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PHOS-KIT INSTRUCTIONS

For Testing Pasteurization Efficiency by the Scharer Rapid


Phosphatase Method
La prueba de la fosfatasa se realiza para determinar si la pasteurizacin se realiza
correctamente y si la leche cruda se aadi a la leche pasteurizada.
La fosfatasa alcalina es un producto metablico del metabolismo celular mamaria y un
componente natural de la leche. Es lbil al calor y tiene un pH ptimo de 9,65 a 10,0.
La resistencia trmica de la fosfatasa es mayor que el de la formacin de microorganismos
patgenos no formadoras. Por lo tanto, los tratamientos trmicos mnimos aplicados
comercialmente para inactivar la fosfatasa va a matar todos los microorganismos patgenos
que forman no formadoras. Los productos lcteos que muestran una prueba negativa para la
fosfatasa se consideran adecuadamente pasteurizada y segura.
FUNDAMENTO DE LOS MTODOS
Las pruebas de fosfatasa se basan en el principio de que la enzima hidroliza steres de
monofosfato a la temperatura y pH adecuados compuestos liberadores que se pueden detectar
por desarrollo de color. La cantidad de color desarrollado es proporcional a la concentracin de
la enzima.
En el caso de la prueba Scharer rpido de la fosfatasa, cualquier fosfatasa presente reacciona
con el sustrato de fosfato disdico fenilo para liberar fenol. El fenol reacciona con chloroimide
2,6-dichloroquinone (CQC) y catalizador de cobre para producir azul de indofenol.
INSTRUCCIONES
CRISTALERAS Toda la cristalera debe ser escrupulosamente limpios y protegidos de la
contaminacin durante el almacenamiento. Utilice slo detergentes que no contienen
compuestos fenlicos. El material de vidrio provisto con este kit incluye cierres con
revestimientos que estn libres de fenol.
Toda la cristalera se debe lavar a fondo y se enjuaga antes de ser reemplazado en el PHOSKIT para evitar la contaminacin cruzada de una prueba positiva previa.
CONTROLES
Para cada serie de muestras analizadas, un conjunto de controles debe ser probado para
asegurar que los resultados son verdaderos.
Control Positivo - Para asegurarse de que los reactivos estn funcionando correctamente.
Aadir 0,5 ml de leche cruda a 250 ml de leche hervida. Una prueba de la fosfatasa en esta
muestra debe tener la misma intensidad de color que el estndar de color Unidad # 2. Si la
leche cruda no est disponible, aadir una gota de una solucin de fenol 0,005% a 0,5 ml de
leche hervida y realizar la prueba de la fosfatasa.
Control negativo - Para asegurarse de que los reactivos estn libres de contaminantes.
Colocar 5 ml de muestra de leche lquida o 5 g de muestra de leche slido en un tubo de
ensayo con tapn de rosca. Llevar la muestra a 95 C en un bao de agua hirviendo, el calor
durante un minuto, y luego enfriar rpidamente a temperatura ambiente. Una prueba de la
fosfatasa ejecutar en esta muestra debe dar un resultado negativo.

Interferir Control de Sustancias - Para probar para la coloracin de materiales o los efectos
de la grasa. Disolver un comprimido de control de buffer intermedia (item # 4057-00) en 50 ml
de agua destilada y ejecute la prueba de la fosfatasa en esta solucin. Las sustancias extraas
o aditivos pueden causar un falso positivo. Desarrollo de la coloracin azul indica el alcance de
color debido a las sustancias que interfieren y no a la presencia de fosfatasa. Este color se
debe tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados.
REACTIVOS
Tamponado sustrato (BUFFER) - Coloque una pastilla de sustrato Buffer (item # 4058-00) en
una botella de vidrio graduado a 50 ml (incluidas con el juego). Aadir agua destilada para
marcar, permite la tableta para ablandar a continuacin, aplastar con una varilla de cristal se
agita. Agitar hasta su completa disolucin. Esto hace suficiente solucin para diez pruebas.
Control de tampn - Coloque un control de la tableta tampn (item # 4057-00) en una botella
de vidrio graduado a 50 ml (incluidas con el juego). Aadir agua destilada para marcar, permite
la tableta para ablandar a continuacin, aplastar con una varilla de cristal se agita. Agitar hasta
su completa disolucin. Esto hace suficiente solucin para diez pruebas.
REACTIVOS
Tamponado sustrato (BUFFER) - Coloque una pastilla de sustrato Buffer (item # 4058-00
BUFFER SUBSTRATE TABLET) en una botella de vidrio graduado a 50 ml (incluidas con el
juego). Aadir agua destilada para marcar, permite la tableta para ablandar a continuacin,
aplastar con una varilla de cristal se agita. Agitar hasta su completa disolucin. Esto hace
suficiente solucin para diez pruebas.
Control de tampn (BUFFER) - Coloque un control de la tableta tampn (BUFFER) (item #
4057-00 BUFFER CONTROL TABLET) en una botella de vidrio graduado a 50 ml (incluidas
con el juego). Aadir agua destilada para marcar, permite la tableta para ablandar a
continuacin, aplastar con una varilla de cristal se agita. Agitar hasta su completa disolucin.
Esto hace suficiente solucin para diez pruebas.
CQC - Coloque una tableta de CQC (item # 4059-00 REAGENT TABLET) en un tubo de
ensayo. Aadir 5 ml de alcohol metlico. Deje que la tableta se ablande y luego aplastar con
una varilla de cristal de agitacin. Agitar vigorosamente hasta disolverla, transferir a una botella
de vidrio de color mbar limpia gotero (proporcionado en el kit) y guardar en la nevera. Haga
caso omiso de cualquier catalizador de cobre no disuelto. Esta solucin hace lo suficiente para
25 - 30 pruebas.
Desechar la solucin cuando empiece a tomar un color marrn. Enjuague la botella y el
cuentagotas con alcohol metlico antes de volver a usar. NOTA: El alcohol etlico no se puede
utilizar debido a que no disuelve el catalizador de cobre.
MTODOS
Todas las muestras se conservarn a 0 a 4.4 C o menos desde el momento de la recoleccin
hasta el momento del anlisis.
Los tubos de ensayo se calibran para la parte superior del menisco para cumplir con la marca.
marcas de calibracin indican 5,0, 5,5 y 8,5 ml.
1. Llenar el tubo hasta la marca de 5,0 ml con solucin tampn de sustrato ajustar el nivel con
una pipeta de gotero de vidrio.

2. Aadir 0,5 ml de muestra usando una pipeta de gotero de vidrio fresco; mezclar invirtiendo el
tubo varias veces. NOTA: El uso de una pipeta limpia o de gotero de vidrio para cada muestra.
3. Coloque inmediatamente los tubos en un bao de agua a 40 1C. Permitir a los tubos para
calentar a 40, a continuacin, se calientan durante otros 15 minutos. Como alternativa, se
incuba durante 20 minutos a 40 1C.
4. Retire los tubos del bao de agua y aadir 6 gotas de la solucin de CQC. Mezcle las
muestras por inversin varias veces e inmediatamente volver a incubar los tubos durante
exactamente 5 minutos.
5. Retire los tubos del bao de agua y enfriar en un bao de agua con hielo por debajo de
10C. Aadir el alcohol N-butil neutralizado 3,0 ml fro.
6. Coloque la tapa y extraer el indofenol invirtiendo suavemente los tubos a travs de un medio
crculo: Tome aproximadamente 1 segundo para invertir los tubos, hacer una pausa en
aproximadamente 1 segundo, tomar otro 1 segundo para devolver los tubos en posicin
vertical, hacer una pausa de 1 segundo, y luego repetir tres veces ms. Colocar los tubos en su
lado sobre una superficie plana durante 2 minutos para permitir la separacin del alcohol de
butilo y despus repetir la etapas de mezclado y de separacin.
7. Si el alcohol butlico se ha emulsionado de manera que ninguna capa clara alcohol butlico
sigue siendo, enfriar los tubos durante 5 minutos en un bao de agua con hielo y centrifugar
durante 5 minutos a 1000 x g. De lo contrario, repita la prueba.
8. Leer los resultados por los tubos de pie en posicin vertical y comparando el color de las
muestras con los tres estndares de color.
INTERPRETACIN
Para obtener los mejores resultados, ver los tubos contra la malla del filtro de plstico blanco
que tuvo lugar en frente de fuente directa de luz (luz de da o lmparas fluorescentes). No
intente hacer coincidir los resultados de la muestra a los estndares de color; ms bien,
determinar si la muestra contiene ms o menos el color azul de las normas.
Leche o crema que ha sido pasteurizada adecuadamente producir ningn color. Una muestra
debe ser considerado indebidamente pasteurizada si produce un color igual o mayor que el
estndar de la unidad de color # 1.
Los falsos positivos diversas afecciones que pueden causar un resultado falso positivo:
inadecuadamente limpiado o material de vidrio enjuagado.
Los cierres que contienen resinas fenlicas. Las botellas y tubos de ensayo incluidos en este
kit son libres de fenol.
reactivos de la prueba viejos o contaminados. Las soluciones se guardan hermticamente
cerrados en el frigorfico.
almacenado incorrectamente tabletas reactivas. Las tabletas vienen empaquetados con un
desecante. Guarde los frascos hermticamente cerrados y protegidos de la humedad, el calor y
la luz solar. La falta de almacenar de manera adecuada podra conducir a un deterioro.
Los falsos negativos

Alta temperatura. Si las muestras se incuban a una temperatura demasiado alta, el efecto de
la prueba se puede perder. Ebullicin destruye las enzimas de la misma manera que la
pasteurizacin adecuada.
Color de tiempo de desarrollo. Esta es una reaccin enzimtica; la cantidad de fenol liberado
por la fosfatasa es el tiempo y dependiente de la temperatura.
Preparacin de la muestra de otros productos lcteos
Cream - Crema muestras se tratan de la misma como la leche.
Productos lcteos cultivados - Homogenizar suero cultivado, crema agria y yogur en una
licuadora durante unos segundos, evitando de batido. Utilice sustrato de doble concentracin
tamponada y realice la prueba como se describe para la leche.
Para hacer doble concentracin de sustrato tamponado, disolver la tableta de sustrato
tamponado en 25 ml de agua.
Helado - fundir una porcin de la muestra y se deja reposar durante una hora para liberar el
aire atrapado. Eliminar cualquier fruta o frutos secos antes de la prueba. Tratar a cada sabor
individual. Realizar la prueba como se describe para la leche utilizando el sustrato tamponado
sola fuerza.
Mantequilla - Freeze porciones de mantequilla a ensayar en -15C 1C. Pesar 0,5 g de las
muestras directamente en tubos de ensayo. Calentar el control negativo a 95C durante 1
minuto en un bao de agua hirviendo, luego enfriar en un bao de agua con hielo.
Coloque el control negativo y las muestras de ensayo en un bao de agua 40C hasta que las
muestras se funden antes de aadir sustrato tamponado. Ensayo como con leche utilizando la
fuerza de un solo sustrato tamponado.
Queso - Medir el pH de la muestra de queso a ensayar. Congelada porciones de queso a
ensayar en -15C 1C. Pesar 5,0 g de las muestras directamente en tubos de ensayo. Aadir
2,0 ml de agua a cada muestra de queso con un pH superior a 7,0; aadir 2,0 ml de tampn
carbonato de * a cada muestra de queso con un pH inferior a 7,0. Macerar la muestra con una
varilla de cristal agitacin.
Calentar el control negativo a 95C durante 1 minuto en un bao de agua hirviendo, luego
enfriar en un bao de agua con hielo.
Aadir 18 ml de neutralizado alcohol n-butilo 8,3% con el control negativo y las muestras.
Mezclar en un mezclador de vrtice.
A continuacin, dejar reposar durante 5 minutos. muestras de filtro a travs de papel de filtro
Whatman # 4 en tubos de ensayo limpios colocados en un bao de agua.
Aadir 0,5 ml porciones de filtrado en tubos de ensayo y aadir 0,1 ml de disolucin de acetato
de magnesio **. Use una solucin de sustrato tamponado doble potencia. Procedimiento como
en la leche.
* Para hacer tampn carbonato, aadir 46,89 g de carbonato de sodio y 37,17 g de bicarbonato
de sodio al agua suficiente para hacer 1 litro de solucin. Almacenado en una botella con tapn
de vidrio, esta solucin en estables indefinidamente.

** Para obtener una solucin de acetato de magnesio, se disuelven 8,82 g de acetato de


magnesio en 50 ml de agua. Transferir cuantitativamente la solucin a un matraz aforado de
100 ml y diluir a 100 ml con agua.
LA WEBER CIENTFICA PHOS-KIT incluye lo siguiente:
1 extrable estante 9-tubo (artculo # 4054-00)
9 graduaron tubos de ensayo con tapones de rosca libre de fenol (item # 4052-01)
1 juego de 3 estndares de color permanentes (artculo # 4054-05)
1 lmina de filtro de plstico (item # 4054-10)
4 varillas de cristal de revolver (item # 4054-25)
pipetas de vidrio de goteo 12 con bombillas de goma (item # 4054-15)
1 frasco cuentagotas de vidrio de color mbar (item # 4054-30)
1 botella de vidrio mbar de 1 oz alcohol butlico (item # 4054-35)
1 botella de 50 ml con educacin (artculo # 4054-40)
50 Tabletas tampn de sustrato (item # 4058-00)
50 CQC Reactivo Tablets (item # 4059-00)
50 bfer de control de comprimidos (nmero de artculo 4057-00 )

Los reactivos en tabletas


Artculo No. Descripcin
4057-00 tabletas control de tampn - Disolver un comprimido en 50 ml de
agua para la solucin tampn de control: determina la presencia de una
sustancia que interfiere en los productos lcteos que dara un color azul
(falso positivo) en ausencia de la actividad de la fosfatasa. Hace solucin
suficiente para 10 pruebas de control. (Igual que Buf-fax) Botella / 50
4058-00 estabilizada tampn sustrato Tabletas Tabletas con estabilizador de
tampn de sustrato - Preparar la solucin de sustrato tamponado
inmediatamente antes de su uso mediante la disolucin de un comprimido
en 50 ml de agua; hace solucin suficiente para 10 pruebas. (Igual que
Phos-Phax) botella / 50
4059-00 estabilizada CQC Reactivo Tablets - Preparar solucin disolviendo
una tableta en 5 ml de alcohol metlico; hace solucin suficiente para 25-30
pruebas. (Indicador de fenol mismo que Indo-Phax) botella / 50
4060-00 alcohol n-butlico, se neutraliz Quart
4060-01 alcohol n-butlico, Galn neutralizado
4061-00 alcohol metlico Quart

Galn 4061-01 alcohol metlico