YUSRON AMINULLAH

201010070311126
BIOLOGI IC
ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)
Sebelum pembangunan EIA / ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan immunoassay
sebuah adalah radioimmunoassay, suatu teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi.
Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo
Berson diterbitkan pada tahun 1960. enzim tertentu Lanjutan (seperti peroksidase) bereaksi dengan
substrat yang tepat (seperti 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine), mereka dapat mengakibatkan perubahan
warna, yang dapat digunakan sebagai sinyal. Sinyal ini harus dikaitkan dengan adanya antibodi atau
antigen Proses menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce
Enzyme-linked immunosorbent assay atau immunosorbent assay enzim-linked, adalah teknik
immunoassay melibatkan reaksi antigen dan antibodi in vitro. ELISA adalah tes sensitif dan spesifik
untuk deteksi dan kuantisasi dari antigen atau antibodi. ELISA tes biasanya dilakukan di piring
microwell. Tes ELISA, atau enzim immunoassay (EIA), adalah tes skrining pertama yang biasa
digunakan untuk HIV. Memiliki sensitivitas tinggi.
Antibodi ELISA: IgG fraksi serum dimurnikan dengan kromatografi afinitas Enzim: Horse
Radish Peroksidase (HRP) 44 MW, 000, glikoprotein dengan 4 residu lisin Substrat: BMT (3,3 ', 5,5',
tetramethylbenzidine) Enzim bertindak sebagai katalis untuk mengoksidasi substrat dengan adanya
Hidrogen peroksida untuk menghasilkan warna biru. Reaksi dihentikan dengan cairan asam untuk
menyebabkan kompleks untuk menjadi kuning.
Antibodi adalah diamobilisasi pada Kompetisi sumur mikro-piring antara dalam sampel dan
diberi label enzim untuk situs pengikatan antibodi terikat Bahan dicuci bersih berkromogen substrat
ditambahkan untuk mengembangkan warna warna Hasil dapat dibaca pada spektrofotometer.
Berbagai macam prinsip-prinsip assay dapat digunakan dalam teknik ELISA.Saat ini yang paling
penting adalah:
1.Metode Kompetitif
2.Metode Sandwich
3.Antibodi menangkap metode
1.Metode Kompetitif
Salah satu komponen dari reaksi imun adalah insolubilized dan yang lain diberi label dengan
enzim.Analit kemudian bisa diukur dengan kemampuannya untuk mencegah pembentukan kompleks
antara insolublized dan reagen berlabel.Keuntungan dari pendekatan ini adalah bahwa hanya satu langkah
inkubasi diperlukan dan bahwa rentang konsentrasi yang analit bisa diukur tanpa pengenceran sampel
agak sempit dan bahwa antigen atau antibodi (dalam kasus dimana baik mungkin ada dalam sampel
misalnya hepatitis B) menghasilkan respon yang sama,dan karena itu bisa tidak bisa menjadi dibedakan
dalam alat tes langkah satu.

2.Metode Sandwich (tidak langsung)

Metode dimana komponen yang sama dari reaksi kekebalan tubuh (misalnya antibodi) digunakan
dalam insolubilized dan bentuk berlabel enzim.Komponen lain,analit yaitu (antigen dalm sampel bentuk
jembatan antara dua reagen.Dimana salah satu komponen (biasanya antigen) digunakan dalam bentuk
insolubilized untuk mengikat analit dari sampel (antibodi),yang selanjutnya ditentukan dengan
penambahan antibodi kedua berlabel terhadap kelas yang sama antibodi sebagai antibodi analit atau
protein A.Pada prinsipnya,kuantifikasi dapat dicapai melalui berbagai konsentrasi analit sagat luas dalam
metode sandwich tersebut.Efek Prozone dapat dihindari dengan cara berikut:
a.menggunakan langkah-lagkah inkubasi sekuensial untuk sampel dan label,atau
b.dengan menggunakan antibodi monklonal
Salah satu metode sandwich adalah metode sandwich inhibisi yaitu metode yang mengandung
sampel yang mengandung analit (biasanya antibodi) adalah pre-inkubasi dengan jumlah tetap sebesar
mitra mengikat perusahaan (misal:antigen) setelah mana sisanya sebesar antigen ditentukan dalam assay
sandwich.Metode ini biasanya sangat rumit dan memiliki jangkauan pengukuruan terbatas.Metode ini
memungkinkan untuk mendeteksi secara simultan antibodi atau atigen,jika salah satu dari dua analit hadir
dalam sampel.
3.Antibodi menangkap Metode
Metode ini digunakan untuk mendeteksi antibodi dari subkelas imunoglobin spesifik,dengan
terlebih dahulu bereaksi sampel dengan misalnyan insolubilized anti-IgM,dan selanjutnya dengan baik
antigen berlabel enzim diikuti oleh antibodi terkait enzim.Baik antibodi dari subkels immunoglobulin
lainnya maupun faktor rheumatoid mengganggu secara signifikan dalam tes tersebut.Mereka banyak
diguanakan untuk diagnosis infeksi akut dengan deteksi IgM.Tes ini dapat digunakan untuk mendeteksi
IgG danIgA.Mengingat kecenderungan terhadap penyederhanaan tes dan kuantifikasi analit pada rentang
konsentrasi yang uas.Harus diharapkan bahwa metode penghambatan kompetitif dan sandwich akan
berkurang pentingnya,dan metode sandwich dan antibodi akan menangkap prinsip-prinsip pengujian
utama di masa depan.
1.Assay Karakteistik
Penggunaan antibodi monklonal telah menebabkan banyak perbaikan dalam sistem ELISA.
1.Tinggi sensitivitas,baik oleh pemilihan antibodi dengan afinitas yang sangat tinggi,atau dengan
pengurangan tinggi dan variabilitas dari reaksi latar belakang,yang membuat konsentrasi yang sangat
rendah anlit lebih mudah terdeteksi.
2.Tinggi spesifisitas,dengan menghindari adanya antibodi apapun dalam sistem uji dengan rektivitas
spesifik terhadap epitop non-analit,dan dengan memilih kombinasi dari antibodi monokonal yang
selanjutnya dapat meningkatan spesifisitas.
3.Tingkat kepraktisan,misalnya dengan memperkenalkan inkubasi simultan label,fase padat dan sampel
tanpa resiko Efek Prozone.
2.Label Enzim
Sebagian besar tes ini menggunakan
kuda-lobak peroksidae,fosfatase alkali,atau BDgalaktosidase.Perkembangan baru-baru ini yang paling menarik telah ada metode baru untuk mendeteksi
enzim daripada penggunaan enzim baru.Fluorimeers diperkenalkan pada tahun 1984 untuk mendeteksi
alkaline phosphatase dan BD-galaktosidasaeperoksidase.Metode yang tersedia untuk mendeteksi kuda
lobak dengan cara chemilumininescence.Fluorimetric dan metode luminometric menawarkan sensitivitas
tinggi dan jangkauan lebih luas daripada pengukuran spektrometri konvensional.BMT secara bertahap
menggantikan substrat mutagenik seperti OPD,yang menyebabkan peningkatan kepekaan dan
keselamatan.

Lempeng ELISA: sumur berwarna menunjukkan reaktivitas. Semakin gelap warna, semakin tinggi
reaktivitas yang terjadi.

Sandwich ELISA urutan assay - antigen dan deteksi antibodi ditambahkan bertahap
Pada alat tes urutan, sampel diterapkan pada pelat mikro yang dilapisi antibodi-baik. Menangkap antibodi
mengikat antigen dalam sampel. senyawa Unbound dikeluarkan oleh prosedur mencuci sebelum deteksi
antibodi enzim-linked ditambahkan ke sumur. Deteksi antibodi mengikat ke epitop kedua (bagian
imunogenik) pada antigen. antibodi Unbound dikeluarkan dengan mencuci sebelum penambahan substrat,
yang diubah oleh enzim untuk sinyal berkromogen. Reaksi enzim dihentikan dan hasilnya dipantau
spektrofotometri. Antigen lebih dalam sampel, semakin kuat sinyalnya. Sandwich ELISA juga dapat
dibangun sebagai alat tes simultan di mana antibodi sampel dan deteksi ditambahkan pada langkah yang
sama

Sandwich ELISA assay simultan - antigen dan deteksi antibodi ditambahkan secara
bersamaan.

ELISA assay kompetitif

Tipe kedua adalah tes ELISA kompetitif di mana terdapat mengikat kompetitif dari antibodi,
antigen-spesifik biotin-linked untuk antigen sampel atau untuk antigen terikat pada mikro dengan baik.
Terikat antibodi dideteksi dengan streptavidin enzyme-linked. Karena konsentrasi antigen-antibodi
spesifik adalah penting dan harus dibatasi dalam pengujian ini, biotin / langkah streptavidin digunakan
untuk meningkatkan sinyal.Dalam pengujian ini,emakin banyak antigen pada sampel atau contoh,sinyal
yang lemah.Beberapa alternatif variasi dariBentuk ELISA ditemukan