Microbiologia Geral
Prticas de Laboratrio
Microbiologia Geral
Prticas de Laboratrio
Aluno: -------------------------------------------------------------------------------
SUMRIO
Assunto
Pgina
Equipamentos e vidrarias------------------------------------------------------------------------
11
14
17
21
24
27
29
31
36
Cada aluno deve trazer para as aulas: isqueiro, caneta rde marcao de vidrarias
para identificao de materiais, etc;
Todo material utilizado (placas de Petri, tubos, etc) deve ser devidamente
identificado, para observaes posteriores;
EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
EQUIPAMENTOS
Microscpio
Autoclave
VIDRARIAS
Balo volumtrico
Placa de Petri
Graduada
Proveta
Pipeta
Pipeta
Pissete
Erlenmeyer
Volumtrica
Tubo de Ensaio
Esptula
Funil
Vidro de relgio
Basto de vidro
Lamparina
Ala de platina
Pra
Ala de Drigalski
Lmina e lamnula
Pipeta de Paster
EQUIPAMENTOS
Centrfuga: utilizada para acelerar o processo de decantao devido ao movimento de rotao, que
arremessa as partculas de maior densidade, por inrcia, para o fundo do tubo.
Estufa: utilizada para esterilizaes a seco (no a vapor), demora mais do que a autoclave para esterilizar.
Esterilizao de vidrarias 2 horas a 180C
Autoclave: utilizado para esterilizaes a vapor sob presso, o meio mais rpido de esterilizao. Preparo
de meio de cultura (30 minutos) e esterilizao de material (20 minutos).
Cmara de exausto: utilizada para o manuseio de reagentes e preparo de solues, principalmente
aqueles que liberam gases txicos.
Microscpio: utilizado para observao microscpica de materiais biolgicos.
Estufa incubadora de crescimento tipo B.O.D.: utilizada para a incubao de microrganismos sob
condies controladas de umidade, temperatura e luminosidade.
Cmara de fluxo laminar: utilizada para criar ambientes limpos permitindo o manuseio de microrganismos
em condies asspticas.
VIDRARIAS:
Tubo de ensaio: utilizado para efetuar reaes qumicas em anlise qualitativa, com pequenas pores de
reagentes.
Becker: utilizado para efetuar reaes qumicas com pores maiores de reagentes, recolher filtrados, fazer
decantaes, preparar solues. Sua capacidade varivel, podendo ser graduado ou no.
Erlenmeyer: utilizado para efetuar reaes qumicas principalmente em anlise volumtrica. Devido ao seu
formato, facilita a agitao sem perda de reagente.
Balo volumtrico: utilizado em medies mais precisas de volumes lquidos.
Proveta: utilizada em medies aproximadas de volumes lquidos. Uma proveta poder medir vrias
alquotas (pores).
Pipeta: utilizada para medir volumes menores e mais acurados, se apresentam em dois tipos:
1. Graduadas: Apresentam escala de volume, podendo medir vrias alquotas.
2. Volumtricas: Apresentam aferio nica, e medem volumes com maior preciso.
Funil: utilizado em filtraes simples e na transferncia de lquidos de um recipiente para outro.
Vidro de relgio: utilizado para pesagens de reagentes (slidos), para cobrir becker com solues e para
evaporar lquidos.
Pissete: utilizado para lavagem de precipitado, cristais, recipientes e para completar e aferir volumes.
7
Pele ou cabelo Passe os dedos em vrios pontos da superfcie do meio de cultura na placa ou coloque
um fio de cabelo sobre a superfcie do meio de cultura.
Respirao Inocule a placa tossindo, assoprando ou espirrando diretamente sobre o meio de cultura.
2. Abra uma placa na proximidade da chama do bico de Bunsen e permanea por 1 minuto.
3. Uma placa permanecer fechada e ser utilizada como controle para os procedimentos anteriores.
4. As placas devero ser identificadas com iniciais do aluno, data e turma prtica.
RESULTADOS:
Enumere e caracterize (cor, tamanho e forma) as colnias que cresceram na superfcie das placas
comparando-as com a placa controle e com a placa aberta prxima ao bico de Bunsen.
Ensaio
Controle
Bico de Bunsen
10
2. Quanto a finalidade:
Meios de pr-enriquecimento - so aqueles que permitem a dessensibilizao de
microrganismos injuriados.
Meios de enriquecimento so aqueles que proporcionam nutrientes adequados ao
crescimento de microrganismos presentes em baixos nmeros ou de crescimento lento,
bem como microrganismos exigentes e fastidiosos.
Diferenciais
so
aqueles
que
contm
substncias
que
permitem
diferenciar
caracterizao
identificao
perfunctria
ou
presuntiva
de
muitos
microrganismos.
11
13
Filtrao
Liofilizao (liofilizador)
14
Sabonetes
antimicrobianos
Mertiolate
Cloro
15
Enxaguante bucal
lcool 70%
Iodo
2.
Digital
Antissptico
16
17
Pprocedimento:
- Pese 10 g de amostra de solo rizosferico, e transfera para Erlenmyer contendo 90 mL de soluo salina NaCl
(0,85%). Agite o Erlenmyer da amostra a analisar, de modo a misturar bem os possveis microrganismos que a
se encontram.
- 1 tubo: Retire 1ml desta amostra e transfira para o 1 tubo contendo 9 ml de soluo salina. NaCl (0,85%).
Misture bem utilizando o vortex. Este ser o tubo de diluio 1: 10.Escreva no tubo a sua diluio. Pipete deste
tubo 100l para uma placa de Petri contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra
inoculada. Em seguida espalhe bem a soluo com auxlio da ala de Drigalski.
- 2 tubo: Retire 1 ml do 1 tubo e transfira para o 2 tubo de diluio, utilizando outra ponteira. Misture bem e
identifique o tubo com a diluio correspondente 1:100. Pipete deste tubo 100l para uma nova placa de Petri
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a
soluo com auxlio da ala de Drigalski.
- 3 tubo: Retire 1ml do 2 tubo de diluio e transfira para o 3 tubo de diluio. Proceda da mesma forma que
anteriormente, identificando o tubo como de diluio 1:1000. Pipete deste tubo 100l para uma placa de Petri
contendo o meio de cultura. Escreva na placa a diluio da amostra inoculada. Em seguida espalhe bem a
soluo com auxlio da ala de Drigalski.
18
TCNICAS DE SEMEADURA
Podem ser utilizadas duas tcnicas de sementeira distintas, de modo a atingir o objetivo de estimar o
nmero de microrganismos na amostra diluda. Uma das tcnicas designa-se por Sementeira por
Espalhamento (Spread Plate), em que um volume de 1ml ou 0.1ml da amostra pipetado e espalhado na
superfcie do meio de cultura slido com auxlio de uma ala de Drigalski.
A segunda tcnica, designada por Sementeira por incorporao (Pour plate) consiste na mistura de 1
ou 0.1ml da amostra diluda com o meio de cultura ainda no estado lquido. Aps o perodo de incubao,
quando se deseja realizar a contagem do nmero de unidades formadas de colnia (UFC), o ideal que a
placa apresente de 25 a 250-300 colnias.
1. A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto,
devem ser aquecidos no bico de Bunsen. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma
faa um ngulo de 45 em relao mesa de trabalho.
2. Antes de retirar o material para a elaborao do esfregao ou para semeadura deve-se esfriar a ala
na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri.
3. Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo aps a
retirada do tampo de algodo. Este dever ser mantido seguro pelo dedo mnimo da mo que est
segurando a ala. Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar
o tampo de algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada.
4. As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar contaminao com
germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em B.O.D. com tampa voltada para
baixo.
20
Estrias Compostas
Divida a placa em 4 quadrantes. Espalhe o inculo no 1 quadrante, esgotando com a ala de
repicagem, fazendo-se movimento de zig-zag. Flambe novamente a ala e esfrie encostando a ala de
repicagem na superfcie do gar. Gire a placa 90 graus, toque a ala no canto da estria do 1 quadrante e
deslize vrias vezes, repedindo o movimento de zig-zag at o outro extremo do 2 quadrante da placa. Repita a
operao no 3 e 4 quadrantes.
21
deve ser suplementada com 7-8% de dimetilsulfxido (DMSO) ou 15-25% de glicerol antes do congelamento a
-80C. Para o armazenamento a -20C, devem ser utilizadas concentraes de 40-50% de glicerol.
Armazenamento por 1 a mais de 4 anos
Liofilizao
As clulas microbianas so liofilizadas, mantendo a viabilidade por longos perodos. Manter no refrigerador a
4C.
Slica
Faz-se uma suspenso de esporos em uma soluo de leite (5%). 100 l da suspenso so adicionados a um
tubo (2 ml) mantida a 0C (no gelo) contendo slica previamente esterilizada. Manter no refrigerador a 4C ou
temperatura ambiente.
23
24
10. Encaixe a objetiva de 10X e ajuste o foco novamente, apenas com o boto micromtrico (uma vez que se tenha
obtido o foco com a objetiva de 4X, acertar o foco das outras objetivas, 10 X, 20X, etc apenas com o boto
micromtrico;
11. Antes de encaixar a objetiva de 100X (objetiva de imerso) colocar uma gota de leo de imerso sobre o
esfregao e encaixar a objetiva. Aps a adio do leo de imerso no voltar para a objetiva de 40 X;
12. Aps o trmino das observaes, retirar a lmina, desligar a lmpada, girar o revolver e encaixar a objetiva de
4X, baixar a platina e limpar a objetiva de imerso, cuidadosamente.
25
5. Lave a lmina com etanol 95 % rapidamente (at que no se desprenda mais corante do esfregao);
6. Lave o excesso de lcool com gua;
7. Cubra o esfregao com soluo de fucsina, por 30 segundos;
8. Lave a lmina com gua e deixe secar;
9. Faa a observao ao microscpio do material.
Resultados
Desenhe os campos observados, observando forma, tamanho, arranjos.
26
7. Com o auxlio de uma pina, transferia os fragmentos, bem separados, sobre a superfcie do meio BDA
(batata dextrose Agar);
5. Incube as placas temperatura ambiente por uma semana.
6. Aps crescimento do microrganismo de interesse, transfira a colnia para um novo meio de cultura e
armazene a sua cultura pura.
28
INTRODUO
Os fungos so organismos eucariticos, heterotrficos, aerbios, adaptados a diversos
ambientes. Apesar de abundantes em todo o mundo passam despercebidos em funo do
pequeno tamanho das suas estruturas, sendo notados apenas quando frutificam, a exemplo, os
bolores e os cogumelos. Desempenham papel importante na decomposio da matria orgnica,
na ciclagem de nutrientes, na indstria alimentcia (fermentao, enzimas), na indstria
farmacutica (antibiticos) e so responsveis pela causa de doenas em plantas e seres
humanos. Os fungos podem existir como saprfitas degradando matria orgnica, transformando-a
em formas qumicas simples que retornam ao solo; como parasitas causando doenas em animais
e vegetais e como simbiontes que associam com outros organismos, tal como algas (liquens) e
razes de plantas (micorrizas). A classificao dos fungos baseada em suas estruturas
reprodutoras, como esporos, corpos de frutificao, natureza do ciclo de vida e caractersticas
morfolgicas do seu ciclo de vida. Os fungos formam esporos e produzem hifas que so estruturas
filamentosas e cilndricas que a partir de seu crescimento formam um miclio bem desenvolvido.
Nesta aula voc far observaes microscpicas de alguns fungos, visualizando suas estruturas,
como esporos e hifas.
MATERIAL
Cultura de Penicillium sp., Aspergillus sp., Curvularia sp. , Phyllosticta sp., Trichoderma sp.;
lminas, lamnulas, lactofenol, microscpio tico, ala de repicagem.
PROCEDIMENTO
Preparaes Microscpicas
1. Com o auxlio de uma ala de repicagem, remova uma parte do miclio do fungo em cultura
pura;
2. Transfira a amostra coletada uma lmina contendo 1 gota de azul de lactofenol;
3. Cubra com a lamnula;
4. Observe e desenhe as estruturas dos fungos.
29
30
Os sistemas de produo agrcola tm se tornado cada vez mais intensivos e dependentes dos
agroqumicos, o que tem gerado problemas com o desenvolvimento de resistncia dos patgenos aos produtos
utilizados e impactos ambientais negativos devido ao amplo espectro de ao destes produtos, atingindo
organismos no-alvo e causando riscos sade humana e animal. Neste sentido, a utilizao de microorganismos com ao de biocontrole e/ou promoo de crescimento vem sendo apontada como uma
alternativa vivel para sistemas de produo agrcola ecologicamente e economicamente sustentveis.
Dentre as avaliaes realizadas in vitro para a seleo de agentes de controle biolgico e promoo de
crescimento de plantas, caractersticas como atividade antagnica ao patgeno (antibiose), capacidade de
colonizao do sistema radicular, produo de siderforos, enzimas lticas e substncias reguladoras de
crescimento de plantas, entre outros so de fundamental importncia.
Produo de quitinase
Os micro-organismos so multiplicados em meio de sais minerais gar (Tuite, 1969), suplementado com
quitina coloidal, como nica fonte de carbono. As culturas so incubadas em cmara de crescimento tipo
B.O.D., a 282C por dez dias. Aps esse perodo, a atividade quitinoltica dos isolados avaliada pela
formao de um halo hialino em torno das colnias crescidas.
Produo de celulase e xilanase
Os micro-organismos so multiplicados em meio de sais minerais gar (Tuite, 1969), suplementado com
celulose ou xilana, como nica fonte de carbono. Os micro-organismos so incubados em cmara de
crescimento tipo B.O.D., 282C por dez dias. Aps esse perodo, so adicionados 10 mL da soluo de
vermelho congo a 0,5% em cada placa, seguido de incubao a temperatura ambiente por 15 minutos. Aps
esse perodo, drenado o excesso da soluo vermelho congo e adicionados 10 mL da soluo de NaCl (1 M)
em cada placa, seguido de incubao por 30 minutos. Aps ter removido o excesso da soluo, verifica-se a
formao do halo de colorao alaranjada em torno das colnias crescidas, indicando a atividade celuloltica e
xilanoltica dos isolados.
31
Produo de lipase
A produo de lpase pelos isolados, avaliada no meio de cultura usando Tween 80 como fonte de carbono.
Os micro-organismos so incubados em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C por dez dias. A
produo da enzima detectada pela formao de um halo branco difuso, constitudo de minsculos
precipitados de oleato de clcio, ao redor das colnias crescidas dos microorganismos.
Produo de amilase
Os micro-organismos so multiplicados no meio de cultura gar amido, constitudo de 0,2% de amido solvel.
Posteriormente, as culturas so incubadas em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C por dez dias.
Aps o crescimento das colnias, foram adicionados 10 mL da soluo de lugol nas placas. A produo da
enzima amilase detectada pela descolorao do meio em torno da colnia, devido hidrlise do amido.
32
Solubilizao de fosfato
Os micro-organismos so cultivados em meio de cultura triptocasena de soja, diludo 1/10 e acrescido de
CaHPO4, e as placas incubadas em cmara de crescimento tipo B.O.D., a 282C, por dez dias. Aps esse
perodo, a solubilizao de fosfatos detectada pela formao de halo claro em torno das colnias crescidas.
TESTES DE ANTIBIOSE
33
34
35
37
Referncias
GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques to measure vesicular-arbuscular mycorrhizal
infection in roots. New Phytologist, v.84, p.484-500, 1980.
KOSKE, R.E.; GEMMA, J.N.A. modified procedure for staining roots to detect mycorrhizas. Mycological
Research. v. 48, p. 486-488, 1989.
39