CTEDRA: BIOQUMICA

Carreras: Farmacia
Profesorado en Qumica
Licenciatura en Qumica
Lic. en C. y T. de los Alimentos

REPASO- ESPECTROFOTOMETRA.
1) Cul es la concentracin de una solucin de NADH (coeficiente de
absorcin molar a 340 nm igual a 6220 M -1 cm-1), 1 mL de la cual tiene una
absorbancia de 0,16 en una cubeta de 1 cm de paso ptico?
2) Una solucin de NADH tiene una absorbancia a 340 nm de 1,24. Cuntos
mL de esta solucin se debern tomar para preparar 10 ml de una solucin 1
M? Qu absorbancia tendra la solucin as obtenida?
3) Cuntos moles de NADH hay en 10 mL de una solucin que tiene una
absorbancia de 0,31 a 340 nm?
4) La citosina posee un coeficiente de absorcin molar de 6 10 3 M-1 cm-1 a 270
nm a pH 7. Calcule la absorbancia y el porcentaje de transmitancia de
soluciones 10 nM y 1 mM en cubetas de 1 cm y 1 mm.
5) Una solucin que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor
contiene 2 g/L de una sustancia que transmite slo el 75 % de la luz incidente
a una determinada longitud de onda. Calcular la absorbancia de una solucin
que contenga a) 4 g/L b) 1g/L c) 6 g/L y d) 5,4 g/L. Si el peso molecular del
compuesto es 250, calcule el coeficiente de absorcin molar.
6) El nicotinamida adenna dinucletido puede hallarse en forma oxidada
(NAD+) o reducida (NADH), siendo los coeficientes de absorcin para el NAD +
de 18000 M-1 cm-1 (260 nm) y para el NADH de 14500 M -1 cm-1 (260 nm) y de
6220 M-1 cm-1 (340 nm).
Se prepara una solucin 10 mM de NADH. A la semana, a fin de determinar si
el compuesto se ha oxidado, se mide en una cubeta de 1 cm de camino ptico
la absorbancia a 340 nm de una dilucin 1/100 de la solucin. Si esta
absorbancia fue de 0,36 determinar cul es la relacin NADH/NAD +. Qu
absorbancia dara esa misma solucin a 260 nm? (considerar la misma
dilucin).
7) Calcular las concentraciones de los compuestos A y B en una solucin
dada si la absorbancia de esta solucin en una cubeta de 3 cm de espesor es
0,62 a 450 nm y 0,54 a 485 nm. El compuesto A tiene un coeficiente de
absorcin molar de 12000 M-1 cm-1 a 450 nm y 4000 M-1 cm-1 a 485 nm. El
compuesto B tiene un coeficiente de absorcin molar igual a 5000 M -1 cm-1 a
450 nm y 11600 M-1 cm-1 a 485 nm.
8) A 0,3 mL de una muestra de protena de concentracin desconocida se le
agregaron 0,7 mL de agua y 4,0 mL de reactivo de Biuret y se esper hasta
desarrollo de color. La absorbancia a 540 nm fue de 0,221 en un tubo de 1 cm
de dimetro. A 0,3 mL de una solucin standard (5 mg de protena/mL), se le
agregaron 0,7 mL de agua y 4,0 mL de reactivo de Biuret. Esta mezcla dio
como resultado una absorbancia de 0,161 en un tubo de iguales
caractersticas. El blanco de reactivo fue 0,041. a) Calcular la concentracin de
1

protena en la solucin desconocida. b) Si empleara 0,5 mL de la misma

muestra, qu volumen de agua y de reactivo de Biuret debera agregar?
Qu absorbancia obtendra?
9) El cido pirvico puede determinarse colorimtricamente por conversin en
su 2,4 dinitrofenilhidrazona. Se realiz una curva de calibracin con diversas
cantidades de cido pirvico, obtenindose los siguientes resultados:
Acido pirvico (g)
Lecturas

20

40

60

80

100

125

150

0,175 0,302 0,435 0,560 0,673 0,795 0,900

Fue analizado un blanco de reactivo por triplicado dando respectivamente:

0,040, 0,050 y 0,045. Se analizaron tres soluciones desconocidas de cido
pirvico que dieron las siguientes lecturas de absorbancia: a) 0,280; b) 0,555 y
c) 0,919. Qu concentracin de cido pirvico tienen dichas soluciones si el
volumen de muestra empleado fue 3 mL?
10) Disee un protocolo de laboratorio para realizar una curva de calibracin
para determinar concentracin de protena empleando la tcnica del Biuret
descripta en el problema 8 teniendo en cuenta que este mtodo posee un
rango de sensibilidad entre 1 y 2,5 mg mL-1.
RESPUESTAS
1) 0,026 mM
2) 0,05 mL
0,006
3) 0,5 moles
4) 0,06 10-3, T 99,99 %
0,006 10-3, T 99,99 %
6, T 0,0001%
0,6, T 25 %
5) a) 0,25 b) 0,0625 c) 0,375 d) 0,3375
15,6 M-1 cm-1
6) 1,375- 1,597
7) A 0,013 mM, B 0,011 mM
8) a) 7,5 mg/mL b) 0,5 mL de H2O, 4 mL de rvo de Biuret, A= 0,341
9) a) 12,2 g/mL b) 26,7 g/mL c) fuera de la curva de calibracin.

MATERIAL SUPLEMENTARIO
El espectrofotmetro convencional

Un espectrofotmetro convencional enfoca la luz policromtica de la fuente en

un monocromador. Este tiene como componentes principales una ranura de
entrada, un elemento que dispersa la luz en sus longitudes de onda
componentes (en general una red de difraccin), y una ranura de salida que
permite seleccionar la longitud de onda deseada.
Esa luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector. Las
mediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin entre la potencia de
luz que alcanza al detector cuando est interpuesta la muestra (P) y cuando no
lo est (P0) o cuando est interpuesto un blanco.
La transmitancia se define como

T = P / P0
y la absorbancia como

A = - log T = - log P / P0
La base de la espectrometra de absorcin y su uso para el anlisis
cuantitativo est dada por la relacin conocida como ley de Beer:

A = a . b. C
Donde

a es la absortividad, un coeficiente caracterstico de la sustancia absorbente

a cada longitud de onda,

b es la longitud del camino ptico (distancia que atraviesa la luz dentro de la

muestra), y

C es la concentracin de la sustancia absorbente.

En realidad el monocromador no selecciona una nica longitud de onda, sino
un rango, cuya amplitud depende de la calidad (resolucin) del mismo. Esta
resolucin depende fundamentalmente del diseo (montaje) del
monocromador, de su distancia focal y de las dimensiones y densidad de
lneas en la red de difraccin.
Para cambiar la longitud de onda de medicin, o para hacer un barrido
espectral, se mueve el elemento dispersor o algn espejo por medio de un
motor por pasos.
3

Algunos espectros de absorcin