BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

1)

Alat
1. Beaker glass
2. Batang pengaduk
3. Tabung Reaksi
4. Cawan Petri
5. Pembakar Bunsen
6. Timbangan Analitik
1. Wrap
2. Kapas
3. Plastic wrapping
4. Alumunium foil
5. Vortex mixer
6. Cutton bud
7. Jarum transfer
8. Incubator

2)

Bahan
1. Aquadest
2. Alkohol
3. Media agar
4. Kotoran di Telinga

3.2 Prosedur Kerja

3.2 Pembuatan Media Pertumbuhan
3.2.1 Cara Kerja
1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan.
2. Dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
3. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk
4. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media
tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih) Perhatian :pada
saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!
5. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet
volume
6. Sebelum diautoklaf,tuangkan NB ke dalam tabung reaksi
7. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf
selama 15 menit, tekanan 1 atm 121oC.
8. Setelah di autoclaf media dalam tabung reaksi biarkan memadat dengan menaruhnya
secara tegak pada rak tabung, untuk media miring dimiringkan jangan sampai agar
menyentuh mulut tabung
9. Media NB dibiarkan dingin
3.3 Sterilisasi

3.3.1 Prosedur Kerja

1. Sistem Basah
a. Sistem basah dengan udara bertekanan
1) Mengisi autoklaf dengan akuades hingga pemanasnya terendam semua.
2) Memasukkan alat atau media
3) Menutup pintu autoklaf dan kencangkan baut.
4) Pengatur tekanan udara ditutup.
5) (setelah mendidih) pengatur tekanan udara dibuka.
6) (bila asap habis) menutup tekanan udaranya dan biarkan samapi jarum menunjukkan
angka 1,5 kg f/cm2 dan konstan (bila lebih buka pengatur takanan udara kembali).
7) Konstan angaka 1,5 kg f/cm2 selama 15 menit.
8) Membuka pengatur udaranya sehingga jarum turun.
9) Bila angka 0 buka tutup autoklafnya.
b. Sistem basah dengan diusap memakai alcohol/spritus dan dibakar (untuk alat
gelas/porselin).
1) Menyiapkan alat gelas/porselin

2) Mengusapkannya dengan alcohol/spritus.

3) Dibakar.
2. Sistem Kering
a. Sistem kering dengan udara panas
1) Menghidupkan oven/incubator.
2) Mengatur temperature pada suhu 105 derajat C.
3) Membungkus alat yang akan disterilkan dengan kertas.
4) (bila temperature sudah 105 derajat C) masukkan alat.
5) Mengoven selama 60 menit.
b. Sistem kering langsung api
1) Menyiapkan alat logam.
2) Dipijarkan
3.4 Teknik Aseptik
3.4.1 Prosedur Kerja
a. Metode aseptis sebelum bekerja di laboratorium
1. Sebelum melakukan peraktik, cuci tangan terlebih dahulu menggunakan sabun
kemudian bilashinggabersih.
2. Kemudian semprotkan alkohol 75% pada telapak tangan.
3. Semprotkan alkohol 75% pada meja kerja praktikum.
b. Metode aseptis untuk pemindahan biakan
1. Kocoklah tabung dengan gerakan kesamping sehingga diperoleh suspensi yang rata.
Hindari terbasahinya sumbat oleh biakan
2. Pijarkan seluruh kawat lup inokulasi lewatkan juga tangkainya diatas api.
3. Angkat sumbat tabung dan panaskan mulut tabung. Jangan letakan sumbat tambung
diatas meja agar tidak tercemar
4. Setelah lup dibiarkan mendingin sekurang-kurangnya 5 detik. Ambilah 1 lup suspensi
oganisme. Usahakan agar lup tidak menyetuh tabung.
5. Panaskan kembali mulut tabung.
6. Setelah disumbat letakan tabung dirak tabung.
7. Letakan suspensi mikroorganisme yang ada pada lup ketengah kaca objek yang
bersih.
8. Pijarkan kembali lup sebelum digunakan lagi.
3.5 Metode Pembiakan
3.5.1 Prosedur Kerja
Penanaman Bakteri (Metode tuang)
1. Siapkan alat dan bahan yang sudah disterilisasikan.
2. Dimasukkan sampel sebanyak 1mL dari tabung reaksi.
3. Masukkan media NA sebanyak 15 20 mL.
4. Media NA yang sudah berada di cawan petri digoyangkan membentuk angka 8 untuk
meratakan dan memadatkan.
5. Dinginkan sampai media memadat.
6. Setelah memadat, balik cawan petri agar uap air tidak mengenai media.

7. Bungkus dengan kertas coklat dan beri label.

8. Simpan dalam inkubtor selama 24 jam pada suhu 370C.
3.6 Teknik Isolasi
a. Spread Plate Method(Cara Tebar/Sebar)
1.Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
2.Pipet volume,
3. lampu bunsen
4.Media NA dalam cawan petri
5.Kultur murni bakteri
6.Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)
a.
1.
2.
3.
4.
5.
3.6.1

Pour PlateMethod(Cara Tabur)

Media NA dalam tabung reaksi
Cawan petri steril
Kultur murni bakteri
Pipet volume,
lampu bunsen
Prosedur Kerja

Cara Goresan (streak plate method)

1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan
ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan
petri.
2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai
pada satu ujung.
3. Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores
ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
4. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu
dan biarkan dingin.
5. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati
pertumbuhannya.

b.

Spread
Tebar/Sebar)

PlateMethod(Cara

1.Buatlah pengenceran 10-110-6dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.

2.Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher
tabung.
3.Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan
petri.
4.Bakar spreaderyang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.
5.Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreadersecara merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering.
6.Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24
jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

c. Pour PlateMethod(Cara Tabur)

1.Dinginkan mediaNA dalam tabung reaksi sampai suhu 45 - 50 0C (cirinya : terasa
hangat di kulit/tidak kemranyas).
2.Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.
3.Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi
yang mengandung NA secara aseptis.
4.Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung
kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.

5.Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NAsampai

homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa
diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api
6.Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi
terbalik dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.

3.7 Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan Sederhana
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades
pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes
6.
Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7.
Dicuci dengan air mengalir
8.
Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9.
Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
Pewarnaan Negatif
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades
pada preparat glass menggunakan jarum ose

3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes
6.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7.
Dicuci dengan air mengalir
8.
Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9.
Diamati dibawah mikroskop
Pewarnaan Gram
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades
pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit
6.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7.
Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
8.
Diteteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air
mengalir dan diangin keringkan
9.
Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dicuci dengan air
mengalir dan dikering anginkan
10. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit
11. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
12. Diamati dibawah mikroskop
Pewarnaan Spora
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades
pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass
4.
Ditutup dengan kertas saring
5.
Diteteskan malachite green kemudian difiksasi
6.
Didiamkan selama 5 menit dan dibuang kertas saring
7.
Dibilas dengan air mengalir dan kemudian dianginkan
8.
Diteteskan safranin dan dikeringkan tanpa fiksasi
9.
Diamati dibawah mikroskop