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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECNCAVO DA BAHIA

CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS, AMBIENTAIS E BIOLGICAS


CCA 025 MICROBIOLOGIA GERAL

Microbiologia Geral
Prticas de Laboratrio

Cruz das Almas Bahia

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECNCAVO DA BAHIA


CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS, AMBIENTAIS E
BIOLGICAS
CCA 025 MICROBIOLOGIA GERAL

Microbiologia Geral
Prticas de Laboratrio

Ana Cristina Fermino


Carla da Silva Sousa
Josilda Cavalcante
Lydice Meira Haddad
Patrcia Lopes Leal

Aluno: -------------------------------------------------------------------------------

Cruz das Almas - Bahia

SUMRIO

Assunto

Pgina

Equipamentos e vidrarias------------------------------------------------------------------------

Presena de microrganismos no ambiente--------------------------------------------------

Tipos e preparo de meios de cultura----------------------------------------------------------

11

Mtodos qumicos e fsicos de controle do crescimento microbiano------------------

14

Isolamento de fungos, bactrias e actinomicetos do solo--------------------------------

17

Cultura pura: purificao e conservao de culturas--------------------------------------

21

Preparaes e observaes microscpicas a fresco, fixadas e coradas


(colorao Gram).----------------------------------------------------------------------------------

24

Isolamento de fungos de plantas com sintoma de doena------------------------------

27

Preparaes e Observaes Microscpicas de Fungos---------------------------------

29

Caracterizao fisiolgica de micro-organismos e testes de antibiose---------------

31

Colorao de razes (colonizao micorrzica) e extrao de esporos---------------

36

NORMAS PARA USO DO LABORATRIO DURANTE AS AULAS


PRTICAS

USO OBRIGATRIO do jaleco durante as aulas prticas e, tambm, o uso de


sapatos fechados e calas compridas;

No laboratrio existem trabalhos de teses de alunos em andamento, desta forma


PROIBIDO mexer nos materiais do laboratrio, concentre apenas na sua aula;

Na bancada de trabalho no deve haver acmulo de objetos e materiais, bem como,


bolsas e mochilas;

Aps o trabalho prtico deixar a bancada em ordem;

Cada aluno deve trazer para as aulas: isqueiro, caneta rde marcao de vidrarias
para identificao de materiais, etc;

Todo material utilizado (placas de Petri, tubos, etc) deve ser devidamente
identificado, para observaes posteriores;

Sempre lavar as mos APS o trabalho prtico;

Em caso algum acidente, avisar imediatamente o professor.

EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS

EQUIPAMENTOS

Cmara de Fluxo Laminar

Estufa de secagem e esterilizao

Estufa de crescimento tipo


B.O.D.

Microscpio

Autoclave

VIDRARIAS

Balo volumtrico

Placa de Petri

Graduada

Proveta

Pipeta

Pipeta

Pissete

Erlenmeyer

Volumtrica

Tubo de Ensaio

Estante para tubos de ensaio


Becker

Esptula
Funil

Vidro de relgio

Basto de vidro

Lamparina

Ala de platina

Pra

Ala de Drigalski

Lmina e lamnula

Pipeta de Paster

EQUIPAMENTOS
Centrfuga: utilizada para acelerar o processo de decantao devido ao movimento de rotao, que
arremessa as partculas de maior densidade, por inrcia, para o fundo do tubo.
Estufa: utilizada para esterilizaes a seco (no a vapor), demora mais do que a autoclave para esterilizar.
Esterilizao de vidrarias 2 horas a 180C
Autoclave: utilizado para esterilizaes a vapor sob presso, o meio mais rpido de esterilizao. Preparo
de meio de cultura (30 minutos) e esterilizao de material (20 minutos).
Cmara de exausto: utilizada para o manuseio de reagentes e preparo de solues, principalmente
aqueles que liberam gases txicos.
Microscpio: utilizado para observao microscpica de materiais biolgicos.
Estufa incubadora de crescimento tipo B.O.D.: utilizada para a incubao de microrganismos sob
condies controladas de umidade, temperatura e luminosidade.
Cmara de fluxo laminar: utilizada para criar ambientes limpos permitindo o manuseio de microrganismos
em condies asspticas.
VIDRARIAS:
Tubo de ensaio: utilizado para efetuar reaes qumicas em anlise qualitativa, com pequenas pores de
reagentes.
Becker: utilizado para efetuar reaes qumicas com pores maiores de reagentes, recolher filtrados, fazer
decantaes, preparar solues. Sua capacidade varivel, podendo ser graduado ou no.
Erlenmeyer: utilizado para efetuar reaes qumicas principalmente em anlise volumtrica. Devido ao seu
formato, facilita a agitao sem perda de reagente.
Balo volumtrico: utilizado em medies mais precisas de volumes lquidos.
Proveta: utilizada em medies aproximadas de volumes lquidos. Uma proveta poder medir vrias
alquotas (pores).
Pipeta: utilizada para medir volumes menores e mais acurados, se apresentam em dois tipos:
1. Graduadas: Apresentam escala de volume, podendo medir vrias alquotas.
2. Volumtricas: Apresentam aferio nica, e medem volumes com maior preciso.
Funil: utilizado em filtraes simples e na transferncia de lquidos de um recipiente para outro.
Vidro de relgio: utilizado para pesagens de reagentes (slidos), para cobrir becker com solues e para
evaporar lquidos.
Pissete: utilizado para lavagem de precipitado, cristais, recipientes e para completar e aferir volumes.
7

Basto de vidro: utilizado para auxiliar na dissoluo de reagentes, agitaes e na transferncia de um


lquido de um recipiente para outro, evitando perdas.
Esptula de pesagem: utilizado na pesagem de substncias slidas.
Funil de vidro: utilizado para realizar operaes de filtrao, ou para transferir lquidos entre recipientes.
Pipetadores automticos e pra de borracha: utilizado para aspirar solues atravs das pipetas
graduadas e volumtricas.
Ala de platina: utilizada na repicagem de microrganismos em meio de cultura.
Ala de Drigalski: utilizada para facilitar a distribuio uniforme de microrganismos em meio de cultura.
Pipeta de Paster: um tubo de vidro de ponta bastante afilada que, enchendo-se por suco, serve para
transvasar lquidos.
Placas de Petri: so utilizadas para o cultivo de microrganismos.

PRESENA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE


INTRODUO
Os microrganismos so minsculos seres vivos, individualmente muito pequenos para serem vistos a
olho nu. O grupo inclui bactrias, fungos, protozorios e algas microscpicas. Os microrganismos so
encontrados em qualquer ambiente, em suspenso ou assentados com a poeira em vrias superfcies. Embora
a tendncia de associar os microrganismos a doenas graves, infeces desagradveis e a inconvenincias
mais comuns, como comida estragada, esses pequenos seres vivos so em sua maioria incuos ou benficos,
contribuindo de forma crucial para a manuteno do equilbrio entre os organismos vivos e os compostos
qumicos do nosso ambiente. Nos ambientes aquticos, os microrganismos constituem a base da cadeia
alimentar. No solo, eles auxiliam na ciclagem dos nutrientes e na degradao de compostos poluentes. O
homem e muitos animais dependem dos microrganismos em seus intestinos para a digesto e sntese de
muitos alimentos. Alm disso, os microrganismos possuem aplicaes comerciais participando da sntese de
produtos qumicos, tais como acetona, enzimas, drogas. A indstria de alimentos tambm inclui os
microrganismos na produo de vinagre, picles, bebidas alcolicas dentre outros produtos. O microbiologista
deve estar apto a estimular e otimizar o desenvolvimento dos microrganismos benficos e combater aqueles
que causam doenas ou deterioram os alimentos e o ambiente.
Nesta aula, o aluno dever conhecer as normas bsicas, os materiais e equipamentos necessrios ao
Laboratrio de Microbiologia. Ter a oportunidade de verificar a presena de microrganismos no ambiente,
justificando na prtica a importncia das normas propostas.
OBJETIVOS:
1. Reconhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratrio de Microbiologia;
2. Demonstrar a presena de microrganismos no ambiente
MATERIAIS:
Meios: Agar nutriente e BDA (batata-gar-dextrose)
Utenslios: placa de Petri, swabe e bico de Bunsen.
PROCEDIMENTO:
1. Exponha uma placa a uma condio de inoculao de sua preferncia:
Ar Deixe a placa exposta ao ar, por 15 minutos ou a coloque sobre o parapeito da janela e levante a
poeira com uma folha de papel.

Pele ou cabelo Passe os dedos em vrios pontos da superfcie do meio de cultura na placa ou coloque
um fio de cabelo sobre a superfcie do meio de cultura.
Respirao Inocule a placa tossindo, assoprando ou espirrando diretamente sobre o meio de cultura.
2. Abra uma placa na proximidade da chama do bico de Bunsen e permanea por 1 minuto.
3. Uma placa permanecer fechada e ser utilizada como controle para os procedimentos anteriores.
4. As placas devero ser identificadas com iniciais do aluno, data e turma prtica.
RESULTADOS:
Enumere e caracterize (cor, tamanho e forma) as colnias que cresceram na superfcie das placas
comparando-as com a placa controle e com a placa aberta prxima ao bico de Bunsen.

Ensaio

Controle

Bico de Bunsen

10

TIPOS E PREPARO DE MEIOS DE CULTURA


INTRODUO
Os meios de cultura so associaes quantitativas e qualitativas de substancias de
contem os nutrientes necessrios alm das condies de oxignio, pH, temperatura e
presso osmtica adequadas para o crescimento dos microrganismos.
Os meios de cultura devem ser preparados com gua destilada, aquecidos at que se
dissolvam completamente e em seguida esterilizados por autoclavagem a 121C.
TIPOS DE MEIO DE CULTURA
1. Quanto ao estado fsico:
Slidos contm agentes solidificantes que corresponde entre 1 a 2%;
Semi-slidos contm agentes solidificantes que corresponde a 0,075 a 0,5% da
composio do meio;
Lquidos no contem agentes solidificantes.

2. Quanto a finalidade:
Meios de pr-enriquecimento - so aqueles que permitem a dessensibilizao de
microrganismos injuriados.
Meios de enriquecimento so aqueles que proporcionam nutrientes adequados ao
crescimento de microrganismos presentes em baixos nmeros ou de crescimento lento,
bem como microrganismos exigentes e fastidiosos.
Diferenciais

so

aqueles

que

contm

substncias

que

permitem

diferenciar

microrganismos muito parecidos.


Seletivos so aqueles que contm substncias que inibem o desenvolvimento de
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros.
Meios de triagem so meios que avaliam determinadas atividades metablicas
permitindo

caracterizao

identificao

perfunctria

ou

presuntiva

de

muitos

microrganismos.

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Identificao so aqueles utilizados para a realizao de provas bioqumicas e


verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos a identificao.
Dosagem so aqueles empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e
aminocidos.
Contagem so aqueles empregados para a determinao quantitativa da populao
microbiana.
Estocagem ou manuteno so aqueles utilizados para conservao de microrganismos
no laboratrio, garantindo sua viabilidade.

Funo de alguns componentes do meio de cultura


Extrato de carne serve como fonte de carbono orgnico, nitrognio, vitaminas e sais
minerais.
Peptona serve como fonte de nitrognio.
Dextrose serve como fonte de carbono
Agar serve para solidificao do meio, no sendo metabolizado pelos microrganismos.
Meio de cultura slido
O crescimento dos microrganismos paralisado por exausto de nutrientes;
necessria a transferncia das colnias para outro meio;
Permite a individualizao de colnias;
Meio de cultura liquido
Permite melhor difuso e obteno de metablitos produzidos pelos microrganismos.
No permite individualizao de colnias

PREPARO DO MEIO DE CULTURA


BDA (batata-dextrose-gar)
Batata............................100 g
Dextrose........................10g
Agar...............................7,5g
Procedimento:
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1. Cozinhar 100g de batata cortada em rodelas em 250 ml de gua destilada;


2. Coar e transferir os 250 ml do caldo de batata para uma proveta e completar para 500
ml com gua destilada;
3. Transferir para becker e acrescentar os 10g de dextrose;
4. Transferir para um erlenmeyer contendo os 7,5g do agar.
5. Autoclavar a 121C por 30 minutos.
Agar nutriente
Peptona..........................1,25g
Extrato de carne.............0,75g
gar................................4g
gua destilada................250ml
Procedimento:
1. Medir o volume da gua destilada em uma proveta e transferir para bquer;
2. Acrescentar os reagentes e homogeneizar com basto de vidro at a completa
dissoluo;
3. Transferir para um erlenmeyer contendo os 4g do agar.
4. Autoclavar a 121C por 30 minutos.
Observaes:
O erlenmeyer a ser utilizado para autoclavagem do meio dever sempre ter a capacidade
correspondente ao dobro da quantidade de meio a ser preparado;
O gar dever ser pesado diretamente no erlenmeyer a ser utilizado para autoclavagem do
meio, para evitar desperdcio do mesmo, uma vez que este componente somente solvel
a 60C

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MTODOS QUMICOS E FSICOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Mtodos fsicos de controle do crescimento microbiano


Calor seco a esterilizao com ar quente que necessita de uma temperatura de 170C
por 2 horas para oxidao das molculas microbianas.
Calor mido Provoca a desnaturao das protenas, matando os patgenos bacterianos
e fungos, e quase todos os vrus dentro de 10 minutos, embora seja menos efetivo em
esporos.
Pasteurizao a esterilizao utilizando calor (72C por 2 horas) para causar a
desnaturao de protenas de microrganismos presentes principalmente no leite e bebidas
alcolicas.

Calor mido (autoclave)

Calor seco (estufa)

Radiao ionizante (irradiador)

Radiao no ionizante (Cmara


fluxo laminar)

Filtrao

Liofilizao (liofilizador)

Refrigerao a esterilizao utilizando baixa temperatura (5C) para causar reduo


das reaes qumicas e possveis alteraes nas protenas. Tem efeito bacteriosttico, ou
seja, no mata os microrganismos apenas inibe sua multiplicao.

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Filtrao a esterilizao utilizando membranas que permitem a separao de bactrias


de um lquido ou gs.
Liofilizao Neste mtodo, a gua removida por alto vcuo em baixa temperatura
proporcionando a conservao prolongada de culturas microbianas por reduzir as reaes
qumicas e possveis alteraes de protenas.
Radiao Pode ser ionizante, em que a esterilizao ocorre atravs da utilizao de
raios gama e feixe de eltrons de alta energia que destroem o DNA ou no ionizante, em
que ocorre a leso do DNA atravs da utilizao de luz ultravioleta com lmpada UV.
Mtodos qumicos de controle do crescimento microbiano
Halognios Atuam inibindo a funo das protenas (iodo) ou altera os componentes
celulares (cloro).
Fenol e compostos fenlicos - Atuam na ruptura da membrana plasmtica, desnaturao
de protenas e desativao de enzimas.
lcoois Atuam na desnaturao de protenas e dissoluo dos lipdeos. bactericida e
fungicida, no sendo efetivo contra esporos ou vrus no envelopados.
Agentes de superfcie Atuam na inativao ou ruptura das enzimas (detergentes
aninicos) ou na inibio de enzimas,desnaturao das protenas e ruptura das
membranas plasmticas. So bactericidas, bacteriostticos, fungicidas e viricidas contra
vrus envelopados.
cidos Orgnicos Atuam na inibio metablica,sendo a sua ao no relacionada
sua acidez afetando principalmente os bolores.
Aldedos Atuam na desnaturao das protenas.
Peroxignios Possuem ao oxidante, sendo muito efetivos contra os microrganismos
anaerbios sensveis ao oxignio.

Sabonetes
antimicrobianos

Mertiolate

Cloro
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Enxaguante bucal

lcool 70%

Iodo

Avaliao da eficincia de antissepticos


Material necessrio:
1. Placas com meio de cultura agar nutriente;
2. Antisspticos (lcool 70%, hipoclorito de sdio 1%, enxaguante bucal PLAX, mertiolate,
iodo e sabonete PROTEX);
3. Algodo.
Procedimento:
1.

Colocar a digital em contato com o meio agar nutriente;

2.

Escolher um antissptico para esterilizar a digital e novamente colocar em contato

com o meio agar nutriente.

Digital

Antissptico

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ISOLAMENTO DE FUNGOS, BACTRIAS E ACTINOMICETOS DO SOLO


INTRODUO
Isolar significa separar um tipo de microrganismo a partir de uma populao que o contm. Em habitats
naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um nico tipo de microrganismo),
portanto faz-se necessrio um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de
microrganismos presentes.
O isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos esto numa
proporo adequada. Quando o microrganismo que se deseja isolar se encontra em pequena quantidade,
realizado o procedimento chamado enriquecimento que significa elevar a quantidade do microrganismo de
interesse com relao ao restante da populao. Posteriormente se isola empregando o mtodo de isolamento
por estrias ou por diluio, para posterior identificao.
Uma vez que o nmero de bactrias de uma dada amostra muito grande, torna-se necessrio diluir a
amostra inicial e posteriormente semear um dado volume da amostra diluda em meio de Agar Nutriente, ou
outro meio de cultura geral escolha.
DILUIO SERIADA
Material necessrio:
Erlenmyer contendo 90 ml de soluo salina a 0,85%
Tubos de ensaio contendo 9 ml de soluo salina a 0,85%
Alas de Drigalski
Pipetas automticas de 1 ml e 50 l
Ponteiras das pipetas
Placas contendo meio Agar nutriente
Placas contendo meio Amido Casena
Amostras de solo rizosfrico
Vortex

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Pprocedimento:
- Pese 10 g de amostra de solo rizosferico, e transfera para Erlenmyer contendo 90 mL de soluo salina NaCl
(0,85%). Agite o Erlenmyer da amostra a analisar, de modo a misturar bem os possveis microrganismos que a
se encontram.
- 1 tubo: Retire 1ml desta amostra e transfira para o 1 tubo contendo 9 ml de soluo salina. NaCl (0,85%).
Misture bem utilizando o vortex. Este ser o tubo de diluio 1: 10.Escreva no tubo a sua diluio. Pipete deste
tubo 100l para uma placa de Petri contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra
inoculada. Em seguida espalhe bem a soluo com auxlio da ala de Drigalski.
- 2 tubo: Retire 1 ml do 1 tubo e transfira para o 2 tubo de diluio, utilizando outra ponteira. Misture bem e
identifique o tubo com a diluio correspondente 1:100. Pipete deste tubo 100l para uma nova placa de Petri
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a
soluo com auxlio da ala de Drigalski.
- 3 tubo: Retire 1ml do 2 tubo de diluio e transfira para o 3 tubo de diluio. Proceda da mesma forma que
anteriormente, identificando o tubo como de diluio 1:1000. Pipete deste tubo 100l para uma placa de Petri
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a
soluo com auxlio da ala de Drigalski.

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TCNICAS DE SEMEADURA
Podem ser utilizadas duas tcnicas de sementeira distintas, de modo a atingir o objetivo de estimar o
nmero de microrganismos na amostra diluda. Uma das tcnicas designa-se por Sementeira por
Espalhamento (Spread Plate), em que um volume de 1ml ou 0.1ml da amostra pipetado e espalhado na
superfcie do meio de cultura slido com auxlio de uma ala de Drigalski.
A segunda tcnica, designada por Sementeira por incorporao (Pour plate) consiste na mistura de 1
ou 0.1ml da amostra diluda com o meio de cultura ainda no estado lquido. Aps o perodo de incubao,
quando se deseja realizar a contagem do nmero de unidades formadas de colnia (UFC), o ideal que a
placa apresente de 25 a 250-300 colnias.

Alguns procedimentos so indispensveis para deteco e quantificao de diferentes microrganismos.


Estas tcnicas consistem de regras de assepsia e segurana para evitar a contaminao dos meios de cultura
com microrganismos do ambiente; para obter culturas puras; para evitar acidentes laboratoriais.
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1. A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto,
devem ser aquecidos no bico de Bunsen. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma
faa um ngulo de 45 em relao mesa de trabalho.
2. Antes de retirar o material para a elaborao do esfregao ou para semeadura deve-se esfriar a ala
na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri.
3. Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a
retirada do tampo de algodo. Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est
segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar
o tampo de algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada.
4. As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar contaminao com
germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em B.O.D. com tampa voltada para
baixo.

20

CULTURA PURA: PURIFICAO E CONSERVAO DE CULTURAS

PURIFICAO DAS COLNIAS


CULTURA PURA: Quando uma colnia isolada transferida para um novo meio, as clulas se multipliquem
livres de outras espcies de microrganismos.
COLNIA: agregado de clulas idnticas.
- OBTENO DE CULTURAS PURAS
METODO DO ESGOTAMENTO DO INCULO EM SUPERFCIE DE MEIO SLIDO:
Estrias Simples
1. Esterilize a ala de repicagem em Bico de Bunsen. Resfrie e colete uma pequena poro da
suspenso contendo populaes microbianas mistas.
2. Transfira assepticamente a suspenso microbiana contida na ala de repicagem para a superfcie do
meio. Espalhe vigorasamente o inculo contido na ala de repicagem sobre a superfcie do meio
fazendo movimentos em zig zag:

Estrias Compostas
Divida a placa em 4 quadrantes. Espalhe o inculo no 1 quadrante, esgotando com a ala de
repicagem, fazendo-se movimento de zig-zag. Flambe novamente a ala e esfrie encostando a ala de
repicagem na superfcie do gar. Gire a placa 90 graus, toque a ala no canto da estria do 1 quadrante e
deslize vrias vezes, repedindo o movimento de zig-zag at o outro extremo do 2 quadrante da placa. Repita a
operao no 3 e 4 quadrantes.

21

Tcnicas de armazenamento de microrganismos


Armazenamento por at 1 ms
Repicar o microrganismos em placas de Petri, contendo meio espcifico. Cultivar na temperatura e perodo
adequado para cada espcie, vedar a placa com filme PVC. Manter no refrigerador a 4C. Esta tcnica
indicada para fungos e bactrias.
Armazenamento por at 1 ano
Repicar o microrganismo em microtubos hermeticamente fechados e em frascos (tampados com rolha de
borracha) contendo 2/3 do volume com meio de cultura. Deve-se evitar o ressecamento do meio. Manter no
refrigerador a 4C. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias. Da mesma maneira, podem ser usados
tubos de ensaio com meio de cultura inclinado e vedados com rolhas ou filme PVC.
Armazenamento de 1 a 4 anos
leo mineral
Adicionar leo mineral sobre microrganismos cultivadas sobre meio slido inclinado, descritos anteriormente e
mant-los a temperatura ambiente. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias.
Mtodo de Castelani
Nesta metodologia, o microrganismo deve ser cultivado em meio slido e posteriormente, fragmentos do meio
de cultura contendo pedaos da colnia devem ser retirados e colocados em frascos contendo gua
esterilizada. Manter em temperatura ambiente.
Congelamento
As culturas tambm podem ser armazenadas por perodos mais longos em congeladores (freezers) 80C. Os
isolados devem ser cultivados em meio lquido, suplementado com o crioprotetor e amostras devem ser
distribudas em tubos criognicos, a fim de evitar que, durante o congelamento, ocorra danos estrutura das
clulas e conseqente comprometimento da viabilidade das mesmas. Para crioproteo, a cultura microbiana
22

deve ser suplementada com 7-8% de dimetilsulfxido (DMSO) ou 15-25% de glicerol antes do congelamento a
-80C. Para o armazenamento a -20C, devem ser utilizadas concentraes de 40-50% de glicerol.
Armazenamento por 1 a mais de 4 anos
Liofilizao
As clulas microbianas so liofilizadas, mantendo a viabilidade por longos perodos. Manter no refrigerador a
4C.
Slica
Faz-se uma suspenso de esporos em uma soluo de leite (5%). 100 l da suspenso so adicionados a um
tubo (2 ml) mantida a 0C (no gelo) contendo slica previamente esterilizada. Manter no refrigerador a 4C ou
temperatura ambiente.

23

PREPARAES E OBSERVAES MICROSCPICAS A FRESCO, FIXADAS E CORADAS


(COLORAO GRAM).
Introduo
A visualizao de bactrias, fungos, leveduras s possvel com auxlio de microscpios ticos, que so
instrumentos capazes de ampliar o tamanho de estruturas pequenas (impossvel de visualizar a olho nu) atravs de um
conjunto de lentes. Existem duas tcnicas que permitem a preparao de material para observao de clulas com
auxlio do microscpio tico. A primeira, preparao microscpica a fresco, a suspenso dos micro-organismos pode ser
examinada viva com auxlio ou no de corantes vitais, ideal para observar viabilidade, motilidade, tamanho e forma
natural. Na outra, preparao microscpica fixada, a camada de suspenso dos micro-organismos fixada pelo calor e
corada com corantes especficos, para visualiz-los e diferenci-los em grupos para estudos. As preparaes fixadas
podem ser ainda utilizadas para colorao simples, que usa um nico corante, til para visualizar forma e arranjo e,
tambm para a colorao diferencial que utiliza mais de um corante e reagentes qumicos, que permitem visualizaes
de flagelos, cpsulas, esporos e a separao dos micro-organismos em grupos. A colorao diferencial mais importante
a colorao de Gram, que separa as bactrias em dois grupos: Gram-positivo e Gram-negativo, importante para
classificao e identificao das bactrias.
Objetivo
Preparar lminas a fresco e fixadas. Realizar a colorao de Gram para diferenciar as bactrias em dois
grandes grupos. Observar as formas, arranjos, cor, tamanho das clulas dos micro-organismos.
Material
Micro-organismos: cultura de bactrias, leveduras
Solues: gua, fucsina ou safranina, cristal violeta, lugol (soluo de iodo), lcool
Equipamento e utenslios: microscpio tico, lminas, lamnulas, ala de repicagem, bico de Bunsen
Procedimento
Uso do Microscpio tico
1. Verifique a voltagem antes de ligar o equipamento;
2. Gire o revlver, colocando em posio a objetiva de menor aumento (4X);
3. Coloque a lmina sobre a platina, com a preparao para cima, e prenda-a com a presilha;
4. Movimente o charriot de modo que o esfregao fique em baixo da objetiva
5. Acenda a luz;
6. Regule a quantidade de luz utilizando o diafragma e o condensador;
7. Com o parafuso macromtrico eleve a platina ate o seu ponto mximo;
8. Olhando pela ocular abaixe lentamente a platina com o parafuso macromtrico at que o material a ser
observado possa ser visualizado;
9. Ajustar o foco apenas com o boto micromtrico;

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10. Encaixe a objetiva de 10X e ajuste o foco novamente, apenas com o boto micromtrico (uma vez que se tenha
obtido o foco com a objetiva de 4X, acertar o foco das outras objetivas, 10 X, 20X, etc apenas com o boto
micromtrico;
11. Antes de encaixar a objetiva de 100X (objetiva de imerso) colocar uma gota de leo de imerso sobre o
esfregao e encaixar a objetiva. Aps a adio do leo de imerso no voltar para a objetiva de 40 X;
12. Aps o trmino das observaes, retirar a lmina, desligar a lmpada, girar o revolver e encaixar a objetiva de
4X, baixar a platina e limpar a objetiva de imerso, cuidadosamente.

Preparaes Microscpicas a Fresco:


1. Sobre a lmina limpa e seca, coloque uma gota do material a ser examinado;
2. Cubra a gota com a lamnula encostando um dos bordos da lamnula na gota, deixando descer suavemente,
evitando a formao de bolhas de ar entre a lmina e a lamnula;
3. Focalize no microscpio e observe o material.
Preparaes microscpicas fixadas:
1. Pegue uma lmina limpa e seca e flambe-a com o bico de Bunsen e deixe esfriar;
2. Transfira, assepticamente, com auxilio da ala de repicagem e bico de bunsen, uma gota da cultura de bactrias
em meio lquido ou raspe, levemente, a superfcie do Agar caso a cultura esteja em meio slido, transfira sobre
a lmina j contendo uma gota dgua;
3. Esfregue com movimentos circulares a suspenso, apenas na rea central da lmina;
4. Deixe secar ao ar;
5. Fixe o esfregao, passando a lmina 3 vezes acima da chama do bico de Bunsen (o lado do esfregao fica para
cima), deixe esfriar;
6. Faa a colorao do material com o corante especfico;
7. Lave o esfregao com gua;
8. Seque ao ar;
9. Focalize no microscpio e observe o material.

Colorao Diferencial: Colorao de Gram:


1. Prepare um esfregao, transferindo assepticamente uma poro da cultura da bactria em meio slido para uma
lmina contendo uma gota dgua destilada. Utilizando a ala de repicagem faa movimentos circulares para
formar uma suspenso na rea central da lmina;
2. Fixe o esfregao, passando 3 vezes a lmina sobre o bico de Bunsen. Deixe esfriar;
3. Colorao de Gram: cubra o esfregao com o corante cristal violeta por 1 min, em seguida, com o auxlio da
piseta, lave com gua destilada;
4. Cubra o esfregao com a soluo lugol por 1 min, lave com gua;

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5. Lave a lmina com etanol 95 % rapidamente (at que no se desprenda mais corante do esfregao);
6. Lave o excesso de lcool com gua;
7. Cubra o esfregao com soluo de fucsina, por 30 segundos;
8. Lave a lmina com gua e deixe secar;
9. Faa a observao ao microscpio do material.
Resultados
Desenhe os campos observados, observando forma, tamanho, arranjos.

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ISOLAMENTO DE FUNGOS DE PLANTAS COM SINTOMA DE DOENA


O isolamento de fungos causadores de doenas de plantas uma etapa fundamental para a
identificao e para estudos deste patgeno e da interao planta-patgeno. Atravs da cultura pura pode-se
ter melhor entendimento do patgeno como, requerimentos nutricionais, reproduo, substncias resultantes
do metabolismo e, tambm, a interao do patgeno-planta. Para obter-se a cultura pura do patgeno
necessrio fazer o isolamento a partir de uma amostra com sintoma de doena, podendo ser diretamente a
partir da transferncia de esporos ou miclio para o meio de cultura ou indiretamente, a partir de fragmentos de
tecido foliar contendo estruturas fngicas transferidos para meio de cultura.
Esta aula tem como objetivo o treinamento de tcnicas de isolamento de microrganismos de plantas
com sintomas de doenas.
Isolamento direto:
Procedimento:
1. Recolha, com ala de repicagem, esporos ou miclio de fungos da superfcie da planta com sintomas
de doena;
2. Transfira os esporos para a superfcie do meio BDA em placa de Petri;
3. Incube as placas temperatura ambiente por uma semana.
4. Aps crescimento do microrganismo de interesse, transfira a colnia para um novo meio de cultura e
armazene a sua cultura pura.
Isolamento indireto:
Procedimento:
1. Escolha no material vegetal os locais que apresentam leses recentes, para evitar que organismos
saprfitos dificultem o isolamento do patgeno;
2. Lave o material em gua corrente e seque o mesmo em papel absorvente;
3. Com uma lmina, corte fragmentos de 1 a 3 mm das partes lesadas, tendo cuidado para tambm, incluir
pores saudveis do tecido;
4. Embeba os fragmentos em lcool a 70 % por 30 segundos, para quebrar a tenso superficial e iniciar a
descontaminao superficial do material vegetal;
5. Com o auxlio de uma pina, transfira os fragmentos para uma placa de Petri contendo soluo de
hipoclorito a 1 %, por aproximadamente, 30 segundos;
6. Com pina previamente flambada, retire fragmentos da soluo de hipoclorito, lave-os em gua estril e
seque-os em papel de filtro esterilizado;
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7. Com o auxlio de uma pina, transferia os fragmentos, bem separados, sobre a superfcie do meio BDA
(batata dextrose Agar);
5. Incube as placas temperatura ambiente por uma semana.
6. Aps crescimento do microrganismo de interesse, transfira a colnia para um novo meio de cultura e
armazene a sua cultura pura.

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PREPARAES E OBSERVAES MICROSCPICAS DE FUNGOS

INTRODUO
Os fungos so organismos eucariticos, heterotrficos, aerbios, adaptados a diversos
ambientes. Apesar de abundantes em todo o mundo passam despercebidos em funo do
pequeno tamanho das suas estruturas, sendo notados apenas quando frutificam, a exemplo, os
bolores e os cogumelos. Desempenham papel importante na decomposio da matria orgnica,
na ciclagem de nutrientes, na indstria alimentcia (fermentao, enzimas), na indstria
farmacutica (antibiticos) e so responsveis pela causa de doenas em plantas e seres
humanos. Os fungos podem existir como saprfitas degradando matria orgnica, transformando-a
em formas qumicas simples que retornam ao solo; como parasitas causando doenas em animais
e vegetais e como simbiontes que associam com outros organismos, tal como algas (liquens) e
razes de plantas (micorrizas). A classificao dos fungos baseada em suas estruturas
reprodutoras, como esporos, corpos de frutificao, natureza do ciclo de vida e caractersticas
morfolgicas do seu ciclo de vida. Os fungos formam esporos e produzem hifas que so estruturas
filamentosas e cilndricas que a partir de seu crescimento formam um miclio bem desenvolvido.
Nesta aula voc far observaes microscpicas de alguns fungos, visualizando suas estruturas,
como esporos e hifas.
MATERIAL
Cultura de Penicillium sp., Aspergillus sp., Curvularia sp. , Phyllosticta sp., Trichoderma sp.;
lminas, lamnulas, lactofenol, microscpio tico, ala de repicagem.
PROCEDIMENTO
Preparaes Microscpicas
1. Com o auxlio de uma ala de repicagem, remova uma parte do miclio do fungo em cultura
pura;
2. Transfira a amostra coletada uma lmina contendo 1 gota de azul de lactofenol;
3. Cubra com a lamnula;
4. Observe e desenhe as estruturas dos fungos.

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Esquematize as observaes microscpicas das amostras dos fungos

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CARACTERIZAO FISIOLGICA DE MICRO-ORGANISMOS E TESTES DE ANTIBIOSE

Os sistemas de produo agrcola tm se tornado cada vez mais intensivos e dependentes dos
agroqumicos, o que tem gerado problemas com o desenvolvimento de resistncia dos patgenos aos produtos
utilizados e impactos ambientais negativos devido ao amplo espectro de ao destes produtos, atingindo
organismos no-alvo e causando riscos sade humana e animal. Neste sentido, a utilizao de microorganismos com ao de biocontrole e/ou promoo de crescimento vem sendo apontada como uma
alternativa vivel para sistemas de produo agrcola ecologicamente e economicamente sustentveis.
Dentre as avaliaes realizadas in vitro para a seleo de agentes de controle biolgico e promoo de
crescimento de plantas, caractersticas como atividade antagnica ao patgeno (antibiose), capacidade de
colonizao do sistema radicular, produo de siderforos, enzimas lticas e substncias reguladoras de
crescimento de plantas, entre outros so de fundamental importncia.
Produo de quitinase
Os micro-organismos so multiplicados em meio de sais minerais gar (Tuite, 1969), suplementado com
quitina coloidal, como nica fonte de carbono. As culturas so incubadas em cmara de crescimento tipo
B.O.D., a 282C por dez dias. Aps esse perodo, a atividade quitinoltica dos isolados avaliada pela
formao de um halo hialino em torno das colnias crescidas.
Produo de celulase e xilanase
Os micro-organismos so multiplicados em meio de sais minerais gar (Tuite, 1969), suplementado com
celulose ou xilana, como nica fonte de carbono. Os micro-organismos so incubados em cmara de
crescimento tipo B.O.D., 282C por dez dias. Aps esse perodo, so adicionados 10 mL da soluo de
vermelho congo a 0,5% em cada placa, seguido de incubao a temperatura ambiente por 15 minutos. Aps
esse perodo, drenado o excesso da soluo vermelho congo e adicionados 10 mL da soluo de NaCl (1 M)
em cada placa, seguido de incubao por 30 minutos. Aps ter removido o excesso da soluo, verifica-se a
formao do halo de colorao alaranjada em torno das colnias crescidas, indicando a atividade celuloltica e
xilanoltica dos isolados.

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Produo de lipase
A produo de lpase pelos isolados, avaliada no meio de cultura usando Tween 80 como fonte de carbono.
Os micro-organismos so incubados em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C por dez dias. A
produo da enzima detectada pela formao de um halo branco difuso, constitudo de minsculos
precipitados de oleato de clcio, ao redor das colnias crescidas dos microorganismos.
Produo de amilase
Os micro-organismos so multiplicados no meio de cultura gar amido, constitudo de 0,2% de amido solvel.
Posteriormente, as culturas so incubadas em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C por dez dias.
Aps o crescimento das colnias, foram adicionados 10 mL da soluo de lugol nas placas. A produo da
enzima amilase detectada pela descolorao do meio em torno da colnia, devido hidrlise do amido.

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Solubilizao de fosfato
Os micro-organismos so cultivados em meio de cultura triptocasena de soja, diludo 1/10 e acrescido de
CaHPO4, e as placas incubadas em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C, por dez dias. Aps esse
perodo, a solubilizao de fosfatos detectada pela formao de halo claro em torno das colnias crescidas.

TESTES DE ANTIBIOSE
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Mtodo metablito em meio de cultura


Alquotas de 10 ml de metablitos do micro-organismo antagonista transferida para Erlenmeyers com
capacidade para 250 mL, contendo 90 mL de BDA fundente (aproximadamente 70oC). O meio vertido para
placas de Petri (20 ml/placa), e aps solidificado transferido discos de 0,5 cm de dimetro do fungo
fitopatognico, retirado da borda de cultura com oito dias de cultivo para o centro das placas. A testemunha
consiste de placas de Petri contendo o meio BDA, com o fungo fitopatognico e sem metablitos do microorganismo antagonista. Com auxlio de uma rgua milimetrada, medido o crescimento micelial do fungo
diariamente. Quando o fungo ocupar toda a placa no tratamento testemunha paralisada a medio.

Mtodo do pareamento em risca


O micro-organismo antagonista riscado no centro de uma placa contendo meio BDA. Posteriormente,
adicionado na placa 2 discos de 0,5 cm do fungo fitopatognico, com 8 dias de cultivo. Se for testado como
microrganismo antagonista actinomiceto, a placa dever ser incubada em B.O.D. por 5 dias. Com auxlio de
uma rgua milimetrada, medido o crescimento micelial do fungo diariamente. Quando o fungo ocupar toda a
placa no tratamento testemunha paralisada a medio.

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COLORAO DE RAZES (COLONIZAO MICORRZICA) E EXTRAO DE


ESPOROS
As micorrizas arbusculares (MA) so associaes entre plantas e fungos do solo do filo Glomeromycota.
O benefcio da associao para a planta surge do aumento da extenso da superfcie de absoro e, em troca,
o fungo subsidiado por carboidratos fotoassimilados. A colonizao radicular pelos fungos micorrzicos
arbusculares (FMA) restrita s clulas do crtex, no invadindo o cilindro central, sendo, portanto, incapaz de
causar qualquer dano s razes, caracterizando, deste modo, uma associao simbitica.
Os FMA exercem grande influncia na estruturao das comunidades vegetais, promovendo o aumento
na absoro de nutrientes, tambm aumentam a tolerncia das plantas a doenas radiculares influenciam a
diversidade e a produtividade vegetal, e favorecerem a comunicao de duas ou mais plantas atravs das
hifas fngicas.
Avaliaes da ocorrncia de FMA em solos
Colonizao micorrzica
Razes finas (< 2mm) so lavadas repetidas vezes em gua destilada e, em seguida, imersas em
soluo de KOH 10% + H2O2 (na proporo 1:3) at ficarem claras. Aps esse perodo, so lavadas com gua
corrente, e imersas em soluo de HCl 1% por 3 minutos. Posteriormente, so imersas em soluo de azul de
trypan 0,05% lactoglicerol por 24 h, em temperatura ambiente. Aps este perodo, devem ser conservadas em
lactoglicerol cido, at avaliao. Para avaliao da percentagem de colonizao micorrzica, fragmentos de
razes coradas so transferidos para placa quadriculada (quadrculas de 1,27 cm) e observados em
microscpio estereoscpico (40x), sendo contados 100 segmentos de raiz que fizerem interseo com as
linhas verticais e horizontais e registrando-se o nmero de segmentos colonizados. So considerados
colonizados, os segmentos de razes que apresentarem estruturas tpicas de fungos micorrzicos, tais como
vesculas, arbsculos, hifas e pelotes.

COLORAO DE RAZES (Koske & Gemma, 1989)


Procedimento:
Separar 1 g de razes;
Colocar as razes em mistura KOH 10% + H2O2 10% (proporo 1:3) durante 45 minutos a temperatura
ambiente;
Lavar as razes;
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Colocar as razes em HCl 5% por 5 minutos;


Colocar as razes em azul de metila 0,05% por 24 horas;
Conservar as razes coloridas em glicerol cido at avaliao.
Preparo dos reagentes:
HCl (cido clordrico) - 5%
132 ml de HCl P.A. (38%) em 950 ml de gua destilada
KOH (Hidrxido de sdio) 10%
Peso molecular 56,11g
100 g de KOH dissolver em 900 ml de gua destilada
Perxido de hidrognio 10%
345 ml de perxido de hidrognio P.A. (28%) completar para 1000 ml com gua destilada.
Azul de metila 0,05%
200 ml de cido ltico
200 ml de gua destilada
200 ml de glicerol
0,3g de azul de metila
Glicerol cido
250 ml de glicerol
15 ml de HCl - 5%
85 ml de gua destilada

AVALIAO DA COLONIZAO MICORRIZICA (Giovannetti e Mosse, 1980).


Procedimento:
Espalhar as razes coloridas uniformemente em placa quadriculada (quadrculas de 1,27 cm);
Registrar o nmero de segmentos radiculares que fazem intersees com linhas verticais e horizontais e
destes quais apresentam estruturas do fungo (vesculas, arbsculos, clulas auxiliares, esporos ou hifas)

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Referncias
GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques to measure vesicular-arbuscular mycorrhizal
infection in roots. New Phytologist, v.84, p.484-500, 1980.
KOSKE, R.E.; GEMMA, J.N.A. modified procedure for staining roots to detect mycorrhizas. Mycological
Research. v. 48, p. 486-488, 1989.

Densidade de esporos de FMA


Para extrao de esporos de FMA 50 g de solo transferida para um recipiente contendo 1000 ml de
gua, homogeneizados com a mo para desestruturao de todos os torres (aglomerados) existentes. Na
seqncia, o material decantado por um minuto, sendo o sobrenadante vertido sobre trs peneiras
sobrepostas de 50m, 100m e 250m. O material retido nas peneiras i recolhido em um tubo de ensaio e
submetido centrifugao em gua (3000 rpm) por 3 minutos. O sobrenadante descartado e, ao material
depositado no fundo, foi adicionada soluo de sacarose 70%. O material ressuspenso com auxlio de basto
de vidro e os tubos de ensaio so novamente levados centrfuga (2000 rpm) por 1 minuto. O sobrenadante
vertido na peneira de 50m e os esporos retidos na mesma foram lavados em gua corrente para retirada do
excesso de sacarose, e transferidos para placa canaletada, onde realizada contagem com auxlio de
microscpio estereoscpico (40x).

EXTRAO E CONTAGEM DE ESPOROS DE FMA


(Gerdemann & Nicolson, 1963)
Procedimento:
Colocar 50 g de solo em recipiente com 1000 mL de gua e agitar, deixar repousar por alguns segundos;
Passar em peneiras de malhas 40 e 400 mesh;
Recolher o material retido na peneira de 400 mesh e transferir com auxlio de pisseta com gua destilada
para tubos de centrfuga;
Centrifugar material durante 5 minutos a 3000 rpm;
Descartar sobrenadante e adicionar soluo de sacarose 50% at completar tubo;
Agitar e centrifugar o material durante 2 minutos a 2500 rpm;
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Recolher o sobrenadante com peneira de 400 mesh;


Lavar com gua corrente para retirar excesso de sacarose;
Transferir o material retido na peneira para placa de Petri;
Levar ao estereomicroscpio para contagem dos esporos. Sero considerados viveis ou esporos que
adquirem colorao vermelha ou rsea aps contato com o reagente
Preparo das solues:
Soluo de sacarose - 45%
Colocar 500g de acar e completar para 1000 ml com gua destilada.
Essa proporo sempre compatvel com a quantidade de soluo que se deseja preparar.
GERDEMANN, J.W.; NICOLSON, T.H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet
sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, v.46, p.235-244, 1963.

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