensemble des protines exprimes dans une cellule, une partie
d'une cellule (membranes, organites) ou un groupe de cellules (organe,
organisme, groupe d'organismes) dans des conditions donnes et un moment
donn. le protome est aux protines ce que le gnome est pour les gnes.

Pourquoi tudier les protomes ? L'tude du protome permet une
meilleure comprhension du fonctionnement cellulaire partir de
l'expression protique dans un contexte global.
Ex : passage de la chenille au papillon.
Il a galement une utilit dans la comparaison de protines.

50

Ex : permet de comparer les cellules cancreuses et non-cancreuses et de ce

fait de comprendre lapparition du cancer.
 Visualiser des modifications posttraductionnelles. Il existe beaucoup de formes
diffrentes dune mme protine. Cela est d
des modifications post-traductionnelles.
Ex : Des glycolysations. Une protine ayant t
glycosyle plusieurs fois a une masse qui accrot.
 Quantifier le taux dexpression de protines et
donc de comparer des situations physiologiques
diffrentes. Pour dtecter les protines, on utilise
des colorants et des mthodes de comparaison :
Analyse protomique diffrentielle

Exemple: On cultive 2 extraits membranaires dune bactrie rsistante aux
mtaux lourds. On en place un en prsence de Cu2+ et lautre en labsence de
Cu2+. On observe que certains spots napparaissent quen prsence de Cu2+.
Ces protines jouent-elles un rle dans la rsistance aux mtaux lourds ?
Attention : pour pouvoir rpondre cette question, il faut pouvoir identifier
les protines.
D) Mthodes chromatographiques :
Les protines peuvent galement tre spares par des colonnes de chromatographies.
Diffrentes interactions peuvent tre utilises pour y sparer les molcules.
Il existe deux types de mthodes :
*Analytiques (dtection, analyse de composition chantillon, identification) : ces
mthodes se font sur des quantits faibles dchantillon. Elles sparent bien les
protines mais dtruisent souvent lchantillon de dpart.
*Prparatives : mthodes concernant de plus grandes quantits dchantillon et qui
ne dnaturent pas lchantillon. Nous allons par la suite nous concentrer sur cellesci.
Chromatographie sur colonne :
Des micro-billes de polymres sont places dans une colonne contenant un tampon
dlution. Ce tampon circule autour des micro-billes (il existe des interactions entre
la bille et le tampon). La bille entoure dune faible paisseur de solvant est alors
appele phase stationnaire. Le reste du tampon tant la phase mobile. On place
lchantillon de protines dans la colonne, certaines protines auront plus daffinits
avec les billes, elles seront alors freines et sortiront plus tard de la colonne.
Remarque: une protine peut passer dune phase lautre frquemment
(interactions), cest ce qui permet la sparation.

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On peut relier cette colonne une pompe et un dtecteur UV pour pouvoir dfinir
o se trouve la protine. Il existe 3 acides amins qui absorbent dans lUV (car ils ont
un cycle aromatique). La plupart du temps, les protines ont au moins un de ces
acides amins. La protine contenant le(s) acide(s) amin(s) est dtecte lors du
passage dans le dtecteur. Au bout de ce systme se trouve un collecteur permettant
de rcolter les diffrentes fractions au fur et mesure de la chromatographie. Grce
ce dtecteur, nous savons dans quelle fraction se trouve la protine.
La sparation va se faire sur la base des proprits intrinsques de la protine.
Puisquune grande diversit de protines existe, beaucoup dentre elles ont des
proprits voisines, il faudra donc faire appel plusieurs de ces proprits :






Charge globale de la protine (pH iso)

Taille de la protine
Solubilit (on joue sur le solvant)
Interaction spcifique de la protine avec un ligand (le ligand est la
molcule qui peut interagir avec la protine. On peut mettre le ligand dans
la rsine pour que la molcule saccroche) .

Les diffrentes mthodes de sparation sont les suivantes :

1. Chromatographie dchange dions
On utilise une rsine charge positivement ou
ngativement.
Les
protines
charges
ngativement ou positivement vont sy fixer. Plus
leur charge est importante, plus elles se fixent.
Pour savoir si une protine est charge
positivement ou ngativement, on fait varier le
pH. On peut galement faire une lution par un
gradient de contre-ions.

52

Aprs lution, la sortie du dtecteur UV, on observe un signal de ce type :

En rouge, on observe la premire protine

En vert, la seconde.
En bleu, la troisime.
Dans des cas rels, les sparations ne se font pas
aussi bien. Certains pics peuvent tre trop proches. Il
faut alors jouer sur dautres conditions que la charge
de la rsine.

2. Chromatographie dexclusion de taille

La chromatographie d'exclusion permet la sparation des molcules travers un gel
poreux en fonction de la taille, de la forme et du poids molculaire de la protine. La
dure de sjour des protines dans la colonne augmente lorsque le poids
molculaire de la molcule diminue. Le choix du type de gel est effectu selon le
domaine de fractionnement.
3. Chromatographie en phase inverse
Pour la phase stationnaire on utilise plutt la silice sur laquelle on a greff des
fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles 18 atomes de carbones. Les
solvants utiliss sont non polaires. Ils viennent prendre la place des protines et
celles-ci vont donc se dtacher de la colonne.
4. Chromatographie daffinits
On utilise les proprits dinteraction des
protines avec un ligand (autre protine, petite
molcule ou ion mtallique). Le ligand est fix
sur les billes. La protine ayant une affinit avec
celui-ci sy lie tandis que les autres protines ne
sy fixent pas. Pour pouvoir dtecter la protine, on ajoute un excs de ligands libres.
La protine se lie alors eux et se dcroche des billes.
La glutathion transfrase (GST) se lie son ligand naturel (glutathion) qui est fix
sur les billes de polymre de la colonne. Si on modifie la squence codante dune
protine en lui ajoutant la squence de la GST par gnie gntique, le tandem
rsultant va aussi se lier la colonne.

53

5. Chromatographie de chlation
Ou bien la protine contient des sites
capables de se lier un ion mtallique
(zinc finger ou autre), ou bien on ajoute
une queue histidine (6 ou plus de rsidus
His) la protine par gnie gntique. Si
on a plusieurs histidines, elles vont toutes
se fixer sur la colonne. On limine les
interactions non/peu spcifiques par un
lavage. Pour dtacher les histidines, il faut
tre un pH<6. De cette faon, plus aucun
complexe ne se forme.
La colonne contient des billes de
polymre avec des groupes capables de
lier un ion mtallique (par chlation).
La protine se lie simultanment sur lion
mtallique par chlation.

6.2)

Mthodes de squenage :

Les mthodes de squenage sont utilises sur des protines isoles et purifies afin de
dterminer la structure primaire des chaines d'acides amins. Il existe plusieurs
mthodes pour y parvenir.
a) La mthode de dgradation d'Edman:
Elle consiste lyser un un les acides amins en partant de l'extrmit N-terminale.
On fait ragir la protine avec le ractif dEdman, le phnylisothiocyanate. Celui-ci se
fixe sur le premier acide amin et on a un phnylthiocarbonyl.
Le ractif peut ragir avec le NH2 terminal, formant une liaison trs sensible
lhydrolyse.

54

Lhydrolyse est mnage en condition anhydre mais acide 100C, on forme un

cycle qui contient le premier acide amin + la chane restante.
Ensuite, il y a clivage de la liaison peptidique adjacente, pour former un hydantone.
Si cela se fait dans des conditions mnages, toutes les liaisons peptidiques restent
intactes sauf la premire. Par chromatographie, on peut identifier lhydantone ;
Le reste de la chane est rcuprable pour une nouvelle exprience.
Il existe une limitation la raction. En effet, des pics parasites apparaissent aprs
quelques cycles. Ceux-ci correspondent aux temps de rtention des cycles
prcdents. Ils vont diminuer le rendement, cest pourquoi, on ne peut pas
squencer toutes les protines.
Notons encore que le test ncessite 10 100 picomoles de protine pour fournir un
rsultat et que la limitation ne permet pas de squencer les protines dont le
premier acide amin N-terminal est modifi (souvent le cas chez les eucaryotes).
Cest pourquoi, on utilise une autre technique, plus efficace : la spectromtrie de masse.
B) Spectromtrie de masse :
Cette technique permet de transformer des molcules de leur tat naturel en ions
ltat gazeux et de dterminer leur masse molculaire m en analysant leur rapport
masse/charge (m/z).

Exemples de diffrentes sources dionisation :

EI (Electron Ionization) : lchantillon en phase gazeuse est ionis par un
faisceau dlectrons produit par un filament de tungstne

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 CI (Chemical Ionization) : un gaz (par exemple CH4 ou NH3) est ionis par un
faisceau dlectrons. Lionisation de la molcule analyser se fait par
transfert de proton
FAB (Fast Atom Bombardment) : lchantillon est dissout dans une matrice
liquide (glycrol, thioglycrol, dithanolamine ...). Lensemble est bombard
par un faisceau datomes (Ar ou Xe)
 EI, CI, FAB ne sont pas utilises pour les protines
ESI (Electrospray Ionization):
Lionisation par lectronbuliseur
est la dispersion dun liquide sous
forme de gouttelettes charges
lectriquement.
On place un liquide dans un capillaire en
verre entour dune couche de mtal. On
applique une diffrence de potentiel
entre lextrmit du capillaire et le
spectromtre de masse. Les protines
sont alors charges positivement et il y a
formation dun jet la sortie du capillaire.
Le solvant svapore et les gouttes deviennent donc de plus en plus petites. Il ne
reste alors plus que des charges positives qui se repoussent
la goutte explose en
plus petites gouttelettes. A la fin, il ne reste plus que la protine charge en phase
gazeuse. Elle entre alors dans le spectromtre de masse.
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization):
On peut dposer plusieurs chantillons sur la plaque. (ESI : un seul chantillon la
fois). Un faisceau laser puls est utilis pour dsorber et ioniser un mlange
matrice/chantillon cocristallis sur une
surface mtallique, la plaque.
Les molcules de matrice absorbent
l'nergie transmise par le laser, s'excitent
et s'ionisent. L'nergie absorbe par la
matrice provoque sa dissociation et son
passage en phase gazeuse. Les molcules
de matrice ionises transfrent leur
charge l'chantillon. L'expansion de la
matrice entrane l'chantillon au sein de
la phase gazeuse dense o il va finir de
s'ioniser.
L'ionisation de l'chantillon conduit la
formation d'ions monochargs et multichargs de type [M+nH]n+, avec une nette
prpondrance pour les monochargs.

 ESI, MALDI ne dtruisent pas les protines. Ce sont des mthodes

dionisation douces.

56

Exemples de diffrents types danalyseurs :

o Quadriple (Quadrupole) :
Un quadriple est constitu de quatre lectrodes parallles de section cylindrique.
Les lectrodes opposes sont relies entre elles et soumises au mme potentiel.
Les lectrodes adjacentes sont portes des
potentiels de mme valeur, mais
opposs de sorte que l'cart de potentiel soit gal 0.
Ce potentiel 0 rsulte de
la combinaison de
tensions, l'une continue
(U) l'autre alternative (V)
de haute frquence f.

En appliquant cette
diffrence de potentiel
entre chaque paire
d'lectrodes, il se cre un
champ lectrique quadripolaire.
Le faisceau rouge est compatible
il passe. Tandis que le bleu ne passe pas. On peut
ensuite changer les polarits pour choisir que ce soit le bleu qui passe.

o Tube de temps de vol - TOF (Time Of Flight) :

L'analyseur temps de vol consiste mesurer le temps que met un ion, acclr
pralablement par une tension, parcourir une distance donne. Le rapport masse
sur charge est directement mesurable partir du temps de vol. Un analyseur
temps de vol se compose d'une zone d'acclration o est applique la tension
acclratrice, et d'une zone appele tube de vol, libre de champ. Les ions acclrs
pntrent dans le tube de vol libre de tout champ. La sparation des ions ne va donc
dpendre que de la vitesse acquise lors de la phase d'acclration. Les ions de
rapport m/z le plus petit parviendront au dtecteur les premiers. Pour chaque
groupe d'ions de mme rapport m/z, un signal est enregistr au niveau du dtecteur
sous la forme d'une fonction temps/intensit.
o Trappe ions (Ion trap)
o Rsonance cyclotronique ionique transforme de Fourier - FT-ICR (Fourier
Transform Ion Cyclotron Resonance)
Digestion in situ des protines spares par lectrophorse 1D ou 2D :

tapes de lavage du morceau de gel

vaporation du solvant
rhydratation du gel en prsence de lenzyme (gnralement de la trypsine)

57

protolyse durant la nuit 37 C

extraction des peptides gnrs lors de la protolyse

Analyse des diffrents peptides par MALDI TOF :

Chaque protine une empreinte diffrente. On soumet les diffrents peptides et on
compare le spectre final des modles thoriques. Ceci sous-entend que la protine
est connue. Si ce nest pas le cas, on utilise le spectre de masse en tandem.
La spectromtrie de masse en tandem consiste slectionner un ion par une
premire spectromtrie
de masse, le fragmenter,
puis effectuer une
deuxime spectromtrie
de masse sur les
fragments ainsi gnrs.
Lanalyseur MS1 ne laisse
passer quun peptide qui
est alors acclr. Dans la
cellule de collision se
trouve un gaz inerte. Le peptide allant trs vite dans ce gaz inerte se fragmente
contre les molcules de gaz. La plupart des fragmentations ont lieu au niveau des
liens peptidiques.

58

Microsquenage des protines par ESI/MS/MS :

La diffrence entre le pic dans le spectre et celui de la slection dun peptide

correspond la masse de lacide amin.
Diffrentes applications de la spectromtrie de masse en biochimie
Dtermination de la masse prcise dun peptide, dune protine, dun lipide, ...
Identification de protines
Identification de modifications post-traductionnelles
Etude dinteractions non covalentes
Analyse structurale : cintique dchange H/D

Chapitre 7 : Les protines enzymatiques

7.1)

Introduction :

Avant daller plus loin, fixons certaines ides :

Un catalyseur est une substance qui augmente ou diminue la vitesse d'une raction
chimique ; il participe la raction mais est rgnr la fin de la raction. Il acclre
rend plus slectif parfois une raction qui est thermodynamiquement favorable.
Certaines protines possdent une activit catalytique. Il s'agit des enzymes.
Une enzyme est une molcule biologique qui catalyse une raction chimique. Elle acclre
une raction mais ne rend en aucun cas une raction impossible possible.
Les organismes vivants sont capables deffectuer une grande varit de ractions
chimiques dans des conditions douces en utilisant des enzymes. Celles-ci sont utilises
aussi dans des procds industriels

59

Comment a-t-on mis en vidence les proprits catalytiques de certaines protines ?

On a commenc par rcolter les protines et ensuite on leur a attribu chaque une activit
catalytique que lon a tent de dmontrer.
1re ide : la protine porte le catalyseur. On peut donc sparer le catalyseur de la
protine. Ceci sest avr faux.
2nd ide : certaines protines sont des catalyseurs.

7.2)

Catalyse :

Si la barrire dnergie dactivation est trs leve, la vitesse de la raction est trs lente. Le
catalyseur augmente la vitesse de raction en introduisant de nouveaux chemins
ractionnels (mcanisme), et en abaissant son nergie d'activation mais ne change en rien
les niveaux dnergie des tats initiaux et finaux de la raction. La catalyse enzymatique
abaisse l'nergie d'activation en procdant par passage par un intermdiaire.
E+S
ES E + P
La raction inverse de la deuxime tape est en gnral considre comme ngligeable, car
les produits sont utiliss directement. Cette deuxime tape est gnralement la raction
limitante.

Exemple : la chymotrypsine.
La chymotrypsine est produite par le
pancras sous une forme inactive : le
chymotrypsinogne. L'activation est
provoque par la trypsine qui coupe cette
molcule en deux chanes. La
chymotrypsine intervient dans la
protolyse des protines du systme
digestif. Elle catalyse le clivage des chanes
polypeptidiques par hydrolyse, mcanisme
au dpart extrmement lent sans un
activateur. Cette coupure se fait aprs les
acides amins hydrophobes. Il y a 3 acides
amins qui sont responsables de la

60

raction : la srine, lhistidine et

lacide aspartique. Ces acides amins
non-polaires crent une "poche
hydrophobe" ncessaire l'activit
enzymatique.
La chymotrypsine attaque les groupes
carbonyles potentiellement
nuclophiles impliqus dans une
liaison peptidique grce la srine
195, laquelle se lie son substrat pour
former un intermdiaire substratenzyme. Il a t montr que la
raction de la chymotrypsine avec son
substrat se produit en deux phases :
une phase initiale d'clatement au
tout dbut de la raction, puis une
phase d'tat stationnaire qui suit la loi
de Michaelis-Menten
Certaines enzymes sont trs spcifiques et dautres moins.
De plus, lactivit des enzymes dpend de la temprature et du pH (Chaque enzyme
possde ses valeurs optimales de pH et de temprature). Lactivit enzymatique augmente
en fonction de la temprature (augmentation de lagitation des molcules) jusqu ce
quelle atteigne sa valeur maximale. Au-del de cette dernire, laugmentation de
temprature entraine une diminution de lactivit enzymatique car la conformation de la
protine change avec la temprature (dnaturation de celle-ci), ce qui induit une
modification de la gomtrie du site catalytique.
Au cours de lvolution, les mmes protines ont volue et les valeurs optimales de
chacune delles se sont adaptes aux conditions de vie.
Exemples denzyme :
 Lysozyme : attaque des polymres de sucre permettant dattaquer la paroi des
bactries gram positive. Se trouve par exemple dans les blancs dufs.
 Actylcholine : neurotransmetteur.
 Actylcholinestrase : permet de casser les molcules dactylcholine ds quelles ont
transmit leur message.
 Anhydrase carbonique :

61

Certaines ractions chimiques se produisent spontanment avec une vitesse

apparemment suffisante, c'est le cas de la transformation du bicarbonate en dioxyde
de carbone et sa raction inverse via l'acide carbonique.
L'anhydrase carbonique catalyse cette raction en la rendant encore bien plus
rapide.
Ceci permet notamment de rtablir efficacement l'quilibre CO2/bicarbonate dans le
sang lors des changes gazeux dans les poumons ou bien autour des cellules qui
respirent activement (et rejettent donc du C02). La concentration en bicarbonate
dans le sang une forte influence sur le pH de celui-ci. Il est donc aussi essentiel de
rguler rapidement cet quilibre.

7.3)

Cintique enzymatique :

Ltude de la cintique enzymatique a pour but de tirer des infos sur les diffrentes
enzymes sur lesquelles on travaille.
La premire tape est rversible et forme un complexe enzyme-substrat (ES). Si on se
trouve dans la poche catalytique, il y a
attaque du complexe et lenzyme est libre

cycle.
La seconde tape est en gnral irrversible.

Dans le cadre de la cintique enzymatique, cest la vitesse dapparition du produit qui nous
intresse.

Tentons dexpliquer lobservation de la vitesse limite. La concentration en substrat

dtermine la quantit de complexe ES disponibles pour tre transforms en produits. Une
augmentation de la concentration en S augmente donc la vitesse de raction. Cependant,
une vitesse limite est atteinte pour des grandes concentrations en substrat. Cette vitesse
limite est cause par la quantit limite d'enzyme libre disponible et galement par la
quantit de produit qui entre en comptition avec le substrat pour se placer dans la poche
catalytique.

62

Approximation de Brodenstein pour ES : (condition de stationnarit : quilibre entre le

nombre de molcule dans la cavit et le nombre de molcule qui en ressort)

d[ES]
= 0 = v1 - v -1 - v 2
dt
d[P]
= v2. v
dt
Soit [E]0, le nombre d'enzyme initial : [E]0 = [E] + [ES] <=> [E] = [E]0 - [ES].
v1 = k1 [E][S], v-1 = k-1[ES], v2 = k2[ES].
k1 [E][S] + k-1[ES] + k2 [ES] = 0
k1 [E][S] + k-1[ES] + k2 [ES] = 0
<=> k1 [E]0[S] - k1 [ES][S] - k-1[ES] k2 [ES] = 0
<=> [ES](k1 [S]+k-1+k2) = k1 [E] 0 [S]
k 1 [E] 0 [S]
[E] 0
<=> [ES] =
=
.
k 1[S ] + k 1 + k 2
k -1 + k 2
1 + (
)
k 1 [S]

k 2 [E] 0
k -1+ k 2
o K M =
Or v = v 2 = k 2 [ES] =
k1
K

1 + ( M )
[S]

On pose k2 [E] 0 = v max

On cherche calculer v =

v=

v.max[S]
(K M + [S])

c'est l'quation de Michaelis et Menten.

Si [S] = 0  v = 0
Si [S] = KM  v = v.max.

KM
v.max
=
2K M
2

lim [S] v = v.max.

[S] +

En bidoulant lexpression de lquation de Michaelis-Menten, on trouve :

Sur ce graphique, on observe que lintersection

de la droite avec laxe de des abscisses permet de
trouver Km et lintersection avec laxe des
ordonnes permet de trouver v max.

63

7.4)

Les inhibiteurs :

Grce cette quation, on peut aussi dterminer sil y a eu inhibition. En effet, certaines
dentres elles sont comptitives et dautres non comptitives (augmente lactivit ou la
diminue).

Les inhibiteurs comptitifs sont des molcules qui occupent la poche catalytique
en lieu et place de la molcule de substrat. Ces molcules entrent donc en
comptition avec les molcules de substrat pour se placer dans la poche
catalytique. De manire gnrale, ils n'affectent pas la vitesse maximum de la
raction, car pour une concentration infime en substrat, leur prsence est
ngligeable.

Les molcules inhibitrices non-comptitives s'attachent l'enzyme, mais pas sur

son site catalytique. Cette fixation entraine une modification de la structure
tridimensionnelle de la protine enzymatique. Le site actif de l'enzyme est donc
moins ou plus accessible par le substrat. La prsence de ce type d'inhibiteur
modifie la vitesse maximum, car leur prsence n'est pas ngligeable pour une
concentration infinie en substrat

Quelle sorte dinhibition a lieu ? Est-ce important de le savoir ? Oui.

Application: production de mdicaments pour

acclrer ou diminuer une raction prcise. Il est
important de le savoir afin dobtenir le rsultat
souhait.
On peut distinguer les deux types dinhibiteurs en
observant la figure prcdente : Linhibition non
comptitive la mme intersection avec laxe
labscisse que la droite de lquation de MichaelisMenten alors que linhibition comptitive la mme
intersection avec laxe des ordonnes que la droite
lquation de Michaelis-Menten.

Chapitre 8 : Systmes hormonaux et de rgulation

8.1)

Introduction :

Parmi les rles que peuvent jouer les protines, nous allons nous intresser deux
fonctions particulires des protines : Celle de senseur et de transducteur de signal
ainsi que celle de rgulateur de signal (cest--dire la fonction permettant de moduler le
signal et darrter son action quand cela est ncessaire).
Les protines peuvent former des interactions entre elles, ou avec des ligands. Ces
interactions sont impliques dans divers phnomnes : Assemblage de macromolcules,
reconnaissance intercellulaire ou de molcule trangre, etc. ...

64

Celles qui nous intressent sont les protines impliques dans :

les interactions entre un rcepteur et son ligand
les interactions temporaires entre protines pour transmettre un signal
l'interaction avec l'ADN.
Ces interactions entre protines-ligands se font sur base de complmentarits entre
molcules. On peut citer une complmentarit d'encombrement strique, d'hydrophobicit,
ou encore une complmentarit de liaisons faibles (liens hydrognes, interactions
lectrostatiques, coordinations,...). Elles peuvent se faire selon deux modles :
* Modle type cl-serrure : Grce au rcepteur de formes
particulires se trouvant sur une protine, celle-ci ne se lie
quavec un ligand particulier ayant une complmentarit de
forme avec le rcepteur (principe de la cl dans la serrure).
Linteraction rsultante est rigide mais la structure des deux
molcules n'est pas modifie.
Attention : Le ligand doit pouvoir se dtacher du rcepteur
tout moment pour stopper lactivit de la protine si
ncessaire
* Modle adaptatif : Les rcepteurs ainsi que les ligands sont
dformables. Les structures de la protine s'adaptent donc
pour que l'interaction puisse se faire.
Les hormones sont de bons exemples dinteractions protines-ligands.
Celles-ci sont des substances qui permettent la transmission d'un signal entre cellules
distance. Ce sont des petites molcules organiques, des peptides ou dans un sens plus
large, des gaz tels le NO. Ces molcules interagissent avec des rcepteurs spcifiques qui
dclenchent des cascades de ractions entrainant une modification de la concentration de
molcules spcifiques courte dure de vie : les messagers secondaires.
Ces messagers secondaires activent des voies catalytiques ou des canaux ( ions ou autres)
qui entraineront une rgulation du mtabolisme, souvent par interaction avec l'ADN.
Les hormones peuvent rencontres deux types de rcepteur sur une cellule eucaryote :
* Rcepteurs Intracellulaires
* Rcepteurs Membranaires

8.2)

Rcepteurs intracellulaires :

Le ligand arrive jusquaux rcepteurs localiss au niveau du cytoplasme ou directement

dans le noyau de la cellule cible en traversant la membrane cytoplasmique.
Lorsque, par exemple, les hormones circulent dans le sang, elles sont transportes par des
protines. Grce ces dernires, elles peuvent facilement franchir la membrane
cytoplasmique et, en trouvant dautres protines capables de les transporter, se rendre
jusquaux rcepteurs. Le complexe hormone-rcepteur migre alors dans le noyau et se lie
au promoteur d'un gne ou dun ensemble de gnes pour stimuler ou inhiber la
transcription de l'ADN.

65

Ex : les hormones strodiennes (formes base de cholestrol) telles que la Testostrone

ou lEstradiol.
Une bonne connaissance de la forme des rcepteurs, permet de freiner la prolifration de
certaines hormones telles que lestradiol en utilisant des mdicaments capables de venir
bloquer les sites rcepteurs celles-ci.
Concrtement, ces rcepteurs sont coupls avec des chaines ractionnelles spcifiques.
Celles-ci induisent une rponse cellulaire menant la transcription ou linhibition dun
gne. Ces chaines de ractions amplifient le signal reu, car partir d'une seule molcule
d'hormone, de nombreuses molcules sont produites, dont la dure de vite est assez
rduite.
Il existe trois grands types de rcepteurs dhormones strodes :
* Les motifs doigts de zinc sont des combinaisons de 3 structures secondaires : une
hlice , et 2 feuillets antiparallles. Ces structures sont caractrises par un
domaine particulier en forme de doigt qui contient un cation Zn2+ reli deux
rsidus cystine et deux rsidus
histidine (ou reli 4 rsidus
cystines). Cette association
provoque un repli de la squence
polypeptidique sur elle-mme. Ce
domaine compact peut alors
interagir avec l'ADN en s'insrant
dans le grand sillon de l'hlice de
l'ADN. En effet, le doigt de zinc
tant charg positivement et
lADN ngativement, on va observer une interaction entre eux.
* Les motifs de tirettes leucines sont des protines qui sont caractrises par
l'association de deux hlices , comportant chacune deux rgions diffrentes. Dans
la premire partie, les deux hlices sont
parallles. Cette association est stabilise par
la prsence dun rsidu lysine tout les 7
monomres sur chaque hlice (afin que la
Leucine soit correctement oriente). Les
hlices
possdent
donc
des
faces
hydrophobes qui sont maintenues l'une
contre l'autre par effet hydrophobe. Au pied
de cette association, les deux hlices se
sparent dans deux directions orthogonales
par rapport l'axe initial. Les faces portent
alors des groupements basiques, qui, chargs
positivement, peuvent interagir avec les groupements phosphates de l'ADN.
* Les motifs hlice-tournant-hlice (HTH) sont des protines interagissant
galement avec l'ADN par un assemblage d'hlices hydrophobes et charges qui se
placent dans les sillons de l'ADN.

66

8.3)

Rcepteurs membranaires :

Ces rcepteurs sont des protines localises au niveau de la membrane plasmique de la

cellule cible et dont le ligand ne peut entrer dans la cellule.
Ex : certaines substances hormonales, les signaux visuels,
Ce sont les rcepteurs des hormones hydrophiles savoir les glycoprotines, les
monoamines et les prostaglandines.
Ces rcepteurs prsentent 3 domaines. Un domaine extracellulaire qui permet la liaison de
l'hormone avec son rcepteur spcifique. Un domaine transmembranaire hydrophobe qui
permet de fixer le rcepteur la membrane plasmique et un domaine intracellulaire qui
provoque une srie d'vnements biochimique l'intrieur de la cellule cible. La
conformation des rcepteurs de surface est variable.
Les effecteurs sont des enzymes coupls ces rcepteurs et qui catalysent la formation de
messagers secondaires. Les effecteurs sont activs lorsqu'une hormone ragit avec le
rcepteur coupl. L'activation de l'effecteur n'est pas directe et se fait par une molcule
intermdiaire. Par exemple : la protine G. Celle-ci est constitue de 3 sous-units , et .
Lorsque l'hormone se fixe sur le rcepteur l'extrieur de la membrane, le changement de
la gomtrie du rcepteur active la protine G dont l'unit est libre. Celle-ci est active
par une molcule de GTP. La sous unit G peut alors ragir avec des protines diffrentes
qui conduisent des cascades de signalisation. Les rcepteurs utilisant la protine G sont
les RCPG (rcepteurs coupls avec la protine G).
Dans ce cas, le complexe hormone-rcepteur provoque la libration d'un second messager
intracellulaire (= AMP cyclique) qui amplifie le signal hormonal. L'augmentation de la
concentration intracellulaire de l'AMP cyclique provoque au niveau de la cellule cible des
changements physiologiques (effet de l'hormone).
La protine G active peut activer son tour l'enzyme adnyl-cyclase. Cette dernire,
localise sur la face interne de la membrane plasmique, catalyse la formation d'AMP
cyclique en prsence dATP. Ce messager
secondaire est produit en grande quantit
partir d'un seul signal. Cet AMP cyclique
peut dclencher une cascade de raction
ou interagir avec les protines CREB. Ces
molcules sont directement lies l'ADN
et en rgule la transcription en fonction
de la concentration en AMP cyclique.
Cest donc bien l'augmentation de la
concentration intracellulaire de l'AMP
cyclique qui provoque au niveau de la
cellule
cible
des
changements
physiologiques (effet de l'hormone).
Prenons un autre exemple : lactivation de la Protine Kinase C (PKC). La stimulation
d'autres RCPG peut engendrer la stimulation d'autres enzymes. La protine G peut activer
la phospholipase C (qui clive un glycoside de la membrane) en se liant au GTP. Deux units
sont gnres : le 1,2- diacylglycrol (DAG) qui reste dans la membrane et l'inositol 1,4,5-

67

triphosphate (IP3) qui est libr dans le cytosol. Ce driv sucr IP3 dclenche l'ouverture
de canaux ions calcium dans les rticulums endoplasmiques. La concentration en Ca2+ est
donc
augmente.
Cette
augmentation
a
diffrentes
consquences : les cations de
calcium
se
lient
avec
la
calmoduline en modifiant la
structure de cette dernire qui est
alors capable d'interagir avec un
grand nombre d'autres protines
(AMPc phosphodiestrase, oxyde
nitrique
synthase,
protines
kinases ou phosphatases,...) qui
contrlent
des
facteurs
de
transcription.

Le calcium peut tre utilis comme messager grce la

calmoduline (= une protine rgulatrice sensible au
calcium qui active ou inhibe l'action d'autres protines).
En liant le calcium, la calmoduline change de conformation
et expose des sites d'interaction avec certaines protines.
Ces sites dinteraction sont reconnus par une protine
grce lactivation de la calmoduline.

68

THEME II : Biochimie Mtabolique

A) Catabolisme du glucose :
Chapitre 1 : Introduction
Le mtabolisme est lensemble des transformations, des processus biochimiques qui
saccomplissent dans tous les tissus de lorganisme vivant pour difier les structures
cellulaires, emmagasiner ou librer de lnergie (dpense nergtique, changes,
nutrition).
Dans la cellule, on distingue deux grandes classes bionergtiques :
- Lanabolisme : Ensemble des ractions qui provoquent la synthse de macromolcules
partir de mtabolites plus petits et dnergie.
Ex : synthse de lADN partir de nuclotides et dnergie, synthse de protines partir
dacides amins et dnergie

- Le catabolisme : Ensemble des ractions qui provoquent la dgradation de

macromolcules complexes pour donner des molcules plus petites et simples avec une
production dnergie. Lanabolisme rcupre une partie de lnergie libre par le
catabolisme.

Les ractions biochimiques obissent aux lois de la thermodynamique. Nous allons donc en
rappeler les principales notions :
* Systme ouvert : Systme qui change matire et nergie avec lextrieur. Les systmes
biologiques sont des systmes ouverts.
* Entropie : S > 0. Il y a augmentation de lentropie, du dsordre, pour quun systme
ouvert volue spontanment. Attention, il faut prendre en compte toutes les variables !
Exemple : passage de luf au poussin.

Le poussin est plus ordonn que luf. On aurait donc tendance croire quil y a eu baisse
de lentropie (S<0), alors quil sagit bien l dun systme ouvert voluant spontanment.
Mais si on considre le systme dans son ensemble, le bilan est tel que S > 0 car les autres
produits augmentent lentropie de lenvironnement. La vie ne se maintient quen
produisant une augmentation de lentropie de lenvironnement.

69

Energie libre de Gibbs : G = H + TS

G < 0 : raction exergonique, qui peut se produire spontanment. (exothermique)
G > 0 : raction endergonique, qui ne peut se produire spontanment. (endothermique)
G = 0 : raction lquilibre.
Dans les conditions standards (C= 1mol/l et P = 1 atm.), on dfinit la variation dnergie
libre standard comme tant G. Les enzymes ne peuvent catalyser que les ractions
spontanes (G<0).
Pour une raction A+B C + D
[C]q . [D]q.
K q =
[A]q . [B]q
G = G + RT ln (Kq)
Donc, lquilibre, G = -R.T.ln (Kq). Cette expression nous apprend quen jouant sur la
concentration des ractifs et des produits, on peut influencer la spontanit de la raction.
Dans quel sens va aller la raction ?
Kq
G
Sens
1000
-4,08 kcal/mol

1
0
quilibre
0,001
4,08 kcal/mol

Les variations dnergie libre sont additives :

AB
G > 0 = 2 kcal/mol
BC
G < 0 = -8 kcal/mol
AC
G < 0 = -6 kcal/mol
Cest le couplage des ractions qui rend lensemble possible.
Attention: G change au cours de la raction, tandis que G reste constante.
Pour les ractions qui se passent dans une cellule, on a dfini G, qui tient compte des
protons dans le milieu (pH):
G = G 2,03 RT m log[H+]
o m est le coefficient des protons (des H+).
+ si H+ est un ractif.
- si H+ est un produit.
Les cellules ont besoin dnergie pour la fabrication des macromolcules et le mouvement
en gnral. Lnergie libre libre par les ractions nergtiques est transporte sous une
forme particulire, lATP (voir ci-dessous) ou lun des autres nuclosides triphosphates
(GTP, )

70

LATP possde deux types de liens avec les phosphates : 1 liaison ester et 2 liaisons
anhydrides. Ces dernires sont dites riches car elles contiennent beaucoup dnergie.
ATP + H2O ADP + Pi
G = -7,3 kcal/mol.
Leur hydrolyse est donc exergonique, cest la raison principale qui explique que lATP est
riche en nergie. Nanmoins, on peut galement citer les nombreuses formes de
rsonnances du phosphate inorganique. Les rpulsions lectrostatiques importantes des 4
charges ngatives dans lATP (moins de rpulsion dans lADP) et le plus haut degr
dhydratation des produits ADP et Pi que de lATP.
Il existe plusieurs mcanismes qui fournissent de lATP la cellule :
* Fermentation lactique : Raction anarobie menant la formation de lactate
(=CH3-CH-OH-COOH)
* Fermentation alcoolique : Raction anarobie menant la formation dthanol
(=C2H5OH). On connat cette fermentation depuis lAntiquit par la fabrication du
vin et de la bire, mais elle na t comprise que rcemment. Pasteur a t le premier
dcouvrir que cest un organisme, la levure qui se trouve sur la peau des raisins,
qui est la cause de ce phnomne. Ensuite, ce sont les frres Bruckner qui ont
dcouvert par hasard que la fermentation pouvait tre obtenue laide dextraits de
levure (pas uniquement partir de lorganisme tout entier mais au dpart de
fragments).
* Respiration cellulaire : Raction arobie menant la formation du dioxyde de
carbone et deau. Cest le cycle de Krebs, qui est utilis par les animaux.
Chacun de ces mcanismes commence par un tronc commun, qui est appel
glycolyse.

71

Chapitre 2 : Glycolyse
La glycolyse est un processus qui permet la cellule, grce la transformation du glucose
en pyruvate par une srie dtapes, de rcuprer de lnergie

Pour une cellule eucaryote, la glycolyse consiste en une srie de 10 ractions se droulant
dans le cytosol et peut tre dcompose en 3 parties :
- La squestration et lactivation du glucose.
- Le clivage du glucose en 2 entits 3 carbones.
- La formation dATP par oxydation des 2 entits 3 carbones en pyruvates.

1re raction : Phosphorylation du glucose

Bilan : ATP + -D-glucose ADP + -D-glucose-6-P. Cette raction est catalyse par
des enzymes : hexokinase (dans le cas de la levure) ou glucokinase (dans le cas du
foie).
La raction est un quilibre que lon tire vers la droite grce un couplage
nergtique avec lATP. Le G de la raction est alors trs ngatif, ce qui en fait une
raction spontane.

2me raction : Isomrisation du glucose-6-phosphate en fructose-6-phosphate

Bilan : -D-glucose-6-P -D-fructose-6-P. La raction est catalys par la

phosphoglucose isomrase.
Notons que lisomrisation de laldose en ctose se produit aprs dcyclisation du
glucose-6-phosphate.

72

3me raction : Phosphorylation du fructose-6-phosphate en fructose -1,6

bisphosphate.

Bilan : -D-fructose-6-P + ATP -D-fructose-1-6-diphosphate + ADP

La raction est catalyse par la 6-phosphofructokinase, une enzyme qui est
rgulatrice (son activit dpend de faon complexe de la vitesse de la raction. Son
activit augmente en prsence dAMP et dADP mais diminue sil y a un excs dATP).
La raction possde un G ngatif et est donc spontane.

4me raction : Clivage aldolique du fructose -1,6 bisphosphate.

Bilan : -D-fructose-1-6-bisphophate glycraldhyde-3-P + dihydroxyactone-1-P.

La raction, catalyse par laldolase, consiste cliver le fructose-1-6 bisphophate en
2 trioses phosphats au niveau des carbones 3 et 4.
Parmi ces 2 trioses phosphats, seul le glycraldhyde-3-P est directement dgrad
dans les tapes suivantes de la glycolyse.
La raction possde un G positif, ce qui indique quelle est dfavorable mais elle
entraine la disparition des produits dans les tapes ultrieures. Une diminution de
la concentration des produits entraine une diminution de lnergie libre de Gibbs.

5me raction : Isomrisation des 2 trioses.

73

Bilan : Dihydroxyactone-1-Phosphate glycraldhyde-3-Phosphate

Le dihydroxyactone-1-phosphate est rversiblement transform en
glycraldhyde-3- phosphate par un enzyme (triose phosphate isomrase).
La raction possde un G positif mais la consommation du GAP dans les tapes
ultrieures va pousser lquilibre vers la droite.
Lenzyme considr dans cette raction est une structure cylindrique complexe
(8 feuillets parallles, 8 hlices ). La boucle de son site catalytique est compose
de glutamate (acide faible) et dhistidine (base faible). Dans lespace, cette boucle
forme une espce de couvercle au dessus du cylindre.
Lorsque le GHAP arrive au niveau du site catalytique de lenzyme, le glutamate capte
un proton au niveau du carbone (permet de passer de sa forme carboxylate sa
forme acide carboxylique) et le carbonyle du DHAP capture un proton de lhistidine.
Aprs cette prototropie, on forme un intermdiaire enediol. Ensuite, lhistidine
dprotonne le groupement hydroxyle du carbone 1. Il sen suit le rabattement du
doublet non-liant de loxygne sur la liaison C-O, ce qui induit lattaque de la double
liaison C=C sur le proton du glutamate.
Ainsi, on cr le GAP. On est donc pass dune ctose un aldose.
Lors de cette raction, on a cr un intermdiaire enediol. Celui-ci pourrait se
convertir spontanment en methylglyoxal en jectant dans le milieu son
groupement phosphate. Pourtant, on observe la poursuite de la raction dcrite plus
haut qui est moins favorable thermodynamiquement parlant. Ceci peut sexpliquer
grce la structure tridimensionnelle du triose phosphate isomrase. En effet, la
boucle de lenzyme va fermer le site actif de tel manire aucune autre raction ne
soit possible. De plus, la formation de ce methylglyoxal serait une impasse
mtabolique car le produit stopperait la srie de raction menant aux pyruvates.

6me raction : Oxydation-phosphorylation du GAP en 1,3-bisphosphoglycrate

Bilan : Glycraldhyde-3-phosphate +Pi + NAD+ NADH + H+ + 1,3-bisphosphoglycrate

La raction est catalyse par la D-glycraldhyde phosphate dshydrognase
(GAPDH) et est particulire pour deux raisons :
Cest la premire raction o on rcupre une partie de lnergie.

74

 On fait intervenir des agents oxydants particuliers : le nicotinamide adnine

dinuclotide. On couple la raction de phosphorylation (oxydative), avec la
rduction du NAD+ en NADH. Cest donc une raction redox.
Le NAD+ (nicotinamide adnine dinuclotide) intervient comme accepteur dlectrons.
Cest un coenzyme doxydorduction. (Rem : un coenzyme est une molcule
indispensable au fonctionnement de la raction. Il agit au niveau du site actif de
lenzyme. Il est transform par la raction mais sera rgnr un autre moment. Il
faut aussi noter que toutes les enzymes nont pas besoin dun coenzyme)
On passe donc de la forme oxyde (NAD+) la forme rduite (NADH) par capture
dun hydrure H-.

Il existe dautres agents rducteurs mais on nutilise en gnrale NAD+/NADH pour

loxydation dun alcool en aldhyde ou ctone. Les deux structures se ressemblent
beaucoup mais on sait aisment les distinguer par spectrophotomtrie. En effet,
260 nm, on observera labsorbance des deux composs mais majoritairement de la
forme oxyde (NAD+). A 340 nm, on observe labsorbance que de la forme rduite
(NADH).

7me raction : Formation dATP par transformation du 1,3 bisphosphoglycrate en 3

phosphoglycrate.

Bilan : 1-3-diphosphoglycrate + ADP 3-phosphoglycrate + ATP.

Cette raction est catalyse par la phosphoglycrate kinase. Le clivage de la liaison
anhydride libre beaucoup dnergie. Cette nergie est suffisante pour former une
liaison riche dans lATP. Il y a donc couplage entre le clivage de la liaison anhydride et
la formation dATP.

75

Cest la premire tape qui forme une molcule dATP dans le processus de
glycolyse. Mais comme on avait 2 trioses au dpart (cfr. raction 5), on a rcupr
rellement deux molcules dATP.

8me raction : Isomrisation du 3 phosphoglycrate en 2 phosphoglycrate.

Bilan : 3-phosphoglycrate 2-phosphoglycrate

Cette raction est catalyse par la phosphoglycrate mutase qui va transfrer le
groupement phosphate du carbone 3 au carbone 2.

9me raction : Dshydratation du 2 phosphoglycrate en phosphonolpyruvate.

Bilan : 2-phosphoglycrate phosphonol pyruvate + H2O

La raction est catalyse par lnolase. Il sagit en fait dune raction rdox
intramolculaire : Le carbone 2 est oxyd tandis que le carbone 3 est rduit.
Cette raction va augmenter le potentiel de transfert du groupement phosphate par
la cration dune double liaison.

10me raction : formation dATP par transformation du phosphonolpyruvate en

pyruvate.

76

Bilan : Phosphonolpyruvate + ADP pyruvate + ATP

Cette raction est catalyse par le pyruvate kinase et consiste cliver une liaison
riche anhydride, librant beaucoup dnergie et permettant la formation dATP.
La toute dernire tape est une tautomrie nol-ctone. On cre prfrentiellement
la ctone car elle est plus stable que lnol.
Maintenant, nous pouvons faire le bilan global de la glycolyse :
Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ 2 pyruvates + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O
Rgulation de la glycolyse : Quand un muscle est au repos, il na pas besoin dune grande
source dnergie. Les 2 enzymes [la phosphofructokinase (PFK) et la pyruvate kinase (PK)]
qui rgulent la production de pyruvates sont alors inhibes par complexation avec lATP. Il
ny a donc pas de
production de pyruvate.
Une troisime enzyme
joue un rle dans la
rgulation de la glycolyse,
cest lhexokinase. Elle
bloque la transformation
du glucose-1-phosphate
en glucose-6-phosphate
(1me
raction).
Le
glucose-1-phosphate est
alors
transform
en
glycogne afin dtre
stock.
Au
moment
opportun,
il
pourra
revenir dans la glycolyse
par lune des voies
dentre. De nombreux
oses peuvent galement le
faire :
* Le glycogne :
Cest un matriel de rserve. Il est transform en glucose-1-phosphate par la
phosphorylase, et ensuite en glucose-6-phosphate par la phosphoglucomutase. Il
peut alors entrer dans la glycolyse.
* Le fructose :
Il y a deux possibilits :
a. fructose + ATP fructose-6-phosphate + ADP
Cest une raction qui se produit dans les muscles et dont lenzyme est
lhexokinase.

77

b. fructose + ATP fructose-1-phosphate + ADP

Cest une raction qui se fait dans le foie.
fructose-1-phosphate glycraldhyde + dihydroxactone-phosphate.
Le dihydroxactone-phosphate peut entrer dans la glycolyse, mais le
glycraldhyde doit encore tre transform.
Glycraldhyde + ATP glycraldhyde-3-phosphate + ADP
Cette dernire raction est catalyse par la kinase.
* Le mannose :
Le mannose est un pimre du glucose (il diffre de celui-ci par la position dun
groupement hydroxyle).
Pour entrer dans la glycolyse, on le transforme dabord en mannose-6phosphate, puis en fructose-6-phosphate.
* Le galactose :
Cest galement un pimre du glucose Le galactose a une voie trs particulire
dentre dans la glycolyse.
Il est tout dabord transform en galactose-1-phosphate.
Galactose + ATP galactose 1P + ADP
Le galactose -1-phosphate est lui-mme transform en glucose-1-phosphate par
un processus cyclique faisant intervenir lUMP, lUDP galactose et lUDP glucose.
Ensuite, le glucose-1-phosphate est transform en glucose-6-phosphate qui peut
alors rentrer dans la glycolyse.
Remarque : ce processus est fort compliqu. On pourrait imaginer un chemin
direct depuis le galactose-1-phosphate jusquau glucose-1-phosphate, mais
lenzyme ncessaire cette raction nexiste pas.
Pourquoi lArsenic est-il un poison ?
Dans lorganisme, lArsenic est sous forme darsnate. Il peut entrer dans la glycolyse en
ragissant avec le glycraldhyde-3-phosphate pour former le 1-arsno-3phosphoglycrate. Ce dernier va se transformer sans activit enzymatique pour donner le
3-phosphoglycrate ( un intermdiaire ultrieur de la glycolyse ) sans production dATP .
Sil ny a pas de production dnergie, la cellule meurt.

Comment le NAD+ est il rgnr dans la cellule ?

Il y a un rservoir limit de NAD+ dans la cellule. Il doit donc tre rgnr pour que la
glycolyse continue. Ceci est possible grce au mtabolisme du pyruvate.
Le pyruvate peut tre dgrad selon :
- 2 voies anarobies (sans oxygne) : processus de fermentation :
alcoolique production dthanol.
lactique production de lactate.
- 1 voie arobie plus complexe spcifique aux organismes arobies : la respiration
cellulaire.

78

Nous allons dtailler ces 3 mcanismes.

a)

Fermentation alcoolique :
Ce processus tait dj pratiqu chez les Romains pour la fabrication du vin. Louis
Pasteur a par la suite dmontr limportance des levures dans la fermentation du vin.
En 1925, Embden et Meyerhof ont lucid les mcanismes de fermentation.

Ce processus transforme tout dabord le pyruvate en un actaldhyde grce une

enzyme (la pyruvate dcarboxylase) : il y a donc perte dun carbone sous forme de
dioxyde de carbone. Une deuxime enzyme permet la rduction de lactaldhyde en
thanol. Cette tape gnre du NAD+ par loxydation du NADH.

Le bilan ractionnel de la fermentation alcoolique est :

1 glucose + 2 Pi + 2 ADP + 2 H+ 2 ethanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
Mme sils sont essentiels au processus global, le NADH et le NAD+ napparaissent pas
dans le bilan ractionnel. En effet, le NADH gnr par loxydation du glycraldhyde 3phosphate est consomm lors de la rduction de lactaldhyde en thanol. Ces
lments sont ainsi recycls . Ils sont par contre bien prsents dans le bilan
ractionnel de la glycolyse (voir prcdemment).

79

b)

Fermentation lactique :
La fermentation lactique a lieu dans des microorganismes anarobiques (bactries
lactiques par exemple) ou dans des organismes pluricellulaires lorsque la quantit
doxygne est limite (ex : Lors dun
effort intense et rapide, les muscles
vont produire du lactate. En
saccumulant dans le tissu, il va
provoquer les crampes).
La fonction ctone du pyruvate est
rduite en une fonction alcool avec
lintervention dune enzyme appele
lactate dshydrognase pour former du lactate. Il y a oxydation du NADH en NAD+.
La raction globale dans la conversion du glucose en lactate est :
1 glucose + 2 Pi + 2 ADP 2 lactates + 2 ATP + 2 H2O
Ici aussi, le NADH et NAD+ napparaissent pas car ils sont recycls. Le NADH form dans
loxydation du glycraldhyde 3-phosphate est consomm dans la rduction du
pyruvate.
Remarque : Il est aussi possible de rgnrer le NAD+ en absence de pyruvate. Dans ce
cas, cest le dihydroxyactone-phosphate, cr ltape de clivage, qui est rduit. Il y a
ainsi oxydation du NADH en NAD+. Lautre triose (glycraldhyde 3-phosphate) suit
quant lui la voie classique de la glycolyse.

c)

Respiration cellulaire :
De lnergie peut aussi tre extraite en arobiose par lintermdiaire du cycle de Krebs
ou cycle de lacide citrique. Dans un premier temps, le pyruvate est dgrad par
limination de 3 CO2. Ce nest que plus tard que loxygne intervient. Ce procd a un
double avantage : il y a non seulement rgnration de NAD+, mais aussi production
dATP.
Le cycle de Krebs constitue la premire phase de la respiration cellulaire. Il consiste
capturer des lectrons de haute nergie partir de molcules nergtiques carbones.
Ce nest que par la suite que ces lectrons serviront rduire O2 pour crer un gradient
de protons utilis pour synthtiser lATP. Ces deux dernires tapes constituent la
phosphorylation oxydative.

80

Chapitre 3 : Le cycle de Krebs

La dgradation arobie du glucose gnre de lATP. Elle commence par loxydation des
drivs du glucose en CO2. Cette oxydation seffectue dans le cycle de lacide citrique, aussi
appel cycle de Krebs ou cycle des acides tricarboxyliques (cycle ATC). Le prcurseur de ce
cycle est lactyl coenzyme A (Actyl CoA).
Ce cycle aboutit la dgradation complte du pyruvate. Il a pour fonction de rcolter des
lectrons de haute nergie partir des carbones des molcules nergtiques.

3.1. Historique :
- En 1935, Szent-Gyorgyi tudie la consommation dO2 par des fragments de muscles de
pigeons. Il dcouvre que ces fragments incubs dans une solution physiologique (dans une
capsule baromtrique) consomment de loxygne. Aprs une vingtaine de minutes, la
consommation de dioxygne cesse. Il observe quavec un jus de muscle press, la
consommation reprend. Il analyse alors le jus pour trouver la molcule qui est la base de
ce phnomne. Il dtecte du succinate (un acide 4 carbones).
Il en ajoute ses morceaux de muscles et la consommation d O2 reprend, mais de faon
beaucoup trop importante pour que ce soit simplement d une oxydation du succinate.
A la place de 3/2 O2, il constate une consommation de 70 100 oxygnes. Il en dduit que
le succinate a un rle catalytique.
Szent-Gyorgyi continue ses recherches et trouve quon peut avoir le mme type de
phnomne avec de lacide formique, de loxaloactate ou du malate.
Il observe que le rapport CO2 libr / O2 consomm dans la capsule est constant et met
alors lhypothse suivante :
C6H12O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
Succinate, Oxaloactate, Malate

- En 1953, Krebs reoit le prix Nobel pour avoir dcouvert le rle de lacide citrique et le
mcanisme cyclique.
- Plus tard, on dcouvre le lieu o se droule ce cycle. La cellule eucaryote se diffrencie de
la cellule procaryote non seulement par certains organites, mais aussi par la prsence dune
compartimentation du mtabolisme.
Alors que la glycolyse a lieu dans le
cytosol, la dgradation du pyruvate et le
cycle de Krebs ont lieu dans les
mitochondries, et plus exactement dans la
matrice
mitochondriale.
On
peut
apparenter la mitochondrie une usine
nergtique de la cellule eucaryote.

81

La mitochondrie est compose de 2 membranes :

- Membrane interne : Elle comporte une grande
surface car elle comprend de nombreuses
invaginations appeles crtes. Cette membrane est
impermable.
- Membrane externe : Elle est riche en porines
(canaux laissant passer les petites molcules). Elle
est donc permable aux petites molcules.
En entrant dans la mitochondrie, le pyruvate perd un groupement hydroxyle.

3.2. Ractions du cycle de Krebs :

Le pyruvate doit subir un traitement spcial avant de pouvoir entrer dans le cycle de
Krebs : une dcarboxylation oxydative. Cette raction irrversible reprsente le lien entre
la glycolyse et le cycle de Krebs.
- 1e tape : limination de CO2 formation dun carbanion (entit trs instable).
- 2e tape : oxydation du carbanion formation dun carbocation. Cette tape
transforme le NAD+ en NADH en captant les 2 lectrons mis.
- 3e tape : formation dun thioester (liaison entre latome de carbone et latome de
souffre) dans lActyl Coenzyme A.
G raction = -33,4kJ/mol
Cette raction est catalyse par la pyruvate dshydrognase (complexe multienzymatique : 3
enzymes et 5 co-enzymes).
Bilan :

Pyruvate + NAD+ + CoASH CO2 + NADH + Actyl Coenzyme A

La Coenzyme A (CoA-SH) est forme dun acide amin, dun nuclotide diphosphate et dun
groupement thiol. Cest un transporteur de groupements acyl. Le site ractif est le groupe
sulfhydryle terminal du CoA. Les groupes acyl se lient au CoA par une liaison thioester pour
former des acyl CoA. Cette liaison thioester est trs nergtique (lhydrolyse de lactyl CoA
est trs exergonique).
Actyl CoA + H2O

Actate + CoASH + H+

G= -31,4kJ/mol

82

Notons la diffrence par rapport aux autres modes de transformations du pyruvate. Ici,
celui-ci est oxyd tandis que dans les fermentations, le pyruvate tait rduit.

Le cycle proprement dit comporte 8 ractions rassembles en 6 tapes :

a) Condensation de lactyl CoA et de loxalo-actate :

Le cycle de Krebs commence par une condensation aldolique suivie dune hydrolyse. Cette
raction est catalyse par la citrate synthase.
Loxalo-actate se condense dabord avec lactyl CoA la suite de lattaque nuclophile du
carbone du carbonyle de loxalo-actate sur lactyl CoA pour former le citryl-CoA. Cest son
hydrolyse en CoA, trs exergonique, qui donne la raction un Gngatif cette raction.
Bilan:
oxalo-actate + actyl CoA + H2O citrate + CoASH + H+

b) Isomrisation du citrate en isocitrate :

Le citrate comporte 3 fonctions acides carboxyliques, do le nom de cycle des acides

tricarboxyliques que lon donne parfois au cycle de Krebs.
Le citrate nas pas de carbone asymtrique mais est chiral une transformation prs. On
parle alors dune molcule pro-chirale.
Le citrate subit dabord une isomrisation strospcifique pour donner le cis-aconitate.
Cette tape comprend la capture de lhydrogne R de lextrmit pro-R du citrate, la
formation dune double liaison temporaire ainsi que llimination de H2O. Lenzyme qui
catalyse cette raction est laconitase.
Notons que la raction est strospcifique car lenzyme ne capte que lhydrogne R de
lextrmit pro-R du citrate.

83

La deuxime tape est lhydratation strospcifique du cis-aconitate en isocitrate.

Laconitase est une protine fer-soufre. Un atome de fer est disponible pour la fixation du
citrate par lintermdiaire des groupes carboxyles et hydroxyles.
Le citrate peut se lier de deux configurations diffrentes laconitase :
* Lion Fe2+ de laconitase est en liaison ionique au carboxyle C-1 et aux groupes
carboxyle et hydroxyle du C-3 du citrate. Dans ce cas, lhydrogne R de lextrmit
pro-R du citrate est dans une position qui permet quil soit arrach. Ce nest pas le
cas de lhydrogne S qui est trop loign du lieu de captage.
* Lion Fe2+ de laconitase est en liaison ionique avec le carboxyle C-5 et les groupes
carboxyles et hydroxyles du C-3 du citrate. Dans ce cas, les hydrognes de
lextrmit pro-R du citrate sont trop loigns pour pouvoir tre arrachs.

Le citrate peut donc se lier laconitase de 2 faons, mais seule la premire dentre elle
permet darracher le proton
c) Oxydation et dcarboxylation de lisocitrate :
Cette tape est la premire raction doxydationrduction du cycle de Krebs. Elle est catalyse
par lisocitrate dshydrognase.
Lisocitrate est oxyd en un intermdiaire
instable : loxalo-succinate. Le NAD+ est quant
lui rduit en NADH, crant ainsi le premier
transporteur dlectrons de haut potentiel de
transfert du cycle. Lintermdiaire est par la suite
dcarboxyl pour donner l-ctoglutarate.

84

d) Dcarboxylation oxydative de l-ctoglutarate

La dcarboxylation oxydative de l-ctoglutarate aboutit la formation du succinyl-CoA.

Cette raction est semblable la dcarboxylation oxydative du pyruvate (limination de
CO2), formation dun carbanion oxyd en un carbocation puis formation dun lien thioester
riche en nergie. Les deux enzymes impliques, -ctoglutarate dshydrognase et
pyruvate dshydrognase, utilisent le mme chemin ractionnel.

Bilan : -ctoglutarate + NAD+ + CoASH CO2 + NADH + H+ + succinyl CoA

Pour rappel : les dcarboxylations oxydatives sont des ractions irrversibles.
e) Conversion du succinyl CoA en succinate :

Le succinyl CoA est un compos thioester riche en nergie. Le clivage de sa liaison carbone souffre est coupl la phosphorylation du GDP. Cette raction est catalyse par la succinyl
CoA synthtase.
Clivage du lien C-S :

G = -8 kcal/mol

85

Formation de la GTP : G = 7,3 kcal/mol

G raction = -0,7 kcal/mol.
f) Rgnration de loxalo-actate par oxydation du succinate :

La dernire tape du cycle est bien entendue la rgnration de la molcule de dpart :

loxalo-actate. Cette raction convertit un groupe mthylne (CH2) en un groupe carbonyle
(C=O) en 3 tapes :
1. Oxydation : Le succinate est oxyd en fumarate grce la succinate dshydrognase.
Il y a formation dune double liaison entre le carbone 2 et le carbone 3. Cette
raction ncessite lintervention dun autre cofacteur que le NAD+ : le FAD (Flavine
Adnine Dinuclotide), qui constitue lentit ractive.
Les azotes des 3 cycles sont les sites capteurs
dhydrognes (voir plus bas). Sa forme rduite, le
FADH2, est cre au cours de cette tape.
Alors que le NAD+ intervient dans les oxydations
dalcools en aldhydes puis en acide
carboxylique, le FAD est quant lui spcifique
des ractions doxydations avec formation dune
double liaison C=C.

86

2. Hydratation du fumarate en L-malate avec lintervention de la fumarase qui catalyse

une addition-trans spcifique dun atome dhydrogne et dun groupe hydroxyle.
Cette raction est strospcifique car le groupe hydroxyle ne sadditionne que dun
seul ct de la double liaison du fumarate. Seul lisomre L du malate est form.

3. Oxydation : Le malate est oxyd en oxalo-actate. On observe le passage dune

fonction alcool une fonction carbonyle. Cette raction est catalyse par la malate
dshydrognase. Le NAD+ est le capteur dhydrogne et est rduit en NADH.
Le G de cette raction est positif. Loxydation du malate est nanmoins favorise
car loxalo-actate est rutilis dans le cycle de Krebs.
Globalement, le cycle de Krebs se schmatise comme suit :

La raction globale du cycle de Krebs est :

Actyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2H+ +CoA

87

- Il y a production dnergie via le GTP, le NADH et le FADH2.

- Deux atomes de carbone entrent dans le cycle par condensation de lactyl CoA
avec loxalo-actate et 2 atomes de carbone quittent le cycle sous forme de CO2 lors
des dcarboxylations.
- 4 paires datomes dhydrogne (cest--dire 8 lectrons) quittent le cycle lors des
quatres ractions doxydation : 3 molcules de NAD+ et une molcule de FAD sont
rduites.
Finalement, le pyruvate a t compltement dgrad, gnrant du GTP, du CO2 et des
lectrons de haute nergie sous forme de NADH et FADH2.

Remarques :
- Il faut plusieurs tours de cycle pour que tous les C de lactyl CoA soient sous forme de
CO2.
- La raison de ce mcanisme compliqu est quil permet de rcuprer de lnergie (ATP,
GTP) mais aussi quil permet des ractions chimiques complexes (oxydation du pyruvate,
du mthyl) dans des conditions mnages.
- On na pas encore vu le rle de lO2 dans la respiration qui doit pourtant tre arobie. Les
atomes doxygne du CO2 produit ne sont pas ceux de lO2 inspir.
- Les cofacteurs doivent encore tre rgnrs. Il y a production dun NADH ds lentre du
cycle et de trois autres ensuite, plus un FADH2.
- La rcupration dnergie parat faible jusquici : seulement 1 GTP et 2 ATP de la glycolyse
rcupre, alors quon sait que 38 ATP sont produites.

3.3. Contrle du cycle de Krebs :

Lentre dans le cycle de Krebs et le mtabolisme en son sein sont
contrls. Le pyruvate peut tre retransform en glucose. Les 2
voies, glycolyse et noglucogense ne sont bien sr pas
oprationnelles en mme temps dans la cellule. Il y a donc des
voies de rgulation.
La synthse de lactyl CoA est quant elle une tape irrversible.
Lactyl CoA est un intermdiaire mtabolique qui intervient dans
diffrentes voies mtaboliques. Les molcules de glucose ont deux

88

chemins possibles : loxydation en CO2 via le cycle de Krebs avec cration dnergie ou
lincorporation dans les lipides.
a) Rgulation de la pyruvate dshydrognase
La pyruvate dshydrognase occupe un rle
critique dans le cycle de Krebs. Son activit est donc
rgule. Le complexe est inhib par ses produits
immdiats : le NADH et lactyl CoA. En prsence
dun rapport ATP/ADP lev, une kinase spcifique
phosphoryle un rsidu srine de la pyruvate
dshydrognase rendant celle-ci inactive.
Si le rapport ATP/ADP est bas, une autre enzyme, la
phosphatase, entre en jeu pour ractiver la
pyruvate dshydrognase en liminant la
phosphorylation.
b) Le cycle de Krebs est contrl diffrents endroits

Le cycle de Krebs est rgul essentiellement par la

concentration dATP et de NADH. Les points de
contrle sont les enzymes isocitrate dshydrognase
et l-ctoglutarate dshydrognase.
Lisocitrate est active si la cellule est appauvrie en
nergie et dsactive en prsence taux lev dATP.
L-ctoglutarate est inhib par les produits des
ractions quelle catalyse et en prsence dun taux
lev dATP.
La vitesse du cycle est donc rduite lorsque la cellule a
un taux lev dATP.

Le cycle de Krebs est la voie majeure de dgradation pour la cration dATP. Mais ce cycle
est un centre mtabolique pour la cellule. Ainsi, les entits qui interviennent dans le cycle
interviennent aussi dans dautres voies biosynthtiques.
Si les intermdiaires du cycle sont utiliss pour des biosynthses, cela signifie quils doivent
tre rgnrer.
Loxalo-actate peut tre form par carboxylation du pyruvate, raction catalyse par la
pyruvate carboxylase. Cette raction cote donc de lnergie puisque lATP est hydrolyse
en ADP.
Pyruvate carboxylase

Pyruvate + CO2 + ATP + H2O

oxalo-actate + ADP + Pi + 2H+

89

Nanmoins, comme le cycle de Krebs est un cycle, il peut tre recharg par la cration de
nimporte lequel de ses intermdiaires.

90

Chapitre 4 : La chaine respiratoire

Le NADH et le FADH2 forms lors de la glycolyse et du cycle de lacide citriques sont des
molcules riches en nergie car elles possdent chacune une paire dlectrons de haut
potentiel de transfert. Cinq paires dlectrons de ce type sont cres. Ces lectrons sont
utiliss pour rduire loxygne en eau, librant ainsi une grande quantit dnergie qui peut
tre utilise pour crer de lATP.
La phosphorylation oxydative est le processus au cours duquel lATP est form lorsque des
lectrons sont transfrs du NADH ou du FADH2 O2 par une srie de transporteurs
dlectrons. Cest laboutissement de la respiration cellulaire. Tout ceci seffectue grce un
gradient de protons tablit de part et dautre de la membrane mitochondriale interne.

4.1.

Introduction : La synthse dATP par la phosphorylation oxydative

Les lectrons haut potentiel de transfert sont les produits des ractions
doxydorduction.
Forme oxyde + e- forme rduite
G= -nF E
O E = diffrence de potentiel standard doxydorduction pH7 et 25C dfini par
rapport H2 2H+ + 2e- o E= 0
Ex : Pour loxydation du NADH et du FADH2
NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+
FAD + 2H+ + 2e- FADH2

E= - 0,32 V
E= - 0,22 V

On peut donc calculer le G de leur oxydation :

NADH NAD+ + 2e-+ H+
G= -2 96,48 kJ.mol-1 V-1 (+0,32V)
= - 61 kJ.mol-1 ou -14,8 kcal.mol-1
FADH2 FAD + 2e- + 2H+

G= -2 96,48 kJ.mol-1V-1 (+0,22V)

= - 42 kJ.mol-1 ou -10,1 kcal.mol-1
Loxydation du NADH et du FADH2 est exergonique. Lnergie libre est utilise pour
crer un gradient de protons qui est ensuite utilis pour la synthse de lATP.
Loxydation du NADH et du FADH2 est souvent coupls avec la rduction dO2 en H2O. Il
y a un transfert des lectrons capts par le NADH et le FADH2.
NADH NAD+ + H+ + 2eE= + 0,32 V
+
O2 + 2H + 2e H2O
E= + 0,82 V
----------------------------------------------NADH + O2 + H+ H20 + NAD+
G= -2 96,48 kJ.mol-1 V-1 0,32V 2 96,48 kJ.mol-1V-1 0,82V = -220,1 kJ.mol-1

91

Pour le FADH2 : FADH2 + O2 FAD + H2O

Ces ractions ont un G < 0. Elles sont ensuite couples avec la production dATP.
La rduction trs exergonique de loxygne molculaire par le NADH et le FADH2 seffectue
dans de nombreuses ractions de transfert dlectrons au sein dun groupe de protines
membranaires appel chane de transport des lectrons.
Le cycle de Krebs ne consomme pas dO2 bien quil ne sopre quen arobie.
Actyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP+2H++ CoA
Nous avons vu que le NADH est un rtro inhibiteur du cycle de Krebs. Comme il est aussi
utilis pour rduire lO2, si lactivit du cycle diminue, la rduction dO2 sera moins
importante.
Rem : un homme consomme environ 2000 kcal/jour, ce qui reprsente lhydrolyse de 83 kg
dATP. Comme le corps humain ne contient que 250 g dATP, une molcule dATP doit alors
Pi
subir le cycle ADP
ATP 300 fois par jour.
Historique :
En 1935, Engelhardt dcouvre le rle du dioxygne pour la production dATP en tudiant la
respiration cellulaire dans les globules rouges. Il tudie la respiration sur des globules
rouges, et observe la production dATP in vivo, mais seulement en prsence dO2. Il tablit
donc un paralllisme entre la ventilation et la production dATP. Par contre, in vitro, si les
globules rouges sont lys, il nobserve pas de production dATP (inhibition de la synthse
dATP), mme en prsence dO2. De plus, si on ajoute de lATP, celui-ci est consomm. En
fait, en lysant les globules rouges, il a libr des ATPases qui clivent lATP.
- En 1937, Kalckar dtruit lactivit biologique de lATPase, elle lysant lenzyme. Pour cela, il
va utiliser un enzyme qui ragit plus vite que lATPase. On prend lhexokinase dont le Km (=
10-6M) est plus petit que le Km de lATPase (= 10-2M). Si son Km est plus petit, il aura
consomm tout lATP avant que lenzyme nait le temps dinteragir.
Km = concentration la demi vitesse maximum.
Lhexokinase est facilement dosable. Sa prsence empche le masquage de la production
dATP, car elle catalyse la raction suivante :
Glucose + ATP glucose-6-phosphate + ADP
Kalckar montre ainsi quil y a une grande production dATP, mme in vitro. En mesurant la
concentration de glucose-6-phosphate, il tablit un rapport P (fix sur glu)/O2(absorb)
valant 2,5
Or on connat loxydation du pyruvate :
pyruvate + 5/2 O2 2 H2O + 3 CO2
G = -280 kcal/mol
Comment sont produites ces molcules dATP?
- Keelin, parasitologue, observe un changement de couleur des pattes de moustiques en
fonction de leur mouvement: au repos ou agit.

92

Au repos : Le muscle est oxygn (prsence dO2)  la molcule colore est sous la forme
oxyde
Agitation : Le muscle nest pas fort oxygn  forme rduite de la molcule  3 raies
nettes dans le vert.
Keelin met ainsi en vidence des protines (les cytochromes c ) prsentes dans les
mitochondries des cellules du muscle. Ces cytochromes ont un petit poids molculaire et
comportent un groupement hme apparent lhme de lhmoglobine.
La dcouverte des cytochromes a permis la comprhension des phnomnes
doxydorduction de la rcupration dnergie. Ce sont des lments capitaux de la
rcupration dnergie.
Localisation :
La phosphorylation oxydative et
la synthse de lATP ont lieu au
niveau de la membrane interne
des mitochondries.
On compte de 1 500 000
mitochondries par cellule. Une
cellule cardiaque en comprend
1000.
La membrane externe est
permable aux petites molcules
tandis que la membrane interne est impermable. Celle-ci est compose de 80% de
protines et 20% de lipides.

4.2.

La chaine respiratoire:

a) Vue densemble :
La chane respiratoire, ou chane de
transfert des lectrons, est constitue de 4
complexes : 3 pompes protons et un lien
physique avec le cycle de lacide citrique.
Les lectrons sont transfrs du NADH O2
travers 3 complexes protiques : le NADHQ oxydorductase (complexe I), Qcytochrome c oxydorductase (complexe III)
et le Cytochrome c oxydase (complexe IV). Le
complexe II, le succinate Q-rductase, est un
complexe de branchement . Tous les
complexes sauf le II sont des pompes
protons, cest--dire quils jectent des
protons vers lespace inter-membranaire de

93

la mitochondrie. Le flux dlectrons travers ces complexes transmembranaires

conduit au transport de protons travers la membrane interne de la mitochondrie.
Le complexe I rcupre 2 lectrons qui sont transports au complexe III par la forme
rduite du coenzyme Q aussi appel ubiquinone.
Lubiquinone transfre aussi les lectrons du FADH2 produit dans la succinate
dshydrognase du cycle de lacide citrique vers le complexe III par lintermdiaire du
complexe II. Le cytochrome c, petite protine, transporte les lectrons du complexe III
au complexe IV qui catalyse la rduction dO2.
Ces complexes sont spcifiques du NADH ou du FADH2. Ils sont constitus de
groupements prosthtiques (groupes qui contiennent des entits organomtalliques).

b) Entre des lectrons dans la chane au niveau de la NADH-Q oxydorductase

94

Les lectrons qui proviennent de loxydation du NADH en NAD+ lors du cycle de Krebs
entrent dans la chane respiratoire au niveau de la NADH-Q oxydorductase aussi
appele NADH dshydrognase. Il sagit dune norme enzyme dont la masse est
suprieure 900 kDa et qui est constitue de 46 polypeptides. Ses protines sont
codes par les gnomes cellulaire et mitochondrial. Elle joue un rle de pompe
protons vers lextrieur de la mitochondrie.
La NADH-Q oxydorductase a une forme de L avec un bras horizontal situ dans la
membrane et un bras vertical dans la matrice mitochondriale.
Elle comporte 2 types de groupes prosthtiques : la FMN et un centre Fe-S.
La raction quelle catalyse est :
NADH + Q oxidoreductase + 5 H+ matrice NAD+ + Qoxidoreductase-H2 + 4 H+cytosol
Cette raction consomme donc 2 lectrons et libre 4 H+.
Le NADH se lie un site du bras vertical de la NADH-Q oxydorductase et transfre ses 2
lectrons de haut potentiel au FMN. Le FMN, Flavine Mononuclotide, est un groupe
prosthtique de type organique dont les entits ractives sont les azotes (tout comme le
FAD). Elle fixe des protons lorsquelle est rduite.
Un intermdiaire radicalaire semi-quinone peut tre produit si la FMN naccepte quun
lectron, ou si la FMNH2 ne donne quun lectron.

Les lectrons vont ensuite voyager dans le bras vertical depuis le FMNH2 vers 3 centres
4Fe-4S. Les centres fer-soufre interviennent dans de nombreuses rductions dans des
systmes biologiques : Fe3+ + e- Fe2+.
Il existe plusieurs types de centres fer-soufre qui peuvent tous subir des ractions
doxydo-rduction. Celles-ci seffectuent gnralement sans libration ou fixation de
protons.
a) Un seul ion fer est li 4 rsidus cystine de la protine.
b) Ce centre contient 2 ions fer et 2 sulfures inorganiques. Ils sont gnralement
coordonns 4 rsidus cystine.
c) Ce centre contient 4 ions fer, 4 sulfures inorganiques et 4 rsidus cystine. Cest ce
type de centre quon retrouve dans laconitase.

95

Aprs tre passs dans les centres fer-soufre de la NADH-Q oxydorductase, les
lectrons sont apports au coenzyme Q qui est ensuite rduit en QH2 (ubiquinol) ce qui
donne lieu la capture de 2 protons. Les lectrons du QH2 sont finalement transfrs
un Q mobile qui peut diffuser dans la bicouche lipidique. Deux protons supplmentaires
sont capts de la matrice.
Cest le flux dlectrons du NADH au
coenzyme Q par lintermdiaire de la
NADH-Q oxydorductase qui conduit au
pompage de protons hors de la matrice
mitochondriale.
Le coenzyme Q est constitu disoprnes,
ce qui le rend hydrophobe et donc soluble
dans la bicouche lipidique.
Le coenzyme Q contient 2 centres
ctoniques qui sont ses entits ractives.
Laddition dun lectron et dun proton forme une semi-quinone radicalaire (QH.) qui
est facilement dprotonn pour former un anion radicalaire semi-quinone (Q.-).
Laddition dun second lectron et dun proton forme lubiquinol (QH2), forme
compltement rduite de Q.
Q + 2 e- + 2 H+ QH2

Lubiquinol est le point dentre des lectrons du FADH2. Lenzyme succinate

dshydrognase qui permet loxydation du succinate en fumarate dans le cycle de Krebs
et ainsi la libration dATP, fait partie du complexe II : le complexe succinateubiquinone rductase. Ce complexe est une protine de la membrane mitochondriale
interne.
Les lectrons du FADH2 sont transmis des centres fer-soufre puis Q pour entrer dans
la chane de transport des lectrons. Le FADH2 ne quitte donc pas le complexe. Dautres

96

enzymes interviennent pour transfrer leurs lectrons du FADH2 Q. Ce dernier est

ensuite rduit en QH2. Contrairement aux autres complexes, le complexe II nest pas une
pompe protons. Loxydation du FADH2 en FAD gnre 4 H+ de moins que celle du
NADH. Par consquent, moins dATP est form par loxydation du FADH2 que par celle
du NADH.
Intressons nous au transfert des lectrons de Q au cytochrome c via la Q-Cytochrome c
oxidorductase. Celle-ci est la deuxime pompe protons de la chane. Il catalyse le
transfert des lectrons de QH2 au cytochrome c oxyd. Il pompe en mme temps des
protons hors de la matrice mitochondriale.
QH2 + 2 cyt. cox + 2 H+matrice Q + 2 cyt. cred + 4 H+cyto
Structure du complexe III:

- 11 polypeptides
- 3 groupements hme : 2 hmes de type b, bL (low
affinity) et bH (high affinity) au sein du cytochrome b
Hme
et
un hme de type c au sein du cytochrome c1.
- 1 protine fer-soufre avec un centre 2Fe-2S. Il est
assez inhabituel car un des ions fer est coordonn 2
rsidus histidine et non cystine comme cest
habituellement le
cas. Cest ce centre
qui est impliqu
dans le transfert des lectrons au cytochrome
c.
Un cytochrome est une protine qui transfre
des lectrons. Il contient un groupe
prosthtique hme qui est un groupement
organomtallique form dun fer coordonn
4 azotes. Au cours du transfert des lectrons,
lion fer change dtat doxydation. Lhme des
cytochromes c est li par covalence la
protine via des liaisons de type thioester au
niveau du soufre des cystines.
c) Le cycle Q :

97

Le cycle Q correspond au transfert des lectrons de Q au cytochrome c et au transport

transmembranaire des protons. Il permet le passage entre lubiquinol, qui peut
transporter 2 lectrons, et le cytochrome c, qui ne peut en transporter quun. En effet, le
cytochrome c ne comporte quun groupement hme et donc quun seul atome de fer. Par
consquent, un seul lectron est utilis pour la rduction du Fe3+ en Fe2+. Le cytochrome
c est une protine membranaire priphrique hydrosoluble mobile.
Le complexe III contient 2 sites de liaison pour lubiquinone : Q0 et Qi, ce dernier est
situ plus prs de lintrieur de la matrice.
Lubiquinol se fixe au site Q0 et transfre ses lectrons lun aprs lautre. Ses protons
sont librs du ct du cytosol.
Le premier lectron est transfr au cytochrome c via le centre 2Fe-2S et le cytochrome
c1. Le cytochrome c passe de la forme oxyde la forme rduite. Il peut ensuite diffuser
lextrieur de lenzyme.
Le deuxime lectron est transfr au cytochrome bL, au bH, puis un Q li au site Qi. La
quinone est rduite en un anion semi-quinonique Q.- .
Au niveau du site Q0, le Q se dissocie puis est remplac par un nouveau QH2 qui va
ragir de la mme faon : un des lectrons est transfr via le centre 2Fe-2S et le
cytochrome c1 pour rduire un deuxime cytochrome c. Lautre lectron est transfr
au cytochrome bL, au bH, puis au QH.- li au site Qi. En mme temps quil reoit le
deuxime lectron, Q.- capte 2 protons du ct matriciel pour former QH2 ce qui cre un
gradient de protons.
Bilan du cycle : oxydation de 2 QH2 en 2 Q, rduction dun Q en QH2, rduction de 2
cytochrome c, libration de 4 protons ct cytoplasmique et extraction de 2 protons
ct matrice mitochondriale. Tous les lectrons ont bien t transfrs au cytochrome c.
Lorsquil est rduit (Fe3+ Fe2+), le cytochrome c se dsadsorbe du complexe III et
entre en interaction avec le complexe IV qui il transfre son lectron.
Ensuite, on observe le transfert des lectrons du cytochrome c au cytochrome c oxydase
(complexe IV)
La phase finale de la chane de transport des lectrons est loxydation du cytochrome c
(rduit prcdemment par le complexe III). Cette
oxydation est couple la rduction dO2 en 2
molcules dH2O. Cest le complexe IV qui catalyse
cette raction.
Le cytochrome c oxydase est compos de 13
polypeptides dont 3 sont cods par le gnome
mitochondrial. Il contient 3 groupes prosthtiques
(Hme a, a3, centre Cu) dont 2 avec du cuivre, ce qui
fait un total de 3 ions de cuivre : 2 dans un centre
CuA/CuA o ils sont lis par des cystines et un 3e,
CuB, coordonn 3 rsidus histidines. Cest le centre
CuA/CuA qui accepte les lectrons du cytochrome c
rduit (Cu2+ Cu+).

98

Cycle catalytique :
4 cyt. C (red.) + 8 H+ matrice + O2 4 cyt. C (ox.) + 2 H2O + 4 H+ cyto.

1) Au dbut du cycle, tous les groupes prosthtiques sont oxyds. Le cytochrome c

rduit transfre son lectron au centre CuA/CuA . Les lectrons passent ensuite sur
lhme a puis sur la3, pour finalement rduire le CuB (Cu2+ Cu+).
2) Un deuxime cytochrome c introduit un second lectron qui suit le mme chemin
que le premier, mais en sarrtant lhme a3 en rduisant son fer (Fe3+ Fe2+).
Cest sous cet tat doxydation que le fer peut se lier loxygne.
3) Le cytochrome c oxydase contient du cuivre et du fer ltat rduit. Il est prt
fixer loxygne.
4) Le centre Fe2+ fixe loxygne.
5) Loxygne li lhme a3 est rduit en peroxyde (O22-) par la
prsence de CuB. Il y ainsi cration dun pont peroxyde entre le
Fe3+ de lhme a3 et le CuB2+.
6) Une troisime molcule de cytochrome c cde son lectron
tandis quun proton est captur. La liaison O-O est clive. On a
donc un groupe ferryle Fe4+=O et un Cu2+-OH.

99

7) Grce un quatrime lectron et un deuxime proton, le groupe ferryle est

rduit en Fe3+-OH.
8) Deux protons supplmentaires sont pomps, ce qui permet la libration de 2
molcules deau. Lenzyme est de nouveau dans sa forme totalement oxyde.
Les quatre protons de cette raction viennent de la matrice. Quatre protons
chimiques sont capts sur la face matricielle pour rduire O2 en H2O. Quatre protons
pomps supplmentaires sont transports hors de la membrane et librs sur la face
cytoplasmique lors de la raction. Ces protons pomps augmentent lefficacit de la
mise en rserve dnergie libre sous la forme dun gradient de protons.
Bilan :
On tablit un gradient de protons de part et dautre de la membrane mitochondriale.
La rduction de NADH entrane lexpulsion de 10 H+ : NADH NAD+ + 2 eCelle du FADH2 ne libre que 6 H+ : FADH2 FAD + 2 eCette diffrence sexplique par le fait
que le complexe II nest pas une pompe
protons.
On observe plusieurs chutes dnergie
libre lorsque les lectrons passent du
NADH vers lO2 travers les complexes
I, III et IV.

Groupements hmes :
Diffrents groupes hmes sont prsents dans les complexes de la chane respiratoire :
Ils sont tous composs dun atome de fer au milieu dun groupement organique, la
porphyrine.
* Hme du cytochrome b : ne se lie pas par lien covalent avec la protine. Cest le
type dhme quon retrouve dans lhmoglobine et la myoglobine.
* Hme du cytochrome c : contrairement lhme du cytochrome b, il est li par
covalence la protine. Les liaisons sont de type thioester, formes par addition de
groupes sulfhydriles de rsidus cystines aux groupes vinyles de lhme.
*Hme du cytochrome a : diffre de lhme du cytochrome c de trois faons : il nest
pas li par covalence la protine, un aldhyde remplace un groupe mthyle et une
chane hydrocarbone en C15 remplace un des groupes vinyle.

100

d) Conservation du cytochrome c au cours de lvolution

Le cytochrome c est prsent dans tous les organismes possdant des chanes
respiratoires mitochondriales. Il a volu il y a plus de 1,5 milliards dannes et sa
fonction a t conserve durant toute cette priode. Ceci a t mis en vidence par le
fait que le cytochrome c de nimporte quelle espce eucaryote ragit in vitro avec le
cytochrome c oxygnase de nimporte quelle autre espce. De plus, on a observ que
certains cytochromes des procaryotes, comme ceux dune bactrie photosynthtique ou
dnitrifiante, ressemble assez fort au cytochrome c des mitochondries du cur du thon.
Cela montre que le cytochrome c est une solution
efficace de lvolution dans le transfert des lectrons.
La ressemble des cytochromes c se marque sur la
squence des acides amins : 26 des 104 acides amins
du cytochrome c ont t conservs depuis plus d1
milliard danne.
Un arbre phylogntique a pu tre tabli partir de la
squence des acides amins des cytochromes c. Il
montre les relations volutives entre plusieurs espces.
La longueur des branches est proportionnelle au
nombre de variations des acides amins.

101

Chapitre 5 : La synthse dATP

Le transfert de 2 lectrons du NADH vers le dioxygne formant une molcule deau est un
processus exergonique : G= -52,6 kcal. mol-1 ou -220,1kJ/mol.
O2 + 2H+ + 2 e- H2O
E0= 0, 82 V
+
+
+
NAD + 2H + 2 e- NADH + H
E0= -0, 32 V
Puisque la demi-raction du NADH possde le potentiel redox standard le plus ngatif, le
NADH va tre oxyd alors que le dioxygne sera rduit. La raction globale scrit :
NADH + O2 + 2H+ H2O + NAD+
E0= 1,14 V
Comme G= -nF E0, la variation dnergie libre standard doxydation du NADH est gale
-52,6 kcal. mol-1.
Comment loxydation du NADH est-elle couple la formation dATP (processus
endergonique) ?
ADP + pi + H+
ATP+H2O

5.1.

Hypothse de Peter Mitchell (1961) :

Son ide est que le transfert dlectrons

et la synthse de lATP sont coupls par
formation dun gradient de protons (ou
couplage chimiosmotique).
Nous avons vu que la chane de transfert
des lectrons conduit au pompage de
protons de la matrice vers le ct
cytosolique
de
la
membrane
mitochondriale interne. La concentration en H+ devient plus importante dans lespace
inter-membranaire que dans la matrice, la face matricielle est alors charge ngativement.
Cela cre un champ lectrique. Cette force protomotrice apporterait lnergie ncessaire
la synthse de lATP par lATP synthase.
On peut calculer la quantit dnergie libre associe ce gradient de protons.
H+ matrice H+ extrieur
G = 2,303 RT log 10

[H + ext. ]
+ ZFV
[H + matrice]
O Z = charge lectrique de lentit transporte
V = potentiel lectrique la membrane

Or pH= - log [H+]

G = 2,303 RT (- log 10[H+ matrice] + log 10[H+ extrieur]) + ZFV
G = 2,303 RT (pH matrice pH extrieur) + ZFV
Le pH extrieur est 1,4 unit plus bas que le pH matrice et V = 0,14 V
G = (2,303 x 8,32 x 10-3 x 310 x 1,4) + (1 x 96,48 x 0,14) = 21,8 kJ/mol ou 5,2 kcal/mol.
Le transport d H+ de la matrice mitochondriale vers lespace inter-membranaire
correspond une nergie libre de 5,2 kcal/mol dH+.

102

Divers arguments jouent en faveur de lhypothse de Mitchell :

1) Lajout dun dtergent une suspension de mitochondries abolit la synthse dATP. Le
dtergent dtruit la bicouche lipidique de la membrane. Cette exprience met donc en
vidence le rle de la compartimentation de la mitochondrie.
2) Isolement dune ATP synthase mitochondriale, enzyme capable de gnrer lATP partir
dADP et de Pi.
3) Des vsicules synthtiques ont t prpares, contenant de la
bactriorhodopsine et de lATP synthase. La bactriorhodopsine
est une protine qui pompe des protons lorsquelle est claire.
Exposes la lumire, ces vsicules synthtisent de lATP. La
chane respiratoire et lATP synthase sont donc des systmes
biochimiquement spars. Ils sont uniquement lis par une force
protomotrice.

5.2.

ATP synthase :

a) Structure de lATP synthase :

LATP synthase est constitue
de 2 sous-units:
- F0 est un segment hydrophobe
qui traverse la membrane
interne.
Cest une structure
cylindrique,
anneau
c,
compose de canaux protons
(10 14 selon les espces). Une
sous-unit a est associe
lanneau c et la sous-unit b
qui solidarise F0 et F1.
- F1 est quant lui extramembranaire et pointe vers la matrice mitochondriale. Il est constitu de 5 types de
chanes polypeptidiques : , , , et . Les 3 sous-units et les 3 sous-units sont
agences autour de la sous-unit . et se ressemblent du point de vue structural,
mais seul est impliqu dans la synthse de lATP. La tige centrale est constitue de et
. La sous-unit est asymtrique. Chaque sous-unit est donc associe diffremment
avec la sous-unit .
F0 et F1 sont lis de 2 faons : par la tige centrale et par une colonne extrieure
constitue dune sous-unit a, de 2 sous-units b et de la sous-unit .
Lanneau c et la tige sont les parties mobiles de lenzyme, tandis que le reste de la
molcule est une partie statique.
103

b) Rle de lATP synthase :

LATP synthase catalyse la formation dATP partir dADP et dePi.
ADP 3- + HPO42- + H+
ATP 4- + H2O

Mcanisme: Un atome doxygne de lADP attaque le phosphore du Pi ce qui forme un

intermdiaire pentacovalent. Son hydrolyse libre de lATP et bien sr, de leau.
Des expriences dchange isotopique ont permis de montrer comment le flux de
protons fournit lnergie ncessaire la synthse de lATP. Celles-ci consistaient
laisser incuber de lATP synthase avec de lADP, du Pi et H218O. On observe que lATP se
forme facilement en absence de protons. 18O est incorpor dans le Pi lors de la synthse
dATP et de son hydrolyse formant un Pi lourd .

LATP synthase a des affinits diffrentes pour lATP et lADP :

- ATP; Kd <10-12M
- ADP; Kd ~ 10-5M
Le rle du gradient de protons nest donc pas de former lATP mais de le dissocier et de
le librer du site catalytique.

5.3.

Modle de Paul Boyer (prix Nobel 1997) :

Sur base de ces observations, Paul Boyer propose un
mcanisme de synthse de lATP par changement de
conformation et daffinit. Selon lui, des changements de
proprits des sous-units de lATP synthase permettent
la liaison entre lADP et le Pi, la synthse de lATP et sa
libration.
La sous-unit est en rotation et a des interactions
diffrentes avec les 3 sous-units . Celles-ci peuvent
adopter 3 conformations qui ont des affinits diffrentes
pour les substrats :
- Conformation L (Loose, lche) : cette conformation fixe lADP et Pi mais ne peut pas
librer les nuclotides fixs.
- Conformation T (Tight, tendue) : cette conformation transforme lADP en ATP. Elle
a une trs grande affinit pour lATP. Cette conformation ne permet pas de relcher
lATP.

104

- Conformation O (Open, ouverte) : cette conformation peut se prsenter avec un

nuclotide li dans une structure semblable celles des conformations L et T, mais
elle peut aussi de transformer pour donner une conformation ouverte qui permet de
librer le nuclotide.

La sous-unit a un mouvement rotatoire de

sous-unit passe par les 3 conformations.
Sous-unit 1:
L
T
O
L
T
Sous-unit 2:
O
L
T
O
L
Sous-unit 3:
T
O
L
T
O

120 dans le sens anti-horlogique. Chaque

O.
T.
L.

Le passage de T O permet de librer lATP form en T, le passage de L T permet de

convertir lADP et Pi fix en ATP et le passage de O en L permet de capter lADP et le Pi.
LATP peut donc tre synthtise par lactivation de la rotation de la sous-unit dans une
direction approprie.
Cette rotation a pu tre observe grce un systme
exprimental constitu de sous-units 33. La partie
33 de lATP synthase est fixe sur une surface de
verre contenant des ions nickel car les sous-units
ont une forte affinit pour ces ions. La sous-unit est
lie un filament dactine marqu par fluorescence.
Par microscopie fluorescence, on a pu observer que
laddition dATP provoquait la rotation du
filament dactine dans le sens anti-horlogique : la
sous-unit tournait, active par lhydrolyse de
lATP. De plus, cette rotation seffectue par pas
de 120, chaque pas correspondant lhydrolyse
dune molcule dATP. Pratiquement toute
lnergie libre par lhydrolyse de lATP est
convertie en mouvement rotatoire. Cette
observation est la preuve du mcanisme
rotationnel de la synthse de lATP.

105

Comment le flux de protons travers F0 active-t-il la rotation de la sous-unit ?

Ce mcanisme dpend de la structure des sous-units a et c de F0. La sous-unit c est
constitue de 2 hlices qui traversent la membrane. Un rsidu aspartique se trouve au
milieu de la 2e hlice (Asp. 61). Lorsquil est en contact avec la partie hydrophobe de la
membrane, il est sous forme neutre (acide aspartique) et non sous forme charge
(aspartate). Ces sous-units c sassemblent en un anneau symtrique qui traverse la
membrane.
La sous-unit a comprend 2 demi canaux protons qui permettent aux protons dentrer et
de traverser en partie seulement la membrane. Chaque demi-canal est en interaction avec
une sous-unit c.
Comment le gradient de protons active-t-il la rotation de lanneau c ?
Pour commencer, les rsidus Asp.
61 des 2 sous-units c qui sont en
contact avec les demi-canaux ont
perdu leur proton et sont sous la
forme charge aspartate car les
canaux sont des environnements
hydrophiles.
Dans
cette
configuration, lanneau c ne peut
pas bouger car une rotation
dplacerait un rsidu charg
aspartate
dans
la
partie
hydrophobe de la membrane. Un
proton peut passer dans un des
demi-canaux pour protonner
laspartate. Comme la concentration en protons est beaucoup plus leve du ct
cytosolique que du ct matriciel, la probabilit que le proton passe par le canal connect
au ct cytosolique est plus leve. Il est dautant plus favoris que le potentiel
membranaire est de + 0,14 V (positif ct cytoplasme), ce qui augmente la concentration de
protons au voisinage du canal. Lorsque le rsidu aspartate est protonn (il est donc sous sa
forme neutre), lanneau c peut tourner, mais uniquement dans le sens des aiguilles dune
montre. Cette rotation met lacide aspartique en contact avec la membrane, dplace
laspartate charg vers le demi-canal cytosolique et dplace un rsidu acide aspartique de
la membrane vers le demi-canal matriciel. Le proton de lacide aspartique se dissocie et
passe travers le demi-canal dans la matrice pauvre en protons, ce qui restaure ltat
initial.
Le mouvement rotatoire est donc orient cause de la diffrence de concentrations en
protons et la diffrence de potentiel entre les 2 cts de la membrane, ce qui modifie la
probabilit de protonation des demi-canaux.

106

Finalement, chaque proton passe travers la membrane en

tournant autour de lanneau c en rotation pour sortir par le demicanal matriciel.
Lanneau c est li aux sous-units et qui sont entranes dans sa
rotation. Lensemble ne tourne pas car il est retenu par la
colonne externe forme de 2 chanes et la sous-unit .
Bilan : Au final, le gradient de protons active la rotation de lanneau c, ce qui active la
rotation de la sous-unit , ce qui permet la synthse de lATP par le mcanisme de
changement de conformation et daffinit.
Le noyau c comprend entre 10 et 14 sous-units c. Ce nombre dtermine le nombre de
protons qui doivent tre transports pour crer une molcule dATP.
Une rotation de 360 de la sous-unit conduit la synthse de 3 molcules dATP.
Donc, si F0 comprend 10 sous-units c, chaque ATP cr ncessite le transport de 10/3
protons, soit 3,33 protons.
Lors de la chane de transport des lectrons, nous avons vu que loxydation dune NADH en
NAD+ entranait lexpulsion de 10 H+ de la mitochondrie, ce qui correspond 3 ATP
synthtiss. Loxydation dune FADH2 en FAD nexpulsait que 6H+, ce qui correspond
environ 1,5 ATP crs.
Le cycle de Krebs utilise 3 NADH et 1 FADH2, ce qui fait donc un total denviron 10 ATP.
Un tre humain consomme environ 83 kg dATP par jour. Il y a donc 3,3 x 1025 H+ qui
passent par lATP synthase par jour, ou 1021 H+/sec.

5.4.

Navettes et rgulations :

a) Types de navettes :
Lors de la glycolyse, du NADH est cr dans le cytosol. Comment le NAD+ est-il
rgnr ? Le NADH ne peut pas simplement passer dans les mitochondries pour y tre
oxyd par la chane respiratoire car la membrane mitochondriale interne est
impermable au NADH et au NAD+. Ce sont alors les lectrons du NADH qui passent
travers la membrane.
Deux mcanismes existent :
1) Navette glycrol 3-phosphate (muscle, cerveau) :
NADHcytosolique + H+ + E-FADmitochondrial NAD+cytosolique + E-FADH2 mitochondrial

107

Les lectrons du NADH sont transfrs au

dihydroxyactone phosphate (un des trioses de la
glycolyse) qui est rduit en glycrol 3-phosphate
grce

lenzyme
glycrol
3-phosphate
dshydrognase cytosolique. Cest cette tape qui
recycle le NAD+. Le glycrol 3-phosphate est
ensuite
roxyd
pour rgnrer
du
dihydroxyactone phosphate. Cette tape a lieu
sur la face externe de la membrane
mitochondriale externe et est catalyse par le
glycrol
3-phosphate
dshydrognase
mitochondriale. Une paire dlectrons est transfre un groupe FAD de lenzyme pour
former du FADH2. Ces lectrons sont ensuite transfrs Q pour former QH2 qui entre
dans la chane respiratoire.
Lorsque le NADH cytosolique transport par la navette glycrol 3-phosphate est oxyd
par la chane respiratoire, 1,5 ATP non 2,5 sont forms car cest le FAD et non le NAD+
qui est laccepteur dlectrons. Cette navette est un branchement mtabolique : elle
gnre lubiquinol et du NAD+.
2) Navette malate-aspartate (foie, cur)
NADH cytosolique + NAD+mitochondrial

NAD+cytosolique + NADH mitochondrial

Les lectrons sont transfrs du NADH cytosolique produit lors de la glycolyse

loxaloactate (intermdiaire du cycle de Krebs) qui est rduit en malate (1) . Celui-ci
traverse la membrane mitochondriale interne en change d-ctoglutarate (2). Le
malate est roxyd par le NAD+ pour former du NADH et de loxaloactate (3).
Loxaloactate ne peut pas traverser la membrane. Il subit alors une raction de
transamination pour former de laspartate et de l-ctoglutarate (4) qui peuvent
traverser la membrane (5) tandis que du malate la traverse dans lautre sens.
Laspartate est ensuite dsamin dans le cytoplasme pour former loxaloactate et du
glutamate et le cycle recommence (6).

108

Contrairement la navette glycrol 3-phosphate,

cette navette est facilement rversible. Elle ne
peut donc amener du NADH la mitochondrie
que si le rapport NADH/NAD+ est plus lev dans
le cytosol que dans la matrice mitochondriale.
Le bilan pour les 2 navettes est diffrent car la
navette malate-aspartate convertit le NADH
cytosolique en NADH mitochondrial, tandis que la
navette glycrol 3-phosphate utilise le FADH2.
b) Transport de lATP :
La phosphorylation oxydative cre de lATP partir dADP, mais ceux-ci ne peuvent pas
passer librement travers la membrane interne de la mitochondrie. Une protine de
transport spcifique permet ce passage : lATP-ADP translocase. Cette protine est trs
abondante, elle constitue environ 15% des protines de la membrane interne
mitochondriale. Les flux dATP-ADP sont coupls : de lADP nentre dans la matrice
mitochondriale que si de lATP en sort et vice-versa.
La raction catalyse par la translocase est la suivante :
ADP3-cyto. + ATP4-mito ADP3-mito + ATP4-cyto

Lchange dATP-ADP se droule comme suit: la translocase contient 1 site de liaison de

nuclotides qui fait face alternativement aux cts cytosolique et matriciel de la
mitochondrie. La translocase fixe lADP la face externe de la mitochondrie, puis il y a
version du site de liaison, lADP est ainsi relch du ct matriciel. Il se passe ensuite la
mme chose pour lATP en sens inverse. LATP et lADP se fixent sur la translocase avec une
affinit similaire. La translocase ne sverse vers le ct matriciel que si de lADP y est fix.
Ceci assure le couplage de lentre de lADP dans la matrice et de la sortie de lATP. Comme
la membrane est charge positivement du ct cytosolique, lversion du site de liaison du
ct matriciel vers le ct cytosolique est plus rapide pour lATP que pour lADP car lATP
possde une charge ngative supplmentaire. Cet change est assez coteux en nergie.

109

La synthse de lATP ncessite lentre dun Pi dans

la matrice en change dun OH-. Un proton H+ est
donc consomm par cette opration.
c) Bilan nergtique :
Pour la glycolyse (cytosol),
- Phosphorylation du glucose
- Phosphorylation du fructose 6-phosphate
- Dphosphorylation de 2 1,3-BPG
- Dphosphorylation de 2 phosphonolpyruvate
- Oxydation de 2 glycraldhyde 3-phosphate

-1 ATP
-1 ATP
+ 2 ATP
+2 ATP
+ 2 NADH

Total : 2 ATP et 2 NADH cytoplasmiques + 2NADH forms dans les mitochondries

lors de la conversion du pyruvate en actyl CoA.
Pour le cycle de Krebs (mitochondries) :
- Formation de 2 guanosines triphosphates partir
de 2 succinyl CoA
- Oxydation de 2 isocitrate, d-ctoglutarate et de malate
- Oxydation de 2 succinates

+2 GTP
+ 6 NADH
+2 FADH2

Pour la phosphorylation oxydative :

- Oxydation du NADHmito sortie de 10 H+
- Oxydation du FADH2 sortie de 6 H+
1 ATP/3,3 H+ form par lATP synthase mais 1 H+ est consomm pour limportation
de Pi dans la mitochondrie 1 ATP form partir de ~ 4 H+ (3,3+1)
- Dcarboxylation oxydative du pyruvate
- Au cours du cycle

+ 2 NADH
+ 2 x 2,5 ATP (10/4)
+ 6 NADH
+ 6 x 2,5 ATP (10/4)
+ 2 FADH2
+ 2 x 1,5 ATP (6/4)

Total : 23 ATP, 8 NADH et 2 FADH2

Les 2 NADH forms lors de la glycolyse fournissent un nombre dATP diffrent selon
la navette utilise
+ 3 ATP (navette glycrol- phosphate)
Ou + 5 ATP (navette malate - aspartate)
Bilan : 30/32 ATP par molcule de glucose. Le catabolisme arobique du glucose
produit 15 fois plus dATP que le catabolisme anarobique (2 ATP).

110

d) Rendement calorique :
30 ATP = 7,3 x 30 = 219 kcal/mol
Le rendement de combustion mesur dans un calorimtre est le suivant :
C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O
G= - 686 kcal/mol
Le rendement est de 31%, le pourcentage restant est dissip sous forme de chaleur.
e) Couplage transfert dlectrons-synthse dATP :
La plupart du temps, les lectrons ne sont
transfrs vers O2 travers la chane de
transfert des lectrons que lorsque lADP est
phosphoryl en ATP cest--dire uniquement si
de lATP a besoin dtre synthtis. La
phosphorylation
ncessite
une
source
dlectrons (NADH par exemple), O2, Pi et de
lADP qui est le facteur principal de la vitesse
de la phosphorylation oxydative. On observe
que la vitesse de consommation dO2 par des mitochondries purifies est plus leve
lorsque de lADP est ajout. La vitesse revient sa valeur initiale lorsque tout lADP est
consomm et transform en ATP.
f) Dcouplage :
Le dcouplage de la phosphorylation
oxydative entre le gradient de protons et la
synthse de lATP conduit la dissipation
de chaleur. Il est utilis chez les animaux qui
hibernent, chez certains animaux nouveauns et chez les mammifres adapts au froid.
On parle de processus de thermogense.
Le tissus adipeux brun est riche en
mitochondries qui contiennent une protine dcouplante, lUCP-1 (ou thermognine). Cette
protine permet le passage des protons du cytosol vers la matrice. Il ny a plus de synthse
dATP.
La synthse de lATP peut aussi tre dcouple du transfert des lectrons par la 2,4dinitrophnol qui transporte les protons travers la membrane mitochondriale interne.
LATP nest pas forme par lATP synthase car la force protomotrice travers la membrane
mitochondriale interne est dissipe. De grandes quantits de molcules nergtiques sont
consommes mais aucune nergie nest mise en rserve sous forme dATP et lnergie est
libre sous forme de chaleur.

111

La DNP est utilise comme herbicide, fongicide (lATP ntant plus

synthtis, les organismes arobiques meurent), comme drogue
amaigrissante (interdite), ou par les soldats russes en hiver (pour
conserver la chaleur, mais cela implique le ralentissement du
mtabolisme).

DNP

112

B) Anabolisme du glucose et drivs:

Chapitre 1 : La gluconogense
La gluconogense est la voie de synthse du glucose partir de prcurseurs non
glucidiques. Il sagit dune voie mtabolique importante car le glucose est la principale
source dnergie du cerveau et des globules rouges.
Notre organisme consomme quotidiennement 160 g de glucose dont 120 g sont utiliss
exclusivement pour le cerveau.
Nos rserves en glucose sont de lordre de
20 g dans les liquides biologiques.
190 g de glycogne (homopolymre de glucose) dans les tissus.
Les rserves sont donc suffisantes pour une journe mais en cas de jene plus long, la
gluconogense joue un rle important.
Cest une voie anabolique (en opposition la voie mtabolique) qui va du pyruvate au
glucose. Dautres substrats sont nanmoins possibles : le lactate, les acides amins ou le
glycrol. Pour tre utilisables dans la gluconogense, ces prcurseurs doivent dabord tre
convertis en pyruvate ou en intermdiaires ultrieurs comme loxalo-actate ou la DHAP.
Lactate : Il est form par le muscle squelettique lorsque la glycolyse est trop
rapide pour le mtabolisme oxydatif. Si lapport en O2 est dficitaire, le pyruvate est
transform en lactate pour rgnrer le NAD+ au lieu demprunter le cycle de Krebs.
Cette raction se fait grce la lactate dshydrognase.
Acides amins : Ils rsultent de la dgradation des protines alimentaires ou des
protines du muscle squelettique (au cours dun jene).
Glycrol : Il rsulte de lhydrolyse des triacylglycrols. Il entre dans la
gluconogense ou dans la glycolyse au niveau de la DHAP. Il y a tout dabord
transfert dun phosphate de lATP pour former le glycrol phosphate. Il est ensuite
rduit en dihydroxyactone phosphate.

La gluconogense se droule principalement dans le foie (il favorise cette voie anabolique
par rapport la glycolyse, quand le taux de glucose est bas). Elle a galement lieu dans les
reins, le cerveau et dans les muscles (squelettiques ou cardiaques). La gluconogense dans
le foie et les reins aide au maintien du taux de glucose sanguin pour alimenter le cerveau et
les muscles de lorganisme.

113

Bien que la glycolyse convertisse le glucose en pyruvate et que la gluconogense convertit

le pyruvate en glucose, cette dernire nest pas simplement la voie inverse de la glycolyse.
En effet, plusieurs ractions de la glycolyse sont pratiquement irrversibles:
* Glucose + ATP Glucose 6-phosphate + ADP
* Fructose 6-phosphate + ATP fructose 1,6-bisphosphate + ADP
* Phosphoenolpyruvate + ADP pyruvate + ATP

G = - 33 kJ/mol
G = - 22 kJ/mol
G = - 17 kJ/mol

Dans la gluconogense, ces ractions sont remplaces par dautres.

114

1.1)

Formation du phosphonolpyruvate :

La raction de la glycolyse qui convertit le phosphonolpyruvate en pyruvate est

irrversible. Ce phosphonolpyruvate
est riche en nergie car cette raction
libre de lATP.
La raction inverse (qui aurait d tre
dans la gluconogense) est donc
diffrente et consomme de lnergie.
Premire tape : Le pyruvate est transform par lintermdiaire doxaloactate. Cette
tape consomme de lnergie : une molcule dATP est hydrolyse en ADP. Lenzyme qui
catalyse cette raction est la pyruvate carboxylase, localise dans la matrice mitochondriale
(Cette raction a donc lieu dans la mitochondrie). Sa coenzyme est la biotine (transporteur
de CO2 activ).
Celle-ci est un groupement prosthtique li de faon covalente lenzyme. (Rem : ce nest
pas un cofacteur car un cofacteur nest pas li lenzyme.) La fonction ractive de la biotine
est lazote prsent dans le cycle (Cest le site de fixation du CO2) Le groupe carbonyle de la
biotine est li au groupe -amine dune lysine de lenzyme par un lien amide.
La carboxylation du pyruvate seffectue en deux phases qui ont lieu sur deux sites
diffrents de lenzyme. Sur le site
numro 1, lion bicarbonate est
converti en CO2, ce qui cote de
lATP. Ce dioxyde de carbone
ragit ensuite avec la biotine pour
former lenzyme carboxybiotine.
Le long bras compos de biotine
et de lysine auquel il est attach
transfre le CO2 de lenzyme carboxybiotine vers le site catalytique numro 2 o le dioxyde
de carbone est relch. Il ragit alors avec le pyruvate pour former loxalo-actate. Le rle
principal du long bras flexible est de transporter les intermdiaires de raction entre les
sites catalytiques de lenzyme.

Cette raction dpend de la prsence dactyl CoA. La biotine nest pas carboxyle tant que
lactyl CoA nest pas fix un site allostrique de la pyruvate carboxylase.
115

Signification physiologique de cette rgulation :

[ATP] et [AcCoA] leves = grande quantit dnergie disponible.
 Pas besoin de produire de lnergie : le pyruvate est transform en oxaloactate par la gluconogense.
[ATP] et [AcCoA] faibles = peu dnergie disponible.
 Le pyruvate est oxyd par le cycle de Krebs pour produire de lATP.
La pyruvate carboxylase est un enzyme anaplrotique (enzyme qui rgnre des
molcules importantes pour la cellule)
 Sil manque de loxalo-actate, le cycle de Krebs ne sait pas se drouler.
Lactivation par lActyl CoA stimule la synthse doxalo-actate ncessaire
lamorage du cycle de Krebs : cest une voie de rgnration.
Deuxime tape : La seconde tape est la conversion de loxalo-actate en
phosphonolpyruvate. Loxalo-actate est dcarboxyl (processus nergtiquement
favorable) et phosphoryl par lhydrolyse dun GTP en GDP pour donner le
phosphonolpyruvate. Cette raction est catalyse par le phosphonolpyruvate
carboxykinase.
Pyruvate + HCO3- + ATP + H2O
oxaloactate + ADP + Pi
Oxaloactate + GTP
phosphonolpyruvate + GDP + CO2
Pyruvate + ATP + GTP + HCO3-

phosphonolpyruvate + ADP + GDP + Pi + CO2

Selon les organismes, la PEP carboxykinase est

mitochondriale (lapin) ou cytosolique et mitochondriale

cytosolique,

Il y a donc un problme de compartimentation si la PEP carboxykinase

est uniquement cytosolique car loxalo-actate est form dans la
mitochondrie et il ne peut pas tre transport dans le cytoplasme (pas de
permase). Il ny a donc pas de substrat de dpart pour la 2e raction. La
solution est lutilisation dune navette.
Loxalo-actate est alors rduit en malate dans la mitochondrie pour tre
transport vers le cytosol o il est roxyd en oxalo-actate.

1.2)

Conversion du fructose 1,6-bisphosphate en fructose 6-phosphate :

Fructose 1,6-biphosphatase

Fructose 1,6-biphosphate + H20

fructose 6-phosphate + Pi

Le fructose 6-phosphate est ensuite transform en glucose 6-phopshate par la glucose 6phosphate isomrase. Souvent, la gluconogense sarrte ce stade-ci. Elle va rarement
jusqu la formation du glucose. Le glucose 6-phosphate est plutt converti en glycogne
(produit de rserve). Lavantage est que le glucose 6-phosphate, contrairement au glucose,
ne peut pas diffuser en dehors de la cellule.
116

1.3)

Conversion du glucose 6-phosphate en glucose :

Dans le foie et les reins, la gluconogense va gnralement jusqu la formation du glucose

car leur rle est de maintenir le taux de glucose sanguin constant. On y trouve donc la
glucose 6-phosphatase (enzyme responsable de cette transformation).
Glucose 6-phosphate + H2O

Glucose 6-phosphatase

Glucose + Pi

Le glucose 6-phosphate produit dans le cytosol est transport dans la lumire du rticulum
endoplasmique (o la glucose 6-phosphatase est prsente surface de la membrane). Des
vsicules se forment partir de cette membrane et fusionnent avec la membrane
plasmique. Le glucose est alors libr dans le sang.

1.4)

Stchiomtrie :

Stchiomtrie de la gluconogense :
2 Pyruvates + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 6 H2O Glucose + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 NAD+ + 2 H+

G0 = - 38kJ/mol (favorable)
Stchiomtrie de la raction inverse de la glycolyse :
2 Pyruvates + 2 ATP + 2 NADH + 2 H2O Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+
G0 = + 84kJ/mol (dfavorable)
La diffrence entre les deux quations est de 2 ATP et 2 GTP par molcule de glucose
synthtise au dpart du pyruvate.
Cest finalement lhydrolyse des 4 nTP qui rend la gluconogense thermodynamiquement
favorable.

1.5)

Rgulation rciproque de la glycolyse et de la gluconogense :

Si la glycolyse et la gluconogense taient actives en mme temps, 4 nTP seraient gaspills

par un cycle de ractions (cycle futile).
 Rgulation rciproque des 2 voies par la charge nergtique cellulaire:
Charge nergtique faible : dgradation du glucose synthse dATP
Charge nergtique leve : pyruvate glucose
La charge nergtique = La concentration dATP par rapport la concentration de ses
produits

117

Les quantits et les activits des enzymes de la glycolyse et de la gluconogense sont

contrles de manire ce que les deux voies ne soient pas pleinement actives
simultanment. Ce qui active une voie inhibe lautre voie.
La rgulation se fait sur les tapes irrversibles :
Rgulation de linterconversion glucose/glucose 6-phosphate (glycolyse) :
Lhexokinase subit une inhibition allostrique par le produit de la raction (le Glucose-6phosphate). Une concentration leve de ce dernier inhibe lhexokinase jusqu ce que sa
concentration soit abaisse par ltape suivante de la glycolyse.
Rgulation de linterconversion glucose 6-phosphate /glucose (gluconogense) :
La glucose 6-phosphatase nest pas soumise un contrle allostrique mais sa KM (pour le
glucose-6-phosphate) est beaucoup plus lev que la concentration habituelle de cette
substance. Lactivit de lenzyme dpend linairement de la concentration de substrat.

118

Rgulation de linterconversion fructose-6-phosphate en fructose-1,6-bisphosphate

(glycolyse) :
La phosphofructokinase (PFK) est une enzyme glycolytique dont lactivit est la plus
troitement contrle (effecteurs : ATP, AMP, citrate et fructose 2,6-bisphosphate).
 Inhibition de la PFK par lATP :
LATP exerce un contrle allostrique ngatif : une concentration leve dATP
transforme la courbe de vitesse en fonction de la concentration hyperbolique du
fructose-6-phosphate en une courbe sigmode. LATP suscite cet effet en se liant un
site rgulateur spcifique distinct du site catalytique. Laffinit de lenzyme pour le
fructose-6-phosphate diminue. La gluconogense prend alors le dessus sur la
glycolyse.

 Activation de la PFK par lAMP :

LAMP inverse laction inhibitrice de lATP. Une chute de la charge nergtique
(rapport ATP/AMP) active la PFK.
Pourquoi lAMP (et non pas lADP) est-il un rgulateur positif de la PFK ?
Lorsque lATP est utilise rapidement, ladnylate kinase peut former de lATP au
dpart dADP :
ADP + ADP ATP + AMP
LAMP devient le vrai signal dun tat de basse nergie. Il faut donc crer de lATP.
De plus, la rgulation par lAMP est particulirement sensible car
[ATP] + [ADP] + [AMP] constante et [ATP] >> [ADP] >> [AMP].
De manire relative, de faibles changements de la concentration en ATP se
traduisent par de beaucoup plus grandes variations de la concentration en AMP.
 Inhibition de la PFK par le citrate :
Le citrate agit sur la PFK en augmentant leffet inhibiteur de lATP. Sa signification
physiologique est que la glycolyse et le cycle de Krebs fournissent des squelettes
carbons pour les biosynthses. Une concentration leve de citrate (un
intermdiaire du cycle de Krebs) signifie donc que les prcurseurs biosynthtiques
sont abondants.

119

 Activation par le fructose 2,6-biphosphate :

Le fructose 2,6-biphosphate active la PFK en augmentant son affinit pour le
fructose 6-phosphate et en diminuant leffet inhibiteur de lATP.
Rgulation de linterconversion fructose-1,6-bisphosphate en fructose-6-phosphate
(gluconogense) :
 Inhibition par lAMP :
Une quantit leve dAMP indique une charge nergtique faible.
La gluconogense est ralentie et la glycolyse est favorise, do la synthse dATP.
 Activation par le citrate :
Un accroissement de la concentration en citrate signale que lactivit du cycle de
Krebs est restreinte. Le pyruvate doit plutt tre dirig vers la synthse de glucose.
La PFK et la F-1,6-BPase sont aussi rgules par le
fructose 2,6-bisphosphate prsent dans le foie. Son
taux est faible au cours dun jene et lev chez un
individu bien nourri.
Action du F-2,6-BP sur lactivit enzymatique :
* Active la PFK (glycolyse): augmente son affinit pour le F-6- P et diminue leffet
inhibiteur de lATP.
* Inhibe la FBPase (gluconogense).
Ainsi, la glycolyse est acclre et la gluconogense ralentie chez un individu
correctement nourri. Au cours du jene, la glyconogense prdomine car le taux de
fructose-2,6-bisphosphate est faible.
La concentration en fructose-2,6-bisphosphate dpend de deux activits enzymatiques :
- La PFK 2 qui phosphoryle le fructose-6-phosphate en fructose-2,6-bisphosphate.
- La FBPase 2 qui hydrolyse le fructose-2,6-bisphosphate en fructose-6-phosphate.
La PFK 2 et la FBPase 2 sont toutes deux prsentes dans
une seule et unique chane polypeptidique. Cet enzyme
bifonctionnelle comporte un domaine kinase et un
domaine phosphatase.
Lactivation de la PFK par le fructose-2,6-bisphosphate
implique un feedforward :
Concentration de glucose sanguin leve qui entraine une abondance de fructose-6phosphate dans le foie, une acclration de la synthse de fructose-2,6-bisphosphate et
donc une stimulation de la PFK
Labondance de fructose-6-phosphate stimule donc la PFK via le fructose-2,6-bisphosphate.

120

Les activits de lenzyme bifonctionnelle PFK2/FBPase2 sont contrles par la

phosphorylation dun rsidu srine :
Faible concentration de glucose sanguin :
- Production de glucagon (hormone scrte par le pancras).
- La liaison du glucagon son rcepteur membranaire dclenche la production
intracellulaire dAMP cyclique.
- Activation de la PKA qui phosphoryle une srine de lenzyme bifonctionnelle.
- Augmentation de lactivit FBPase2 et inhibition de lactivit PFK2.
- Diminution du taux de F-2,6-BP.
- Ralentissement de la glycolyse.
A linverse, si le glucose est abondant :
- Lenzyme bifonctionnelle perd le groupe phosphoryle.
- Augmentation de lactivit PFK2 et inhibition de lactivit FBPase2.
- Augmentation du taux de F-2,6-BP.
- Acclration de la glycolyse.

Ce contrle coordonn est facilit par la localisation des domaines kinase et phosphatase
sur la mme chane polypeptidique comme domaine rgulateur.
Contrle de lactivit catalytique de la pyruvate kinase hpatique par ltat de
phosphorylation :
Le fructose 1,6-biphosphate active la pyruvate kinase, tandis que lATP et lalanine
(synthtis partir du pyruvate) linhibent. Ainsi, la glycolyse est ralentie lorsque la charge
nergtique est leve ou lorsque
les modules de synthse sont
abondants. La pyruvate kinase est
galement
rgule
par
phosphorylation rversible. Lorsque
le taux de glucose sanguin est bas, le
glucagon provoque la synthse

121

dAMP cyclique, ce qui conduit la phosphorylation de la pyruvate kinase, ce qui diminue

son activit. La pyruvate kinase du muscle et du cerveau nest pas soumise cette
rgulation par phosphorylation. La rgulation de lenzyme hpatique empche le foie de
consommer du glucose lorsquil est plus urgent den fournir au cerveau et aux muscles.

122

Chapitre 2 : Le mtabolisme du glycogne

Le glycogne est un trs gros polymre ramifi form de rsidus glucose. Il permet le
stockage de glucose rapidement mobilisable dans un espace restreint. Il peut tre cliv
pour donner des molcules de glucose lorsque de lnergie est ncessaire.

2.1)

Structure du glycogne :

La plupart des rsidus glucose du

glycogne sont unis par des liaisons
-1,4. Des ramifications sont cres
par des liaisons -1,6 tous les 10
rsidus environ.
Il est prsent dans le cytosol de la cellule sous la forme de granules de 10 40 nm de
diamtre ( peu prs la taille du ribosome): il est donc disponible pour librer du glucose.
Le glycogne sert de tampon pour le maintien du taux de glucose sanguin. Il est
particulirement important pour :
Le cerveau : le glucose est pratiquement la seule molcule nergtique utilise par
le cerveau.
Les muscles : le glucose est facilement mobilis et est donc une bonne source
dnergie pour une activit soudaine et intense.
Les principaux sites de stockage du glycogne sont le foie et les muscles squelettiques.

2.2)

Dgradation du glycogne :

La dgradation se droule en 3 tapes :

1. Libration du glucose 1-P partir du glycogne.
2. Conversion du glucose 1-P en glucose 6-P qui est un intermdiaire de la glycolyse
en vue dun mtabolisme ultrieur.
3. Remodelage du glycogne au niveau des points de branchement des ramifications.

De nombreuses enzymes sont impliques dans cette dgradation :

* La glycogne phosphorylase dgrade le glycogne de manire squentielle : elle
clive le glycogne par addition dorthophosphate (Pi) pour donner le glucose 1phosphate (raction appele phosphorolyse). Elle limine squentiellement les
rsidus glycosyls partir des extrmits possdant un groupe 4-OH libre.

123

Lorthophosphate coupe la liaison glycosidique entre le C1 du rsidu terminal et le C4

du rsidu adjacent. La configuration au niveau du C1 est conserve. Cette raction
est en principe rversible, le G est presque nul mais elle procde in vivo dans le
sens de la dgradation du glycogne car il y a beaucoup plus de Pi dans la cellule que
de glucose 1- phosphate. La raction est ainsi tire vers la droite.
[Pi] / [Glucose 1-phosphate] 100
* La phosphoglucomutase convertit le glucose 1- phosphate libr du glycogne en
glucose 6-phosphate qui peut alors entrer dans diffrentes voies mtaboliques :
glycolyse, gluconogense et voie des pentoses phosphate.
Le clivage phosphorolytique du glycogne est avantageux du point de vue nergtique:
- Un clivage hydrolytique aurait donn du glucose qui aurait d ensuite tre phosphoryl
pour pouvoir entrer dans le mtabolisme aux dpens de lhydrolyse dune molcule dATP.
- Le glucose 1- phosphate (charg ngativement) ne peut pas diffuser hors de la cellule.
Problme: la glycogne phosphorylase peut rencontrer des obstacles. Les points de
branchement (les liaisons -1,6) ne sont pas clivables par lenzyme. La phosphorylase
sarrte de cliver les liaisons -1,4 lorsquelle atteint un rsidu terminal situ 4 rsidus
dun point de ramification.
Solution : Remodelage du glycogne au cours de sa dgradation grce 2 enzymes : une
transfrase et une -1,6-glucosidase. Chez les eucaryotes, ces 2 enzymes sont prsentes
dans une chane polypeptidique unique (enzyme bifonctionnel).
Les liaisons -1,4-glycosidiques de
chaque branche sont tout dabord
clives par la phosphorylase, ce qui
laisse 4 rsidus sur chaque branche
(rsidus roses). La transfrase dplace
ensuite 3 rsidus glycolyses dune
branche une autre (rsidus bleus). Il
y a donc rupture de la liaison -1,4glycosidique entre les rsidus bleus et
verts et formation dune liaison -1,4glycosidique entre les rsidus bleus et jaunes. Le rsidu vert est finalement enlev par l 1,6-glucosidase. On passe ainsi dun polymre branch un polymre linaire avec
uniquement des liaisons -1,4-glycosidiques qui pourront par la suite tre clives par la
phosphorylase.

124

2.3)

La glycogne phosphorylase :

La glycogne phosphorylase est un homodimre (dimre de 2 sous-units identiques de 97

kDa). Chaque sous-unit est reploye en un domaine N-terminal contenant un site de
liaison pour le glycogne, et un domaine C-terminal. Le site catalytique est localis dans
une profonde cavit forme entre les domaines N- et C-terminaux.
Un site catalytique est prsent sur chaque monomre. La glycogne phosphorylase utilise
comme coenzyme le pyridoxal phosphate (PLP driv de la pyridoxine ou vitamine B6).
Le PLP est li de faon covalente lenzyme (base de Schiff avec une lysine du site actif).
Mcanisme catalytique de la glycogne
phosphorylase : un groupe HPO42- est
prsent entre le PLP et le polymre de
glycogne. Lorthophosphate donne un
proton loxygne du glycogne et reoit
en mme temps un proton du PLP. Il y a ainsi libration dun glucose et formation dun
intermdiaire carbocation qui se fait attaquer par loxygne de lorthophosphate. Le site de
liaison du glycogne est distant de 30 du site catalytique et y est connect par une troite
crevasse qui peut recevoir 4 ou 5 units de glucose. Ceci permet lenzyme de
phosphorolyser de nombreux rsidus sans se dissocier du glycogne aprs chaque cycle
catalytique. On parle alors denzymes processifs, cest--dire qui peuvent rester sur leur
substrat tout en faisant leur raction catalytique. Autre exemple: les exonuclases
(dgradation des acides nucliques).
a) Rgulation de lactivit de la glycogne phosphorylase :
La dgradation du glycogne est contrle de faon trs prcise par de nombreux
mcanismes. Le point dimpact de ce contrle est la glycogne phosphorylase.
La phosphorylase est rgule par :
Divers effecteurs allostriques qui signalent ltat nergtique de la cellule. Si des
ligands lient lenzyme sur un domaine diffrent du site catalytique, cela induit un
changement de conformation qui modifie le rle catalytique.
Par une phosphorylation rversible (modification post-traductionnelle) sensible
des hormones telles que linsuline, ladrnaline (en anglais epinephrine ) et le
glucagon.
Il existe des modes rgulateurs diffrents pour les phosphorylases du muscle et du foie
du fait de leurs rles diffrents.

125

b) Rgulation de lactivit de la phosphorylase du muscle :

La glycogne phosphorylase du muscle squelettique existe sous 2 formes
interconvertibles:
Une phosphorylase a : forme phosphoryle
(habituellement active).
Une phosphorylase b: forme non-phosphoryle
(habituellement inactive).
Chacune de ces formes est en quilibre entre un tat relch
(R) actif o le site actif est plus accessible et un tat tendu (T)
beaucoup moins actif o le site actif est bloqu. Les
phosphorylases a et b sont la fois prsentes dans ltat R et
T.
Les formes a et b diffrent par un unique groupe phosphoryle dans chaque sous-unit.
La phosphorylase b est convertie en phosphorylase a lorsquelle est phosphoryle au
niveau dun rsidu srine dans chaque sous-unit. Cette modification covalente est
catalyse par la phosphorylase kinase. Des taux levs dadrnaline (rsultant dune
frayeur ou dun exercice physique) et la stimulation lectrique du muscle induisent la
phosphorylation de la phosphorylase (rem : la phosphorylation affecte des acides
amins hydroxyles).
Lquilibre pour la phosphorylase b est en faveur de ltat T tandis que pour la
phosphorylase a il est en faveur de ltat R.
La glycogne phosphorylase b du muscle est rgule par la charge nergtique :
* par forte concentration dAMP qui stabilise la conformation de la phosphorylase b
dans ltat R.
* par lATP, comptiteur de lAMP, qui favorise ltat T (effecteur ngatif).
* par le Glucose-6P qui favorise ltat T (rtroinhibition).
Activation de la phosphorylase du muscle au cours dun exercice :
Dans le muscle au repos, presque tout lenzyme est dans la forme b inactive.
Au dbut dun exercice, le taux lev dAMP conduit lactivation de la
phosphorylase b (T R).
Au cours de lexercice, ladrnaline libre va causer la phosphorylation de
lenzyme pour donner la forme a pleinement active (indpendante des taux dAMP,
dATP et de glucose 6-P).

126

c) Rgulation de lactivit de la glycogne phosphorylase du foie :

Chez lhomme, la squence de la phosphorylase du foie et celle de lenzyme du muscle
sont identiques 90 % mais la rgulation des deux enzymes diffre considrablement.
Dans le foie :
la phosphorylase a prsente la plus grande sensibilit la transition de T vers R (b
dans le muscle).
Le glucose est un rgulateur allostrique ngatif : la phosphorylase a passe de la
forme R la forme T en prsence de glucose. Donc, si la concentration en glucose
augmente, le glycogne nest plus dgrad.
Pourquoi la phosphorylase du foie est-elle rgule par le glucose et non par lAMP
comme cest le cas pour la phosphorylase du muscle? La dgradation du glycogne dans
le foie sert former du glucose en vue de son exportation vers dautres tissus lorsque le
taux de glucose sanguin est bas tandis que les muscles consomment du glucose pour
produire de lnergie. Ds lors,
Lorsquil y a arrive de glucose par lalimentation, il nest pas ncessaire de
mobiliser le glycogne du foie.
Contrairement lenzyme du muscle, la phosphorylase du foie est insensible
lAMP car le foie ne subit pas dimportants changements de la charge nergtique
(contrairement au muscle).

d) La phosphorylase kinase :
La phosphorylase kinase est lenzyme qui modifie la phosphorylase de faon covalente.
Etudions la composition de la phosphorylase kinase du muscle squelettique : ()4.
Sa masse est de 1.200 kDa. La sous-unit a une activit catalytique et les autres sousunits ont une fonction rgulatrice.
La phosphorylase kinase subit un double contrle :
Activation par phosphorylation :
La kinase passe dune forme de faible activit une forme de forte activit par
phosphorylation de sa sous-unit . Lenzyme qui catalyse la phosphorylation de la
phosphorylase kinase est la PKA (active par lAMPc). Les hormones telles que
ladrnaline et le glucagon induisent la dgradation du glycogne en activant une
cascade de lAMP cyclique .
Activation par les ions Ca2+:
La phosphorylase kinase peut tre partiellement active par des concentrations dions
Ca2+ de lordre de 1M. La sous-unit de lenzyme est la calmoduline, une protine

127

sensible au calcium et qui stimule de

nombreux enzymes chez les eucaryotes. Ce
mode dactivation de la kinase est
important dans le muscle o la contraction
est dclenche par la libration du Ca2+ du
rticulum
sarcoplasmique.
La
phosphorylase kinase natteint son activit
maximale quaprs que la sous-unit ait
t phosphoryle et la sous-unit active par la fixation de calcium.

2.4)

Hormones dclenchant la dgradation du glycogne :

Ladrnaline et le glucagon dclenchent la dgradation du glycogne.

a) Ladrnaline
Cest une hormone produite par les glandes surrnales en
rponse une activit musculaire ou un stress. Elle est
responsable de la rponse se battre ou senfuir et
stimule considrablement la dgradation du glycogne
dans le muscle et ( un moindre degr) dans le foie.

b) Le glucagon
Cest une hormone polypeptidique (29 acides amins) scrte par les cellules du
pancras lorsque le taux de glucose sanguin est bas. Physiologiquement, le glucagon
traduit un tat de jene. Le foie est plus sensible au glucagon qu ladrnaline.
c) Cascade rgulatrice de la dgradation du glycogne
1. Ladrnaline et le glucagon se fixent sur
un rcepteur prsent sur la membrane
plasmique des cellules du foie et des
muscles ce qui active la sous-unit de la
protine G.
2. La forme de la sous-unit lie au GTP
active ladnylate cyclase qui catalyse la
formation dAMP cyclique partir dATP.
3. Le taux lev dAMP cyclique active la
protine kinase A.

128

4. La protine kinase A phosphoryle la sous-unit de la phosphorylase kinase qui

active ensuite la glycogne phosphorylase.
La cascade dAMP cyclique amplifie les effets des hormones. (Rem : cette partie est vue
plus en dtail dans le chapitre sur les protines)

d) Arrt de la dgradation du glycogne :

Une fois que les besoins en nergie ont t satisfaits, la dgradation du glycogne doit
tre rapidement arrte. La voie de transduction du signal conduisant lactivation de
la glycogne phosphorylase est stoppe de plusieurs manires :
La protine G prsente une activit GTPase qui convertit le GTP en GDP, ce qui
arrte la transduction du signal.
Les cellules contiennent une activit phosphodiestrase qui convertit lAMPc en
AMP.
La phosphoprotine phosphatase 1 (PP1) dphosphoryle la phosphorylase kinase,
ce qui linactive.
La PP1 dphosphoryle aussi la glycogne phosphorylase, convertissant lenzyme
en sa forme b normalement inactive.

2.5)

La synthse du glycogne :

Les voies de biosynthse et de dgradation du glycogne ne procdent pas par les mmes
ractions dans des sens opposs. Le glycogne est synthtis par une voie qui utilise
luridine diphosphate glucose (UDP-glucose) comme donneur de glucose activ. Latome de
carbone C1 est activ parce que son groupe hydroxyle est estrifi par la composante
diphosphate de lUDP.
Dgradation :

Glycognen+1 + Pi glycognen + glucose 1-phosphate

Synthse :

Glycognen + UDP-glucose glycognen+1 + UDP

a) Les tapes de la synthse du glycogne :

LUDP-glucose est synthtis partir du glucose 1-phosphate et de luridine

triphosphate (UTP) dans une raction catalyse par lUDP-glucose pyrophosphorylase.

129

Le pyrophosphate libr au cours de cette raction provient des rsidus phosphoryle

et de lUTP. Cette raction est aisment rversible. Cependant, le pyrophosphate est
rapidement hydrolys in vivo en 2 orthophosphates par une pyrophosphatase. Cette
dernire raction est essentiellement irrversible, ce qui favorise la synthse de lUDPglucose.
Glucose 1-phosphate + UTP
UDP-glucose + PPi
PPi + H2O 2 Pi
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Glucose 1-phosphate + UTP + H2O UDP-glucose + 2 Pi

Ceci est un thme rcurrent en biochimie : de nombreuses ractions biosynthtiques
sont favorises par lhydrolyse du pyrophosphate.
Lunit glucosyle active de lUDP-glucose
est ensuite transfre au groupe hydroxyle
terminal en C4 du glycogne pour former
une liaison -1,4-glycosidique. Cette
raction est catalyse par la glycogne
synthase qui est lenzyme cl de la
rgulation de la synthse du glycogne. La
glycogne synthase ne catalyse que la
formation de liaisons -1,4. Un autre
enzyme forme des liaisons -1,6 qui
permettent la ramification du glycogne. Cet enzyme transfre un bloc de 7 rsidus,
provenant de lextrmit qui est en croissance, un site plus interne. La ramification
augmente le nombre de rsidus terminaux, sites daction de la glycogne phosphorylase
et de la glycogne synthase. Ainsi, la ramification du glycogne permet dacclrer sa
synthse et sa dgradation.
b) Rgulation de lactivit de la glycogne synthase
Lactivit de la glycogne synthase est rgule par modification covalente
(phosphorylation) et par allostrie.
Plusieurs acides amins de lenzyme peuvent tre phosphoryls par la PKA et
diverses autres kinases. Jusqu 9 des rsidus srine de lenzyme peuvent tre
phosphoryls, ce qui modifie considrablement la charge globale des rgions N- et Cterminales de lenzyme et linactive.
La phosphorylation convertit la forme a active de la glycogne synthase en une forme b
habituellement inactive. Ainsi la phosphorylation a des effets opposs sur les activits
enzymatiques de la glycogne synthase (quelle inactive) et de la glycogne
phosphorylase (quelle active).

130

 La forme b (phosphoryle) ncessite pour son activit un taux lev de glucose 6phosphate qui est un activateur allostrique.
La forme a (non phosphoryle) est active, que le glucose 6-phosphate soit prsent ou
non.
Attention :
Glycogne phosphorylase :
phosphorylase a : forme phosphoryle (habituellement active)
phosphorylase b: forme non-phosphoryle (habituellement inactive)
Glycogne synthase :
phosphorylase a : forme non-phosphoryle (habituellement active).
phosphorylase b: forme phosphoryle (habituellement inactive).

2.6)

Contrle coordonn de la dgradation et de la synthse du glycogne :

La dgradation et la synthse du glycogne sont rciproquement rgules par une cascade

de lAMPc dclenche par le glucagon ou ladrnaline. Cest ainsi que lactivation de la
glycogne phosphorylase est troitement lie linhibition de la glycogne synthase.
Ladrnaline et le glucagon entranent la
dgradation du glycogne. La PKA peut soit induire
la cascade de phosphorylation, soit bloquer la
synthse de glycogne.
La PP1 joue galement un rle cl dans la
rgulation du mtabolisme du glycogne. En
dphosphorylant la phosphorylase kinase et la
phosphorylase a, elle diminue la vitesse de
dgradation du glycogne. De plus en
dphosphorylant la glycogne synthase b, la PP1 la

131

convertit en la forme a beaucoup plus active, ce qui acclre la synthse du glycogne.

La PP1 peut sassocier la protine RGL (123 kDa) qui prsente une haute affinit pour le
glycogne, ou elle peut sassocier linhibiteur-1, une petite protine (18,7 kDa) qui,
lorsquelle est phosphoryle, inhibe la PP1. Limportance de la sous-unit RGL est quelle
amne la PP1 proximit de ses substrats (les enzymes qui dgradent ou synthtisent le
glycogne).
Lactivit phosphatasique de la PP1 est elle-mme rgule : la protine RGL et linhibiteur-1
sont des substrats de la PKA. La phosphorylation de RGL par la PKA empche la liaison de
RGL la PP1, ce qui rduit lactivit de la PP1. De plus, la phosphorylation de linhibiteur-1
par la PKA induit son association la PP1, ce qui bloque totalement lactivit de la PP1.
Ainsi, lorsque la PKA est active, lactivit de la PP1 est bloque, ce qui favorise la
dgradation du glycogne en maintenant la phosphorylase dans la forme active a et la
glycogne synthase dans la forme inactive b.

La synthse du glycogne est favorise lorsque le taux du glucose sanguin est lev.
Linsuline est la principale hormone intervenant dans la mise en rserve du glucose sous
forme de glycogne. Cette hormone est scrte par des cellules particulires du pancras,
les cellules des lots de Langerhans.
Linsuline a de multiples effets qui vont faire rapidement baisser la concentration de
glucose sanguin. En particulier, elle va stimuler la synthse du glycogne et inhiber sa
dgradation dans le foie et dans les muscles.
Linsuline stimule la synthse du glycogne en dclenchant une voie qui active la PP1.
La premire tape de laction de linsuline est sa fixation un rcepteur prsent dans la
membrane plasmique. La liaison de linsuline son rcepteur conduit lactivation dune
protine kinase sensible linsuline qui phosphoryle RGL au niveau dun site diffrent de
celui qui est modifi par la PKA. Cette phosphorylation conduit lassociation de RGL la
PP1 et la molcule de glycogne. La dphosphorylation de la glycogne synthase, de la
phosphorylase kinase et de la glycogne phosphorylase favorise alors la synthse du
glycogne et bloque sa dgradation.

Bien que linsuline soit le principal signal de la synthse du glycogne, dautres mcanismes
non hormonaux et faisant intervenir plus directement le glucose, jouent aussi dans le foie.

132

* Aprs un repas riche en glucides, on observe que le taux de phosphorylase a du

foie dcrot rapidement. Il y a arrt de la dgradation du glycogne.
* Aprs une priode de latence, le taux de glycogne synthase a augmente et il en
rsulte la synthse du glycogne.

En fait, la phosphorylase a est llment sensible au glucose dans les cellules hpatiques. La
liaison du glucose la phosphorylase a dplace son quilibre allostrique de la forme active
R la forme inactive T. Il est important de noter que la PP1 est squestre par la
phosphorylase a dans ltat R. Lorsque cette dernire passe dans la forme T, elle devient
substrat de la PP1 qui la transforme en la forme b qui ne lie plus la PP1. Par consquent, la
conversion de a en b saccompagne de la libration de la PP1 qui est alors libre dactiver la
glycogne synthase.
Initialement, il y a environ 10 molcules de phosphorylase a pour 1 molcule de PP1.
Lactivit de la glycogne synthase ne commence donc crotre quaprs que la majeure
partie de la phosphorylase a ait t convertie en phosphorylase b.

Afin dviter des effets antagonistes, ladrnaline inactive les rcepteurs de linsuline la
surface des cellules du foie. Les cellules hpatiques expriment leur surface le rcepteur
1-adrnergique liant ladrnaline (rcepteur diffrent du rcepteur -adrnergique dj
mentionn). La liaison de ladrnaline au rcepteur 1-adrnergique stimule une voie
menant lactivation de la protine kinase C qui, entre autres activits, catalyse la
phosphorylation et ainsi linactivation du rcepteur de linsuline.

133

Chapitre 3 : La voie des pentoses phosphates

La voie des pentoses phosphate a t dcouverte suite lobservation que des tissus
continuent produire du CO2 au dpart de glucose en prsence de fortes concentrations de
fluorure, un inhibiteur puissant de lnolase et qui bloque compltement la glycolyse. Cette
voie correspond une autre manire dutiliser le glucose 6-phosphate et elle satisfait les
besoins de tous les organismes en NADPH utilisable dans les biosynthses. Cette voie
comporte deux phases : la cration oxydative du NADPH et linterconversion non oxydative
de sucres.
Dans la phase oxydative, du NADPH est cr lorsque le glucose 6-phosphate est oxyd en
ribulose 5-phosphate. Les ractions de la phase oxydative sont suffisamment exergoniques
pour maintenir un rapport [NADPH] / [NADP+] lev. La phase non oxydative correspond
linterconversion de sucres trois, quatre, cinq, six ou sept carbones dans une srie de
ractions non oxydatives qui peuvent se traduire par la synthse de ribose 5-phosphate
destin la biosynthse des nuclotides ou par la production dintermdiaires de la
glycolyse (fructose 6-phosphate et glycraldhyde 3-phosphate).
Toutes ces ractions de la voie des pentoses phosphateqs seffectuent dans le cytosol.

3.1)

La phase oxydative :

La phase oxydative commence par la dshydrognation du glucose 6- phosphate. Ce

compos contient plusieurs groupes hydroxyle et pourrait ds lors tre le substrat dune
varit de dshydrognases. En fait il nen existe quune dans les cellules des mammifres,
la glucose 6-phosphate dshydrognase, qui oxyde le carbone 1. Cet enzyme est trs
spcifique du NADP+ (le KM pour le NAD+ est environ 1000 fois plus lev que celui pour
le NADP+). Le produit est la 6-phosphoglucono--lactone, un ester intramolculaire entre
le groupe carboxyle en C1 et le groupe hydroxyle en C5.
Ltape suivante est lhydrolyse de cette lactone par une lactonase spcifique pour donner
le 6-phosphogluconate. Cet ose six carbones est ensuite dcarboxyl oxydativement par
la 6-phosphogluconate dshydrognase pour donner le ribulose 5-phosphate. Le NADP+
est nouveau laccepteur dlectrons. Cette raction est une dcarboxylation oxydative
dun -hydroxycarboxylate et est donc du mme type que la raction catalyse par
lisocitrate dshydrognase du cycle de Krebs.
Les ractions de la phase oxydative produisent donc deux molcules de NADPH et une
molcule de ribulose 5-phosphate pour chaque molcule de glucose 6-phosphate oxyde.

134

3.2)

La phase non oxydative :

La phosphopentose isomrase transforme le ribulose 5-phosphate en ribose 5-phosphate.

Cependant les cellules ont gnralement beaucoup plus besoin de NADPH pour les
biosynthses que de ribose 5-phosphate incorporer dans les nuclotides. La solution
vient du fait que le ribulose 5-phosphate peut tre converti en glycraldhyde 3-phosphate
et fructose 6-phosphate. Ces ractions relient de faon rversible la voie des pentoses
phosphate et la glycolyse. Le rsultat global est la formation de deux hexoses et dun triose
partir de trois pentoses :
3 C5

2 C6 + C3

Ces ractions sont les suivantes :

* Le xylulose 5-phosphate est form
au dpart de ribulose 5-phosphate
par laction de la phosphopentose
pimrase (les deux composs sont
des pimres en C3 ; les oses qui ne
diffrent que par la configuration
dun seul centre dasymtrie sont
des pimres).
* Du glycraldhyde 3-phosphate et du sdoheptulose 7-phosphate sont forms
partir de ribose 5-phosphate et de xylulose 5-phosphate. Dans cette raction, la
transctolase transfre une unit
deux carbones du xylulose 5phosphate au ribose 5-phosphate.
Un ctose nest un substrat de la
transctolase que lorsque son
groupe hydroxyle en C3 a la
configuration du xylulose, et non pas
celle du ribulose.
* Le glycraldhyde 3-phosphate et
le
sdoheptulose
7-phosphate
gnrs par la transctolase
ragissent alors pour former du
fructose
6-phosphate
et
de
lrythrose
4-phosphate.
Cette
raction produisant un ose quatre
carbones et un ose six carbones est
catalyse par la transaldolase.
* Enfin, la transctolase catalyse la
synthse du fructose 6-phosphate et
du glycraldhyde 3-phosphate
partir de lrythrose 4-phosphate et
du xylulose 5-phosphate.

135

La somme de ces trois ractions est :

2 xylulose 5-phosphate + ribose 5-phosphate
2 fructose 6-phosphate + glycraldhyde 3phosphate

Comme le xylulose 5-phosphate peut tre

form partir du ribose 5-phosphate par
laction squentielle de la phosphopentose
isomrase et de la phosphopentose
pimrase, la raction globale peut
commencer au ribose 5-phosphate :

3 ribose 5-phosphate

2 fructose 6-phosphate + glycraldhyde 3-phosphate.

Ainsi, lexcs de ribose 5-phosphate form par la voie des pentoses phosphates peut tre
compltement transform en intermdiaires glycolytiques. De plus, le ribose provenant de
lalimentation peut tre transform en intermdiaires glycolytiques par cette voie.
a) Mcanismes catalytiques de la transctolase et de la transaldolase :
Les ractions catalyses par la transctolase et la transaldolase sont distinctes, bien
quelles aient de nombreux caractres communs. Une diffrence est que la transctolase
transfre une unit deux carbones, tandis que la transaldolase transfre une unit
trois carbones. Chacune de ces units est transitoirement attache lenzyme au cours
du droulement de la raction. Les deux ractions impliquent la formation transitoire
dun carbanion.
 Mcanisme de la transctolase : Dans la transctolase, le site daddition de lunit
deux carbones est le cycle thiazole du coenzyme participant la raction, le
pyrophosphate de thiamine (TPP). La raction procde de la manire suivante :

1) Latome de carbone C2 de la TPP sionise facilement pour donner un

carbanion.
2) Latome de carbone charg ngativement attaque le groupe carbonyle du
ctose substrat.
3) Le compos daddition qui en rsulte libre laldose produit pour donner une
unit glycoaldhyde active : un carbanion stabilis par rsonance (latome dazote
charg positivement du cycle thiazole se comporte comme un pige lectrons qui
stabilise le carbanion).
4) Le groupe carbonyle dun aldose rcepteur (ayant remplac dans le site actif de
lenzyme laldose produit prcdemment) sadditionne alors lunit glycoaldhyde
active pour former un nouveau ctose qui est libr de lenzyme.

136

 Mcanisme de la transaldolase : La transaldolase transfre une unit

dihydroxyactone trois carbones dun ctose donneur un aldose accepteur. La
transaldolase nutilise pas de coenzyme. La raction procde de la manire suivante:
1) Une base de Schiff est forme entre le groupe carbonyle du ctose substrat et le
groupe -amine dun rsidu lysine du site actif de lenzyme. Ce mcanisme
est analogue celui de la fructose 1,6-bisphosphate aldolase de la glycolyse et, en
fait, les deux enzymes sont homologues.
2) La base de Schiff se protonne et un aldose est libr. La charge ngative sur le
carbanion de la base de Schiff est stabilis par rsonance car latome dazote charg
positivement agit comme un pige lectrons.
3) La partie dihydroxyactone ragit alors avec le groupe carbonyle de laldose
substrat.
4) Le ctose produit est libr par hydrolyse de la base de Schiff.

3.3)

Coordination de la voie des pentoses phosphate et de la glycolyse :

Il est possible dapprhender les interrelations entre la glycolyse et la voie des pentoses
phosphate en suivant le mtabolisme du glucose 6-phosphate dans 4 situations
mtaboliques diffrentes.

137

Mode 1 : Une quantit plus grande de ribose 5-phosphate que de NAPDH est ncessaire.
Par exemple, des cellules en division rapide ont besoin de ribose 5- phosphate pour la
synthse des prcurseurs nuclotidiques de lADN.
Dans ce cas, la majeure partie du glucose 6phosphate est convertie en fructose 6phosphate et glycraldhyde 3-phosphate
par la voie glycolytique. Les ractions de la
phase non oxydative convertissent ensuite
deux molcules de fructose 6- phosphate et
une molcule de glycraldhyde 3-phosphate
en trois molcules de ribose 5-phosphate
(ractions inverses de celles dcrites
prcdemment).
La stchiomtrie du mode 1 est :
5 glucose 6-phosphate + ATP 6 ribose 5-phosphate + ADP + H+
Mode 2 : Les besoins en NADPH et en ribose 5-phosphate sont quilibrs. La raction
prdominante dans ces conditions est la formation de deux molcules de NADPH et dune
molcule de ribose 5-phosphate partir dune molcule de glucose 6-phosphate.
La stchiomtrie du mode 2 est :
Glucose 6-phosphate + 2 NADP+ + H2O ribose 5-phosphate + 2 NADPH + 2H+ + CO2
Mode 3 : Une quantit plus grande de NADPH que de ribose 5-phosphate est ncessaire.
Par exemple, le tissu adipeux a besoin dun taux lev de NADPH pour la synthse des
acides gras. Dans ce cas, le glucose 6-phosphate est totalement oxyd en CO2. Trois
groupes de ractions sont actifs dans cette situation :
* La phase oxydative de la voie des
pentoses phosphate forme du NADPH et
du ribulose 5-phosphate.
* Le ribulose 5-phosphate est ensuite
transform en fructose 6-phosphate et en
glycraldhyde 3-phosphate par la phase
non oxydative.
* Enfin, le glucose 6-phosphate est
resynthtis partir du fructose 6phosphate et du glycraldhyde 3phosphate par la voie de la gluconogense.
Les stchiomtries de ces trois ensembles de ractions sont :
* 6 glucose 6-phosphate + 12 NADP+ + 6 H2O 6 ribulose 5-phosphate + 12 NADPH + 12 H+ + 6 CO2
* 6 ribulose 5-phosphate 4 fructose 6-phosphate + 2 glycraldhyde 3-phosphate
* 4 fructose 6-phosphate + 2 glycraldhyde 3-phosphate + H2O 5 glucose 6-phosphate + Pi

Le bilan des ractions du mode 3 est :

Glucose 6-phosphate + 12 NADP+ + 7 H2O 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + Pi

138

Mode 4 : Le NADPH et lATP sont tous deux

requis. Le ribulose 5-phosphate form par la
phase oxydative de la voie des pentoses
phosphates peut tre converti en pyruvate. Le
fructose 6-phosphate et le glycraldhyde 3phosphate produits par la phase non oxydative
entrent dans la voie glycolytique.

La stchiomtrie du mode 4 est :

3 glucose 6-phosphate + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5 Pi + 8 ADP
5 pyruvates + 3 CO2 + 6 NADPH + 5 NADH + 8 ATP + 2 H2O + 8 H+

3.4)

Importance de la glucose 6-phosphate dshydrognase dans la protection

contre les drivs ractifs de loxygne :

Des drivs ractifs de loxygne (ROS, reactive oxygen species) sont crs par le
mtabolisme oxydatif et peuvent endommager toutes les classes de macromolcules. Les
dgts causs par ces composs peuvent mme conduire la mort de la cellule. Les ROS
sont impliqus dans plusieurs maladies humaines. Le glutathion rduit (GSH) est un
tripeptide avec un groupe sulfhydryle libre qui intervient dans le combat contre les ROS. Le
glutathion oxyd (GSSG) est rduit par la glutathion rductase qui utilise le NADPH cr par
la glucose 6-phosphate dshydrognase de la voie des pentoses phosphate. En fait, les
cellules dont le taux de glucose 6-phosphate dshydrognase est rduit sont
particulirement sensibles aux ROS. Cest particulirement le cas des globules rouges car
ces cellules nont pas de mitochondries et nont donc pas de moyens alternatifs la voie des
pentoses phosphates pour crer du pouvoir rducteur.
 Anmie hmolytique cause par un dficit en glucose 6-phosphate Dshydrognase :
Le dficit de lactivit de la glucose 6-phosphate dshydrognase, suite une
mutation, est trs frquente dans certaines rgions du monde (Afrique tropicale,
pays mditerranens, certaines parties de lAsie, population noire dAmrique du
Nord). Il sagit de lenzymopathie (maladie cause par une anomalie enzymatique) la
plus frquente. Cette maladie touche au moins 100 millions de personnes.
Laffection qui en rsulte est lanmie hmolytique. Certains mdicaments comme
lantipaluden primaquine peuvent prcipiter des accs danmie hmolytique car
ils conduisent la production de H2O2 ou dO2 Les rythrocytes des individus porteurs dun dficit en glucose 6-phosphate
dshydrognase ne peuvent produire suffisamment de NADPH pour rgnrer le
GSH partir du GSSG, ce qui son tour altre leur capacit de se dbarrasser des
ROS. Ces composs peuvent alors oxyder des groupements SH importants dans
lactivit des protines et peroxyder des lipides membranaires des rythrocytes, ce
qui provoque leur lyse. En outre, quelques-uns des groupements SH de
139

lhmoglobine deviennent oxyds et la protine prcipite lintrieur des

rythrocytes, formant des corps de Heinz.
 Avantage volutif confr par un dficit en glucose 6-phosphate dshydrognase :
La frquence de la forme la plus commune de dficit en glucose 6-phosphate
dshydrognase, caractrise par une rduction de dix fois de lactivit enzymatique
dans les rythrocytes, est denviron 11 % parmi les Afro-Amricains. Cette
frquence leve suggre que le dficit pourrait tre avantageux dans certaines
conditions environnementales. En fait, le dficit en glucose 6-phosphate
dshydrognase apparat comme une protection contre le paludisme caus par
Plasmodium falciparum. Les parasites lorigine de cette maladie ont besoin de
glutathion rduit et des produits de la voie des pentoses phosphate pour une
croissance optimale. Ainsi, le dficit en glucose 6- phosphate dshydrognase
permet une protection contre le paludisme qui explique sa frquence leve dans les
rgions du monde affectes par cette maladie.

140

Chapitre 4 : Le mtabolisme des acides gras

Il existe une grande varit de composs lipidiques. Du point de vue quantitatif, les
triacylglycrols (graisses neutres ou triglycrides) sont de loin les plus importants
puisquils reprsentent environ 10 % du poids dun animal normal (chiffre qui peut tre
plus lev dans les cas dobsit).

4.1)

Les triacylglycrols constituent dimportantes rserves dnergie :

Les triacylglycrols constituent des rserves dnergie mtabolique extrmement

concentre parce quils sont rduits et anhydres. Le rendement de loxydation complte
dun acide gras est denviron 38 kJ/g, alors quil nest que de 17 kJ/g pour les glucides et les
protines.
La base de cette grande diffrence est que les acides gras sont beaucoup plus rduits que
les glucides et les protines. De plus, ils sont apolaires et peuvent donc tre stocks sous
forme presque anhydre alors que les glucides et les protines sont plus fortement hydrats.
En fait, le glycogne fixe 2 fois son poids sec deau. Dans le glycogne hydrat, le poids de
glycogne nest que le tiers du poids total. Par consquent, 1g de graisse presque anhydre
stocke 6 fois plus dnergie qu un gramme de glycogne hydrat.
Typiquement, un homme de 70 kg possde les rserves nergtiques suivantes :
* 420.000 kJ sous forme de triacylglycrols,
* 100.000 kJ sous forme de protines (essentiellement musculaires),
* 2.500 kJ sous forme de glycogne,
* 170 kJ sous forme de glucose.
Les triacylglycrols reprsentent environ 11 kg de son poids corporel total. Si la mme
quantit dnergie tait stocke sous forme de glycogne, son poids corporel total serait
plus lev de 55 kg. Les rserves de glycogne et de glucose apportent suffisamment
dnergie pour soutenir les fonctions biologiques pendant 24 heures environ, tandis que les
rserves de triacylglycrols permettent une survie de plusieurs semaines.
Pour avoir de lnergie, il y a
1e : dgradation du glucose
2e : dgradation du glycogne
3e : dgradation des acides gras
4e : dgradation des protines
Chez les mammifres, le principal site daccumulation des triacylglycrols est le cytoplasme
des cellules adipeuses o des triacylglycrols forment un gros globule qui peut occuper la
plus grande partie du volume cellulaire. Les cellules adipeuses sont spcialises dans la
synthse et le stockage des triacylglycrols, ainsi que dans leur mobilisation en molcules
nergtiques transportes par le sang vers les autres tissus.

141

4.2)

Digestion des graisses alimentaires :

La plupart des lipides capts au niveau de

lintestin grle sont sous forme de
triacylglycrols. Mais ils doivent tre dgrads
en acides gras pour passer la barrire de
lpithlium intestinal.
Pour cela, vu quils sont trs peu solubles en
milieu aqueux, et donc peu accessibles aux
lipases, les triacylglycrols de la lumire
intestinale sont incorpors dans des micelles formes avec laide des sels biliaires (une
famille de drivs carboxyliques du cholestrol).
Lincorporation des lipides dans des micelles oriente leurs liaisons ester vers la surface et
les rend plus sensibles laction des lipases pancratiques.

Les lipases digrent les triacylglycrols en acides gras libres et en monoacylglycrols qui
sont absorbs par les cellules de lpithlium intestinal.
Dans les cellules de la muqueuse intestinale, les triacylglycrols sont resynthtiss partir
des acides gras et des monoacylglycrols. Les triacylglycrols sont ensuite inclus dans des
particules de transport de nature lipoprotique appeles chylomicrons.
Ces particules ont un diamtre de 100 500 nm. Leur cur
est hydrophobe et leur surface est une couche de
phospholipides dont les ttes polaires sont orientes vers
lextrieur.
Les triacylglycrols sont enferms lintrieur et peuvent
reprsenter jusqu 80 % de la masse des chylomicrons.
Plusieurs apolipoprotines se trouvent en surface et
interviennent dans la capture et le mtabolisme du contenu
des chylomicrons. Les chylomicrons sont librs dans le
systme lymphatique, puis dans le sang.
Ces particules se fixent des lipases membranaires, essentiellement au niveau du tissu
adipeux ou des muscles.
Les triacylglycrols sont une fois encore dgrads en acides gras libres et en
monoacylglycrols pour tre soit transports dans les cellules o des triacylglycrols sont
resynthtiss et mis en rserve (adipocytes) soit dgrads et utiliss comme source
dnergie (muscles).

142

4.3)

Utilisation des acides gras comme source dnergie :

a) Mobilisation des acides gras dans le tissu adipeux

Lvnement initial dans lutilisation des graisses comme source dnergie est
lhydrolyse des triacylglycrols en acides gras libres et en glycrol par les lipases
(lipolyse) : tri-, di- et monoacylglycrol lipases.
La triacylglycrol lipase du tissu adipeux est
active par ladrnaline et le glucagon. Dans les
adipocytes, ces hormones dclenchent des
rcepteurs 7 domaines transmembranaires qui
activent ladnylate cyclase. Laugmentation du
taux dAMPc stimule alors la PKA qui active la
lipase en la phosphorylant.
En revanche, linsuline inhibe la lipolyse.

La triacylglycrol lipase hydrolyse la liaison ester du C1 ou du C3 des triacylglycrols. Les

actions successives dune diacylglycrol lipase et dune monoacylglycrol lipase librent
ensuite les autres acides gras et le glycrol. Comme les acides gras ne sont pas solubles
dans le plasma sanguin, une fois librs, ils se fixent sur la srum albumine qui joue le rle
de transporteur. Ainsi, les acides gras libres deviennent une source dnergie utilisable par
dautres tissus (en particulier les muscles).

Le glycrol form par la lipolyse quitte le tissus adipeux, est absorb par le foie, puis est
phosphoryl en glycrol-3P, oxyd en dihydroxyactone phosphate et isomris en
glycraldhyde 3-phosphate. Cette dernire molcule est un intermdiaire des voies de la
glycolyse et de la gluconogense.
b) Oxydation des acides gras :
 Activation des acides gras : Les acides gras qui sont fournis aux tissus musculaires
par la circulation sanguine diffusent au travers de la membrane plasmique dans le
cytoplasme.
En 1948, Eugene Kennedy et Albert Lehninger ont montr que les acides gras sont
oxyds dans la matrice mitochondriale (tout comme le cycle de Krebs). Des travaux
ultrieurs ont dmontr quils taient activs avant dentrer dans ce compartiment
cellulaire. LATP active la formation dune liaison thioester entre le groupe carboxyle
143

dun acide gras et le groupe sulfhydryle du CoA. Cette raction dactivation seffectue
au niveau de la membrane mitochondriale externe et est catalyse par lacyl CoA
synthtase.
Paul Berg a montr que lactivation dun acide gras seffectue en 2 tapes, catalyses
par lacyl CoA synthtase :
* Lacide gras ragit avec lATP pour former
un acyl adnylate o le groupe carboxyle de
lacide gras est li au groupe phosphoryle de
lAMP. Les deux autres groupes phosphoryle
de lATP sont librs sous forme de
pyrophosphate. Lacyl adnylate reste
troitement associ lenzyme.
* Le groupe sulfhydryle du CoA attaque alors
lacyl adnylate pour former lacyl CoA et de
lAMP.
Les acyl CoA sont des composs riches en nergie : leur hydrolyse en acides gras et
en CoA libre une grande quantit dnergie (G = -31,5 kJ/mol). La formation
dacyl CoA est rendue favorable par son couplage la rupture de 2 liaisons riches en
nergie de lATP :
* Lhydrolyse de lATP en AMP et en pyrophosphate.
* Lhydrolyse du pyrophosphate en 2 molcules de phosphate par une
pyrophosphatase.
Cest en fait lhydrolyse du pyrophosphate par une pyrophosphatase qui dplace
lquilibre de la raction dans le sens de la formation dacyl CoA.
Acide gras + CoA acyl CoA + H2O

G = +31,5 kJ/mol

ATP + H2O AMP + PPi

G = -32,3 kJ/mol

PPi + H2O 2 Pi

G = -33,6 kJ/mol

--------------------------------------------------------------------------------------------------------Acide gras + CoA + ATP acyl CoA + AMP + 2 Pi

G = -34,4 kJ/mol

144

c) Transport des acides gras dans la matrice mitochondriale

Les acides gras sont activs sur la membrane mitochondriale externe alors quils sont
oxyds dans la matrice mitochondriale. Les acides gras sont transports travers la
membrane mitochondriale interne aprs leur conjugaison la carnitine. Le groupe acyle est
transfr de latome de soufre du CoA au groupe hydroxyle de la carnitine pour former une
acyl carnitine. Cette raction est catalyse par la carnitine acyltransfrase I lie la
membrane mitochondriale externe.
Lacyl carnitine est alors transporte
travers la membrane mitochondriale
interne par une translocase. Le groupe
acyle est rendu au CoA sur la face
matricielle de la membrane. Cette
raction est catalyse par la carnitine
acyltransfrase II et est simplement
linverse de la raction qui seffectue
au
niveau
de
la
membrane
mitochondriale externe. Finalement, la translocase ramne la carnitine la face cytosolique
par change avec une acyl carnitine entrant dans la matrice mitochondriale.
d) Ractions de la -oxydation des acides gras :
Un acyl CoA est dgrad par une squence rcurrente de 4
ractions:

Oxydation du carbone (C3) par le FAD

Hydratation

Oxydation du carbone (C3) par le NAD+

Thiolyse par le CoA.

La chane de lacyl CoA est raccourcie de 2 carbones la suite de ces

ractions et du FADH2, du NADH et de lactyl CoA sont produits.
Etant donn que loxydation porte sur le carbone (C3) de lacyl
CoA, cette srie de ractions est appele -oxydation.

145

La premire raction de chaque cycle de dgradation est loxydation de lacyl CoA

par une acyl CoA dshydrognase. Cette raction produit un noyl CoA possdant
une double liaison trans entre le carbone et le carbone (C2 et C3).
Les acyl CoA dshydrognases sont une famille de 3 enzymes solubles dont la
spcificit est restreinte aux acyl CoA longue (12-18 carbones), moyenne (14-4
carbones) ou courte (4-6 carbones) chane dacides gras. Lenzyme utilise est
spcifique de la longueur de lacide gras.
Ces dshydrognases contiennent un FAD fermement li qui
est rduit en FADH2 au cours de loxydation de lacide gras. Les
lectrons du FADH2 sont ensuite transfrs une flavoprotine
de
transfert
dlectrons
(ETF,
electron-transferring
flavoprotein). LETF rduite est roxyde par une protine
centre fer-soufre qui cde ensuite les lectrons la chane
transporteuse dlectrons au niveau du coenzyme Q. Ce dernier
dlivre ses lectrons au complexe III de la chane respiratoire
et par consquent 2 molcules dATP sont cres par molcule
de FADH2 forme lors de ltape de dshydrognation.

La deuxime raction est lhydratation de la double liaison entre le carbone et le

carbone par lnoyl CoA hydratase. Lhydratation de lnoyl CoA est
strospcifique : seul lisomre L du 3-hydroxyacyl CoA est form.

La troisime raction est une oxydation qui convertit le groupe hydroxyle en C3 en

un groupe ctone, ce qui produit un 3-ctoacyl CoA. Cette raction est catalyse par
la L-hydroxyacyl CoA dshydrognase, un enzyme dont le coenzyme est le NAD+
rduit en NADH au cours de la raction.

La quatrime raction est le clivage du 3-ctoacyl CoA par le groupe thiol dune
seconde molcule de CoA, ce qui donne un actyl CoA et un acyl CoA raccourci de 2
atomes de carbone. Ce clivage thiolytique est catalys par la - ctothiolase.

Le bilan dun cycle de -oxydation est donc :

Cn Acyl CoA + FAD + NAD+ + H2O + CoA Cn-2 acyl CoA + FADH2 + NADH + H+ + actyl CoA
Il y a donc 2 carbones en moins qui sont sous forme dactyl CoA. Lacyl CoA raccourci subit
alors un autre cycle doxydation. La rptition de ce cycle, avec au dpart un acide gras
nombre pair datomes de carbone, aboutira lors de la dernire tape la formation de 2
molcules dactyl CoA. Celles-ci peuvent ensuite tre mtabolises par la voie du cycle de
Krebs. Dautre part, le FADH2 et le NADH gnrs par ce processus vont pouvoir tre
roxyds par la chane respiratoire.

146

Chaque cycle de -oxydation produit :

1 FADH2

1,5 ATP

1 NADH

2,5 ATP

1 Actyl CoA

10 ATP/GTP (cycle de Krebs; 3 NADH, 1 FADH2, 1 GTP)

----------------------------------------------------------------------------------------Total

14 ATP

Si nous prenons lexemple de lacide palmitique qui a 16 atomes de carbone.

FADH2 + NADH (7 X 4 ATP) 28 ATP
Actyl CoA (8* X 10 ATP/GTP)

80 ATP

* Le dernier cycle produit 2 actyl CoA

--------------------------------------------------------Total

108 ATP

Aprs avoir retranch les 2 ATP consomms pour lactivation de lacide gras en acyl CoA on
obtient un total de 106 ATP gnrs par molcule dacide palmitique oxyde.
Le rendement nergtique par atome de carbone est donc de 6,6 ATP/Coxyd (106/16) pour
loxydation des acides gras, ce qui est suprieur la valeur obtenue par le glucose qui est de
5 ATP/Coxyd (30/6).
e) Oxydation des acides gras nombre impair de carbones

Les acides gras possdant un nombre impair datomes de carbone sont des espces
mineures. Ils sont oxyds de la mme faon que les acides gras possdant un nombre pair
datomes de carbone, ceci prs que le dernier cycle de dgradation produit de lactyl CoA
et du propionyl CoA. Ce dernier est carboxyl pour donner lisomre D du mthylmalonyl
CoA. Cette raction, couple lhydrolyse dun ATP, est catalyse par la propionyl CoA
carboxylase, un enzyme biotine dont le mcanisme catalytique est semblable celui de la
pyruvate carboxylase. Une pimrase transforme lisomre D du mthylmalonyl CoA en
isomre L, substrat dune mutase qui le convertit en succinyl CoA par un rarrangement
intramolculaire. Le succinyl CoA est un intermdiaire du cycle de Krebs.

147

e) Les corps ctoniques :

Lactyl CoA form lors de loxydation des acides gras nentre dans le cycle de Krebs que si
la dgradation des lipides et celle des glucides sont correctement quilibres.
En effet, lactyl CoA nentre dans le cycle de Krebs que si loxaloactate est disponible et ce
dernier est form par la pyruvate carboxylase au dpart du pyruvate, produit de la
glycolyse.
Au cours du jene (pas dapport de glucides), loxaloactate est utilis pour former du
glucose par la voie de la gluconogense et nest donc pas disponible pour lamorage du
cycle de Krebs. Dans ces conditions, lactyl CoA est dirig vers la formation de corps
ctoniques : actoactate, de D-3-hydroxybutyrate et actone. Les corps ctoniques sont
synthtiss principalement dans le foie et sont utiliss par le cerveau, le cur et le muscle
squelettique des fins nergtiques.
Lactoactate est form partir de lactyl CoA en 3 tapes dans le foie :

Deux molcules dactyl CoA se condensent pour former lactoactyl CoA.

Cette raction, catalyse par une thiolase, est linverse de ltape de thiolyse de
loxydation des acides gras.

Lactoactyl CoA ragit alors avec un actyl CoA et de leau pour donner du 3hydroxy-3-mthylglutaryl CoA (HMG-CoA) et du CoA. Cette raction, qui a un
quilibre favorable d lhydrolyse dune liaison thioester, compense lquilibre
dfavorable de la formation de lactoactyl CoA.

Le HMG-CoA est ensuite cliv en actyl CoA et actoactate.

La somme de ces ractions est : 2 Actyl CoA + H2O actoactate + 2 CoA + H+

Lactoactate peut :
* tre rduit en D-3-hydroxybutyrate dans la matrice mitochondriale. Le rapport
hydroxybutyrate / actoactate dpend du rapport NADH / NAD+ lintrieur des
mitochondries : il y a rduction si ce rapport est lev.
* subir une dcarboxylation lente et spontane en actone (car lactoactate est un
-ctoacide). Lodeur dactone peut tre dtecte dans lhaleine dune personne
possdant une concentration leve dactoactate dans le sang.

148

Alors que le glucose est la principale molcule nergtique pour le cerveau chez les sujets
correctement nourris, le cerveau peut sadapter lutilisation de corps ctoniques lors du
jene. Lors dun jene prolong, on estime mme que 75 % de lnergie ncessaire au
cerveau sont apports par les corps ctoniques.
Utilisation des corps ctonique (dans le cerveau, cur et muscles) :

Le 3-hydroxybutyrate est oxyd pour produire de lactoactate ainsi que du NADH

utilisable dans la phosphorylation oxydative.

Lactoactate peut tre activ en actoactyl CoA par le transfert du CoA partir du
succinyl CoA lors dune raction catalyse par une CoA transfrase spcifique.

Lactoactyl CoA est alors cliv par la thiolase pour donner deux molcules dactyl
CoA qui peuvent entrer dans le cycle de Krebs.

Le foie peut fournir de lactoactate dautres organes parce quil na pas cette CoA
transfrase particulire : cest donc le lieu de formation des corps ctoniques, mais il ne les
utilise pas.
Les corps ctoniques peuvent tre considrs comme une forme transportable
hydrosoluble dunits actyle : les acides gras librs du tissu adipeux sont convertis en
units actyle par le foie qui peut alors les exporter sous forme dactoactate vers dautres
organes via le cycle de Krebs.

4.4)

Biosynthse des acides gras :

Lorsquil ny a pas besoin dnergie, les

acides gras vont tre synthtiss plutt que
dgrads. La voie de biosynthse des acides
gras nest pas simplement la voie inverse de
leur dgradation. En fait, elle est constitue
dun nouvel ensemble de ractions.
Les diffrences importantes entre ces 2
voies sont les suivantes :
* Compartiment : la synthse a lieu
dans le cytosol alors que la
dgradation seffectue dans la
mitochondrie.

149

* Prcurseur : la synthse des acides gras dmarre de lactyl CoA et la chane dacide
gras en formation est allonge par laddition squentielle dunits de 2 carbones.
Cependant, le donneur activ dunits dicarbones nest pas lactyl CoA mais le
malonyl CoA.
* Cofacteurs engags : le rducteur dans la synthse des acides gras est le NADPH,
tandis que les oxydants dans la dgradation sont le NAD+ et le FAD.
* Intermdiaires : les intermdiaires de la synthse des acides gras sont lis par
covalence au groupe sulfhydryle dune protine de transport dacyle (ACP ; acyl
carrier protein), alors que les intermdiaires de la dgradation des acides gras sont
unis au CoA.
a) Formation du malonyl CoA :
La synthse des acides gras commence par la carboxylation dun actyl CoA en malonyl
CoA. Ce dernier est form partir de
bicarbonate et dactyl CoA. La raction se
droule en 2 tapes mais dans un seul
complexe grce au long bras flexible qui fait
passer la biotine dune entit enzymatique
une autre.
Cette raction est catalyse par lactyl CoA
carboxylase qui contient un groupe
prosthtique biotine li par covalence une
lysine, comme dans la pyruvate carboxylase et
la propionyl CoA carboxylase. Comme avec ces autres enzymes, un intermdiaire
carboxybiotine est form aux dpens de lhydrolyse dune molcule dATP. Le groupe CO2
activ de cet intermdiaire est alors transfr lactyl CoA pour former le malonyl CoA.
b) Cycle dlongation de la synthse des acides gras :
Chez les eucaryotes, les enzymes qui catalysent la synthse des acides gras partir de
lactyl CoA, du malonyl CoA et du NADPH sont unis en une seule chane polypeptidique
appele acide gras synthase. Par contre, les enzymes qui constituent les acides gras
synthases des bactries se dissocient lorsque les cellules sont rompues. Lobtention de ces
enzymes isols a facilit llucidation des tapes de la synthse des acides gras.
La phase dlongation commence par la formation dactyl ACP et de malonyl ACP. Lactyl
transacylase et la malonyl transacylase catalysent les ractions :
Actyl CoA + ACP actyl ACP + CoA
Malonyl CoA + ACP

malonyl ACP + CoA.

150

Les intermdiaires de la synthse des acides gras sont lis lextrmit sulfhydryle dun
groupe phosphopantthine, qui est lui-mme fix un rsidu srine de lACP. Il faut
remarquer que, dans la dgradation des acides gras, un groupe phosphopantthine fait
partie du CoA.
LACP ressemble au coenzyme A du point de vue
ractionnel, ils ont tous les 2 ont long bras flexible.
Nanmoins, contrairement au CoA, lACP nest pas li
ladnosine mais une protine. Ils ont tous 2 la mme
entit ractive : le groupement sulfhydryle. Ds lors, lACP
(constitue dune chane polypeptidique de 77 rsidus)
peut tre considre comme un macro CoA .

1e tape : Formation dactoactyl ACP

Lactyl ACP et le malonyl ACP ragissent pour former lactoactyl ACP. Cette raction
est catalyse par lenzyme de condensation -ctoacyl synthase:
Actyl ACP + malonyl ACP actoactyl ACP + ACP + CO2
Le CO2 libr est celui qui avait t fix sur lactyl CoA pour former le malonyl CoA.
Bien que le CO2 (sous forme de bicarbonate) soit ncessaire la synthse des acides
gras pour la formation du malonyl CoA, son atome de carbone napparat pas dans le
produit. En fait, tous les atomes de carbone des acides gras nombre pair datomes de
carbone proviennent de lactyl CoA.
Les 3 tapes suivantes permettent la rduction du groupe ctone en C3 en un groupe
mthylne.

2e tape : Rduction de lactoactyl ACP

Lactoactyl ACP est rduit en D-3- hydroxybutyryl ACP. Cette raction diffre de la
raction correspondante de la dgradation des acides gras par 2 points :
* Lpimre D et non pas lpimre L est form.
* Le NADPH est lagent de rduction, alors que le NAD+ est lagent doxydation dans
la dgradation.

3e tape : Formation du crotonyl ACP

Le D-3-hydroxybutyryl ACP est dshydrat pour former le crotonyl ACP (un trans-2noyl ACP).

151

4e tape : Formation de butyryl ACP

Ltape finale du premier cycle rduit le crotonyl ACP en butyryl ACP. Le NADPH est
nouveau le rducteur, alors que le FAD est loxydant dans la raction correspondante de
la dgradation des acides gras. On a donc une liaison sature et 2 carbones de plus.
Ce premier cycle forme ainsi une molcule 4 carbones.
Le deuxime cycle de synthse des acides gras ajoute de nouveau 2 carbones : le butyryl
ACP se condense avec le malonyl ACP pour former un C6--ctoacyl ACP.
Une rduction, une dshydratation et une seconde rduction transforment ce compos
en C6-acyl ACP qui est prt subir un troisime cycle dlongation.
Les cycles dlongation se poursuivent jusqu ce quun C16-acyl ACP soit form. Ce
compos est un bon substrat pour une thioestrase qui hydrolyse le C16-acyl ACP en
palmitate et ACP. Cette thioestrase agit comme un rgulateur pour dterminer la
longueur de la chane dacide gras. Les acides gras plus longs sont forms par un
systme enzymatique annexe sur la face cytosolique de la membrane du rticulum
endoplasmique.
Intressons nous la synthse des acides gras chez les mammifres. Bien que les ractions
biochimiques de base de la synthse des acides gras soient trs semblables chez les
bactries et chez les eucaryotes, la structure de la synthase varie considrablement.
 En effet, les acide gras synthases des eucaryotes, contrairement aux
bactriennes, ont leurs composants enzymatiques unis dans une grande chane
polypeptidique.
 Lacide gras synthase des mammifres est un dimre de sous-units identiques
de 260 kDa.
 Chaque chane est reploye en trois domaines unis par des rgions flexibles.
Le domaine 1 (unit dentre et de condensation des substrats) contient lactyl
transfrase, la malonyl transfrase et la -ctoacyl synthase (enzyme de condensation).
Le domaine 2 (unit de rduction, dshydratation, rduction) contient lACP, la -ctoacyl
rductase, la dshydratase et lnoyl rductase.
Le domaine 3 correspond la thioestrase : hydrolyse du lien thioester.
Les ractions se font dans un complexe multienzymatique. Lenzyme garde son substrat
tout au long de la raction. Cela permet dviter les tapes de diffusion entre les sites
catalytiques.
Ainsi, 7 sites catalytiques diffrents sont prsents sur une seule chane polypeptidique. La
flexibilit et la longueur (20 ) de la partie phosphopantthine sont essentielles au
fonctionnement de cette entit : le substrat est sur un bras long et flexible qui peut
atteindre chacun des nombreux sites actifs. Lorganisation de la synthase des acides gras
152

des organismes eucaryotes augmente lefficacit de lensemble du processus car les

intermdiaires sont directement transfrs dun site actif au suivant.

c) Stchiomtrie de la synthse des acides gras :

La stchiomtrie de la synthse du palmitate (acide gras satur 16 carbones) est :
actyl CoA + 7 malonyl CoA + 14 NADPH + 20H+

palmitate + 7 CO2 + 14 NADP+ + 8 CoA + 6 H2O

Comme le manolyl CoA est form partir dactyl CoA (ce qui consomme de lnergie) :
7 actyl CoA + 7 CO2 + 7 ATP 7 malonyl CoA + 7 ADP + 7 Pi+ 14 H+
La stoechiomtrie globale de la synthse du palmitate est donc :
8 Actyl CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 6H+

Citrate + ATP + CoA + H2O

palmitate + 14 NADP+ + 8 CoA + 6 H2O + 7 ADP + 7 Pi

La synthse du palmitate ncessite lapport

de 8 molcules dactyl CoA, de 14 molcules
de NADPH et de 7 molcules dATP.
Cette raction consomme donc beaucoup de
NADPH.
Les acides gras sont synthtiss dans le
cytosol alors que lactyl CoA est form
partir du pyruvate dans la mitochondrie. Cet
actyl CoA doit donc tre transfr de la
mitochondrie vers le cytosol. Cependant, la
membrane mitochondriale interne est
impermable lactyl CoA.
Cette barrire est vite par un systme de
navette. Le citrate est form dans la matrice
mitochondriale par condensation de lactyl
CoA avec loxaloactate.
Quand il est prsent une concentration
leve, le citrate est transport vers le
cytosol o il est cliv par la citrate lyase qui
catalyse la raction :
actyl CoA + ADP + Pi + oxaloactate

Lactyl CoA et loxaloactate sont donc transfrs de la mitochondrie vers le cytoplasme

aux dpens de lhydrolyse dune molcule dATP.
Loxaloactate form dans le cytoplasme doit maintenant retourner la mitochondrie.
Cependant, la membrane mitochondriale interne est impermable loxaloactate.

153

Ds lors, loxaloactate est rduit en malate par une malate dshydrognase cytoplasmique
utilisant le NADH :
Oxaloactate + NADH + H+ malate + NAD+
Ensuite le malate est dcarboxyl oxydativement par lenzyme malique utilisant du NADP+ :
Malate + NADP+ pyruvate + CO2 + NADPH
Cette raction produit du NADPH dans le cytosol.
Le pyruvate entre facilement dans la mitochondrie o il est carboxyl en oxaloactate par
la pyruvate carboxylase :
Pyruvate + CO2 + ATP + H2O oxaloactate + ADP + Pi + 2H+
Le bilan de ces 3 ractions est:
NADP+ + NADH + ATP + H2O NADPH + NAD+ + ADP + Pi + H+
Ainsi, une molcule de NADPH est cre pour chaque molcule dactyl CoA transfre de la
mitochondrie au cytosol. De ce fait, 8 molcules de NADPH sont formes lorsque 8
molcules dactyl CoA sont transfres vers le cytosol pour la synthse du palmitate. Les 6
molcules de NADPH supplmentaires ncessaires ce processus proviennent de la voie
des pentoses phosphate.

4.5)

Contrle du mtabolisme des acides gras :

Le mtabolisme des acides gras est troitement contrl afin que la synthse et la
dgradation rpondent aux besoins physiologiques. La synthse des acides gras est
maximale lorsque les glucides et lnergie sont abondants et les acides gras rares.
Lactyl CoA carboxylase joue un rle cl dans la rgulation du mtabolisme des acides
gras. Pour rappel, cet enzyme catalyse la production de malonyl CoA, tape qui engage la
synthse des acides gras.
La carboxylase est : - inhibe par phosphorylation
- active par dphosphorylation.
- active allostriquement par le citrate
La phosphorylation dun seul rsidu srine par une protine kinase AMP-dpendante
(AMPK, AMP-dpendent protein kinase) convertit la carboxylase en une forme inactive.
Dautre part, le groupe phosphoryle peut tre limin de la carboxylase par la protine
phosphatase 2A (PP2A), ce qui transforme lenzyme en sa forme active.
La proportion de carboxylase dans sa forme dphosphoryle active dpend donc des
vitesses relatives de lAMPK et de la PP2A.

154

Comment la formation de la forme phosphoryle inactive de lenzyme est-elle rgule ?

 LAMPK est active par lAMP et inhibe par lATP. La carboxylase est donc
inhibe (phosphoryle) lorsque la charge nergtique est faible et active
lorsque la charge nergtique est leve.
 Ladrnaline et le glucagon activent la PKA qui, son tour, inhibe la PP2A en la
phosphorylant. Ces hormones stoppent donc la synthse des acides gras en
maintenant la carboxylase dans un tat phosphoryl inactif.
 Linsuline stimule la carboxylase en provoquant sa dphosphorylation mais on
ne sait pas encore quelle phosphatase confre la rponse linsuline.
La carboxylase est galement soumise un contrle allostrique : lenzyme est stimul par
le citrate. Le citrate permet dinverser partiellement linhibition produite par la
phosphorylation. Pour rappel, un taux lev de citrate signale que les modules pour les
synthses et lnergie sont abondants. Leffet stimulateur du citrate sur la carboxylase est
contrebalanc par le palmityl CoA qui est abondant lorsquil y a excs dacides gras.
La dgradation des acides gras est inhibe par le malonyl CoA, produit de la raction
catalyse par la carboxylase. Le malonyl CoA est prsent des taux levs lorsque les
molcules nergtiques sont abondantes (sa formation requiert de lactyl CoA et de lATP).
Le malonyl CoA inhibe la carnitine acyltransfrase I, empchant laccs des acyl CoA la
matrice mitochondriale dans les priodes dabondance.

155

Examen de 2006 (Kruys)

Q. 1) Lipides (6 points)
A. Structure de 2 lipides saponifiables forms partir de glycrol. Donnez le nom et le rle.
B. Structure de 2 lipides saponifiables forms partir de sphingosine. Donnez le nom et le rle.
C. Structure de 2 lipides non saponifiables. Donnez le nom et le rle.

Q. 2) Oses (6 points)
A. Quelles sont les diffrentes formes que peut prendre le glucose en tant que monomre.
Donnez le nom de chaque forme.
B. Donnez la formule du saccharose. Une mutarotation est-elle possible ? Justifiez.
C. Donnez un exemple d'htropolysaccharide et donnez-en son rle.

Q. 3) Mtabolisme (8 points)
A. Donnez les 2 tapes qui permettent la production d'ATP partir d'ADP dans la glycolyse.
Pourquoi est-ce possible cet endroit du chemin ractionnel ? Dtaillez.
Donnez ltape qui prcde pour les deux tapes prcdentes.
B. Chez l'humain le bilan de la production d'ATP lors de l'oxydation arobique du glucose (en
CO2 et H2O) est diffrent de 2 units selon que l'on considre une cellule du foie, du rein ou du
cur d'une part ou du cerveau et des muscles d'autre part. Expliquez. Dtaillez.

156

Examen de 2008 (Kruys)

Question n1 (4 points): Structure des lipides
- Donnez 1 exemple de lipide saponifiable non-polaire. Quel est le rle majeur de
ce type de lipide ?
- Donnez 1 exemple de lipide saponifiable contenant un atome de phosphore.
Quel est le rle majeur de ce type de lipide ?
Question n2 (2 points) : Structure des oses
- Associ lui-mme, le glucose forme des polymres. Donnez 1 exemple de
polymres contenant du glucose.
Prcisez quel est le type de liaison entre les monomres et la fonction biologique
du polymre.
Question n3 (2 points) : Structure des protines
- Ecrire la liaison peptidique entre 2 acides amins, dcrivez les caractristiques
structurales de la liaison peptidique et expliquez en les raisons.
Question n4 (2 points) : Structure des acides nucliques
- Ecrire la structure dun nuclotide 5 monophosphate. Spcifier les diffrences
existant entre un ribonuclotide et un doxyribonuclotide.
Question n5 (6 points) :
Dcrivez les diffrents mcanismes permettant une cellule en anarobie et en
arobie de rgnrer le NAD+ consomm lors de la glycolyse :
-Dtailler les ractions (structure des substrats et produits, nom des enzymes
catalyseurs) et le compartiment dans lequel ces ractions ont lieu.
- Quel impact ont ces ractions sur le bilan de la synthse dATP par le
catabolisme du glucose ?
Question n6 (4 points) :
Quest ce que le cycle Q ? Dans quel processus intervient-il ?
Dtaillez son mcanisme et sa raison dtre.

157

Questions frquentes aux examens oraux (VandenBranden) :

* Donner et expliquer les niveaux structuraux des protines
* Donner et expliquer les diffrentes classes de protines (globulaires, fibreuses, ...)
* Parler des modifications post-traductionnelle en gnrale (utilit, lieu, ...) et dtaillez deux
exemples. Comment mettre en vidence ces modifications post-traductionnelles ?
* Expliquer le rle des protines chaperons.
* Dtailler les systmes de dfenses que possde lorganisme contre les protines mal reployes.
* Dessiner un dipeptide. Parler du lien peptidique (faire un lien avec la structure secondaire)
* Quest ce que le diagramme de Ramachandran ?
* Exposez le Paradoxe de Levinthal (explication, rsolution). Contredit-il les conclusions
d'Anfinsen et si oui/non,donnez-en la justification.
* Parler de lexprience d'Anfinsen (expliquer pourquoi ce nest pas possible in vivo)
* Expliquer les mthodes dlectrophorse et de SDS-PAGE.
* Expliquer quels problmes les protines peuvent rencontres lors de leur scrtion. Comment
rsolvent elles le problme ?
* Donner l'quation cintique principale en Biochimie. A partir de celle-ci, quelle approximation
doit-on faire pour obtenir l'quation de Michaelis-Menten
* Expliquer le fonctionnement de la focalisation isolectrique
* Parler des inhibiteurs (ou activateurs) enzymatiques.
* Quel est le rle de l'AMP cyclique ?
* Expliquer ce qui se passe dans l'appareil de Golgi et dans le Rticulum Endoplasmique
* Expliquer ce que sont les doigts de Zinc et les tirettes Leucines
* Expliquer la cascade de ractions quand une hormone se fixe sur un rcepteur
* Quel est limplication de l'agitation thermique sur une protine ?
* Montrez l'aide d'un schma pourquoi la rotation autour du lien peptidique est empche.
* Pourquoi prfre-t-on parler d'effet hydrophobe plutt que d'interaction hydrophobe ?
* En dehors de l'effet hydrophobe, quels-sont les 4 types d'interaction qui peuvent stabiliser la
structure tertiaire d'une protine ?
* Dcrivez les 4 niveaux de structuration des protines
* Dessinez trs schmatiquement 2 brins beta antiparallles, notez les carbones alphas, les
chanes latrales par un 'R', le N-H et le C=O de part et d'autre du lien peptidique et dessinez en
pointill les liens hydrognes qui stabilisent l'interaction mutuelle de ces 2 brins.
* Dessinez trs schmatiquement une hlice alpha droite vue de profil en mettant en vidence la
position des liens hydrognes responsables de la stabilisation de cette structure. Dessinez ensuite
l'hlice alpha en projection (pour une squence de 7 acides amins) avec son axe perpendiculaire
votre feuille et en symbolisant les chanes latrales des acides amins par des boules.
* Dfinissez le pH isolectrique d'une protine.
* Comment Anfinsen dmontre-t-il exprimentalement que la structure tri-dimentionnelle finale
d'une protine peut s'acqurir par reploiement, spontanment ?
* Pourquoi Anfinsen dans l'exprience sur la dnaturation de la RNAase utilise-t-il du 2mercaptothanol ?
* Quelle-est la fonction gnrale de la Protein-Thiosulfide-Isomrase (PID) ou des protines de
la famille DsbC, que se passe-t-il si ces protines ne peuvent intervenir efficacement ?
* Quel mcanisme est l'origine de la destruction d'une partie des protines (mal reployes) ?
(expliquez les tapes principales)
* Quel-est le rle de la squence signal d'une chane polypeptidique ? Que se passe-t-il si elle
est absente ?
* Dfinissez translocon d'aprs son rle.

158

* O se droule la premire tape de la N-glycosylation ? Quel est le rle de l'enlvement des

trois glucoses terminaux ? Pourquoi qualifie-t-on les N-glycosylations de high mannose
avant l'tape du Golgi et pourquoi complex carbohydrates aprs ltape du Golgi ? Quelle-est
la diffrence ?
* Quel-est le motif de squence sur lequel on trouve la N-glycosylation ?
* A quel acide amin s'accrochent les sucres dans lO-glycosylation ?
* Quelle voie empruntent gnralement les protines qui ont travers le translocon chez les
eucaryotes ?
* Pourquoi les enzymes prsents dans les lyzosomes ont-ils souvent un pH de fonctionnement
optimal proche de pH 4.5 ? Que signifie pH de fonctionnement optimal ?
* Pourquoi la plupart des enzymes du corps humain ont-ils une temprature de fonctionnement
optimale proche de 40C ? Que se passe-t-il pour la plupart de ces enzymes si on les chauffe
plus de 50-60C ?
* Comment peut-on dterminer exprimentalement la constante de Michaelis-Menten et
comment peut-on utiliser la reprsentation de Lineweaver-Burk (LB) pour la calculer ?
* Dessinez une reprsentation type de LB et montrez comment graphiquement on peut distinguer
une inhibition par comptition d'une inhibition non-comptitive ?
* Quelles conditions doivent tre runies pour pouvoir utiliser le modle cintique de M&M ?
* Quelle mthode chromatographique permet de sparer les protines en fonction de leur:
1) taille
2) pH isolectrique
* Dans une chromato par exclusion de taille, les protines les plus petites arrivent-elles la sortie
de la colonne avant ou aprs les plus grosses et pourquoi ?
* Dans une chromato de chlation, quelle modification apporte-t-on la squence de la protine
pour rendre la mthode slective vis--vis de cette protine ? Comment lue-t-on la protine
(justifiez d'aprs le principe de l'interaction protine-support chromatographique).
*Comment lue-t-on une protine capture sur une colonne de chromatographie par affinit?
Expliquer le principe.
* Pourquoi une lectrophorse en prsence de SDS spare-t-elle les protines en fonction de leur
taille et non (en premire approximation) de leur pH isolectrique ?
* En vous rfrant au tableau des pKa des chanes latrales des acides amins, la charge globale
nette d'une protine contenant 4 acides aspartiques, 3 acides glutamiques, 7 lysines et 5 arginines
et ne possdant en outre pas d'histidine, ni aucune modification post-traductionnelle, sera-t-elle
normalement positive ou ngative pH=7 ?
* Quelle sera pH=5 la charge globale nette d'une protine possdant aucun acide amin modifi
post-traductionnellement, ni acide amin basique, ni acide mais possdant une histidine ?
* Quelle-est la charge nette d'une protine dissoute dans une solution tamponne un pH
infrieur au pH isolectrique de la protine ?
* O sont localiss (dans la cellule) gnralement les rcepteurs d'hormones strodiennes ?
* Dessinez schmatiquement la partie responsable de la dimrisation d'un rcepteur
intracellulaire possdant un motif leucine zipper et schmatisez galement la partie
responsable de l'interaction avec l'ADN. Quelle-est le rle de l'interaction avec l'ADN ?
* Comment prvoir l'existence possible d'un motif leucine zipper en analysant la structure
primaire de la protine ? Dans la Leu zipper, quel-est l'intervalle entre deux leucine successives
et pourquoi cet intervalle en vous rfrant au nombre d'acides amins pour effectuer un nombre
de tour entier (approx) dans une hlice alpha droite classique ?
* Dessinez schmatiquement un doigt de zinc (zinc finger). Quel-est le type de liaison du
zinc avec les acides amins dans le doigt de zinc (et avec quel type d'acide amin)?
* Qu'est-ce qu'un messager secondaire dans les mcanismes de signalisation ?
* Pourquoi le relais par un messager secondaire permet-il une amplification du signal ?

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