23.2 ~Que es la CTomatografta?

}ill.

Eteres corona
e(eres corona son una clase de compuestos sinteticos que 'Ingar una reacci6n con compuestos
a iones metalicos (especialmente cationes de metales alca- . de potasio y dibenzo-3-corona-lO,
formando una envoltura con atomos de oxigeno, a traves de mos de oxigeno, siendo la distancia
cuales se enlazan a elios. Los eteres corona se usan como cata- . la parte exterior del complejo se
disolvente
r.,'IE'.w.n nores de transferencia de fase, porque pueden extraer reactivos
acuosolubles en disolventes no polares, donde puede tener

hidrofoblcos, En el complejo
el K+ esta rodeado de 10 atomedia K-O de 288 pm. S610
encuentra en contacto con el

<.

a) Estructura molecular de dibenzo-30-corona-to, b) Estructura tridimensional de su complejo con K+. [Adaptado de M. A. BUSH Y M. R.
TAUTER,
Complexes

.Crystal

Structures

with Cyclic Polyethers-,

of

AlkaliMetal

J. Chern. Soc.

Chern. Cemmun . 1970,1439.1

cromatografia funciona con el mismo principio que el de Ia extraccion, pero en este

una fase se mantiene fija y la otra se mueve a traves de ella. La figura 23.5 muestra
disolucion que contiene los solutos A y B, que se depositan en la cabeza de una
empaquetada con partfculas s6lidas y llena de disolvente, Cuando se abre la
los solutos A Y B entran en la columna. A continuaci6n se aiiade nuevo disolvente
la entrada de Lacolumna y la mezc1a se eluye de la columna mediante un flujo contide disolvente. Si el soluto A se adsorbe mas fuertemente que el soluto B en las pattisolidas, el soluto A se encuentra libre en disolucion una fraccion menor de tiempo. El

Disolvente pure
(eluyente)

EI 1903, M. Tswett emple6 por primera vez la

cromatograffa de adsorci6n para separar pigmentos vegetales. Utiliz6 un hidrocarburo como
disolvente y polva de inulina (un hidrato de
cabono) como fase estacionaria. La separaci6n
de bandas coloreadas condujo al nombre eramatograffa, de la palabra griega ehromatos, que
significa color. Tswett hall6 mas tarde que el
CaC03 0 la sacarosa tarnblen se podlan utilizar
como fases estacionarias.s

-,

solutos Ay B

Empaquelado de columna
(lase estacionaria)
en el disolvente
(lase m6vil)

Figura 23.5

Disco poroso

Disolvente que sale de _-----.

la columna (eluaio)

a)

b)

0)

Representaci6n esquemanca de
una separaci6n cromatoqrafica, EI soluto A, que
tiene mayor afinidad que el soluto B por la fase
estacionaria, permanece mas tlempo en la columna.

CS"K

23 Introduction a las separationes analiticas

Extracctnn con ditizona

La ditizona (difeniltiocarbazona) es un compuesto verde, soluble
.en disolventes organicos no polares e insoluble en agua por debajo
de pH 7. Forma complejos hidrOfobos rojos con la mayona de los
iones metalicos di- y trivalentes.

r6Hs

~
N,

C J.T

6&'-5,

C-SH

P _1016
2+~

+ Pb

N-N

H/

Ditizona
(verde)

(lncoloro)

C,(J?
u,

El equilibrio entre el ligando verde y el complejo

puede demostrar usando tres tubos de ensayo grandes,
hermeticamente con tapones. En cada tubo se -coloe.
hexano y unos pocos mililitros de disoluci6n de ditizona
rada disolviendo 1 mg de ditizona en 100 mL de CHCll)'
A se le dade agua destilada; al tubo B. agua del grifo, y a1
Pb(N03h 2 mM. Despues de agitar y dejar unos mqllltO~!
reposo, los tubos B Y C presentan una fase superior roj a,
que la de A -permanece verde,
El equilibrio prot6nico en la reacci6n anterior se muestra
.diendo unas pocas gotas de HCl 1 M al- tubo C. Despues de
1a ditizona se vuelve de nuevo verde. La com_peteocia
ligando mis fuerte se muestra aiiadiendo unas pocas gotas
luci6n de EDTAO,05 M al tubo B. De nuevo, agitando, se
la inversion at color verde.

Pnictica de qufmlca verde

Complejo metico
(rojo)

La ditizona se usa Mucha en extracciones analiticas, para determinaciones colorimetricas de Lones metalicos y para eliminar trazas
de metales de tampones acuosos.
Para esta Ultima aplicaci6n, un tamp6n acuoso se cxtrae repetidas veces con
disoluci6n verde de ditizona en CHCl). Mientras
siguen extrayendose iones metalicos del tamp6n. la fase organica se
tine de tojo. Cuando los cxtractos son verdes. ya se han eliminado
las Ultimas trazas de iones metalicos. En la figura 23.4, vemos que a
un pH dado &610 se pueden extra.er ciertos iones metalicos.

una

.,I

Los procedimientos qufmicos que producen menos ,.",~itf ...""

duos menos peligrosos se llaman verdes, porque rccJIlICCIIl-lI
cfectos perjudiciales at medio ambiente. En los analisis
con ditizona se puede sustituir la fase org8nica (que ba
cionalmente c1oroformo, CHcl3) por micelas acuosas
26.1), con objeto de evitar un disolvente clorado y Ia
que suele ser engorrosa. 1 Por ejemplo, una disolucion que
un 5,0% p del tensioactivo TritonX-IOO forma rnicelas,
de preparar Una disoluci6n de ditizona 8,3 X 10-' M a 2S
< 7. La concentraci6n de ditizona dentro de las micelas, que
tituye una pequeiia fracci6n del volumen de la disolncicn, es
mayor -que 8,3 X 10-5 M. Las disoluciones micelares
ditizona se pueden usar en analisis espectrofotOmetrico de
como Zn(ll), Cd(ll), Hg(ll). Cu(ll) y Pb(II), con resultados
rabies a los que se obtienen con un disolvente orgaruco.

soluto A desciende por la columna mas lentamente que el soluto B, y emerge por 1a
despues del soluto B. De ese modo se -separa una mezcla en sus componeotes por
tografia.
~
En cromatografia la Case m6vil (el disolvente que desciende a traves d~ la .
un lfquido 0 uo gas. La fase estacionaria (la que se encuentra fija en el IOtenor) es .-,,'%''':-,:11':;
malmente un lfquido viscoso enlazado quimicamente a las paredes interiores de 1!D
capilar 0 a la superficie de las partfculas s6lidas empaquetadas dentro de la columna.
nativamente, como se muestra en la figura 23.5, las mismas partfculas s6lidas puedeD ftI
fase estacionaria. En cualquier caso, el reparto de solutes entre las fases m6vil y
ria da lugar a la separaci6n_
EI fluido que entra por la columna se llama eluyente. EI fluido que sale por el
de la columna se llama eluato:
eluyente
entra

Eluyente: Disoluci6n que entra.

Eluato: Disoluci6n que sale.
"
'.,

---+ COLUMNA

---+ eluato
sale

El ptoCesode paso de un liquido

un gas a traves de una columna cromatografica se llama

23.2 tQue es fa cromatografia?

~6n.
. Las columnas pueden ser empaquetadas 0 tubulares abiertas. Una columna empase llena con partfculas que son la fase estacionaria, como se ve en la figura 23.5.
colurona de tuba abierto es un capilar hueco estrecho cuyas paredes interiores estan
~"'-,I,,"'r'lJ1l)con la fase estacionaria.

cromatografia se divide en varias categorias en funci6n del mecanismo de interacci6n

solutocon la fase estacionaria, como se muestra en la figura 23.6 .

EI soluto

Secci6n transversal
de una columna
tubular abierta

se adsorbe
en la superficie de

-e>----

la lase estacionaria

EI soluto se disuelve
en la lase Ifquida con

..

que esta recubierta

superficie de un
soporte solido .

Cromatografia

la

de rsparto

Los aniones moviles

quedan retenidos junto
a los caliones que sstan
unidos covalentemenle
a la tase estacionaria

Las rnoleculas
pequeiias penetran
en los poros de las
partlculas
Resina de intercambio
anionieo. 8610 puede
lijar a aniones

Cromatografia

~ '4t
/~

0_-

de exclusion molecular

II

._6
"

y-\",'\.

Una clase de molecule en

una mszcla compleja se une
a una rnolecula que esta
unida covalentemente
lase estacionaria

'

Cromatogralia

G>

Tooas fas demas

moleculas

seeliminan

de afinidad

Principales tlpos de cromatografia.

simple mente

a la

,,I

23 lntroducdcn a las separadones analiticas

La cromatografia

de adsorcion usa una fase estacionaria solida ~ una fase m6vij

gaseosa. EI soluto se adsorbe en la superficie de las partfculas solidas.
fuertemente se adsorbe un soluto, mas lentamente atraviesa la columna.

una

La cromatografia
de reparto utiliza una fase estacionaria liquida, en forma de
pelfcula de alto punto de ebullicion sobre la superficie de un sopone solido, que en
matografia de gases es, tipicamente, la cara interna de una columna de CrC.m~lt~:rafratt~
sflice. EI soluto esta en equilibrio entre el lfquido estacionario y la fase rnovil, que
cromatografia de gases el gas que fluye.
A. J. P. Martin y R. L. M. Singe recibieron el premio Nobel en 1952 por su trabajo pionero sobre
cromatograffa de reparto Ifquidolfquido en
1941.

Cromatografia
de intercambio '>jonico. En este tipo de cromatografia
existen
como -S03
0 cationes como -N(CH3)j, covalentemente
unidos ala fase eSlllCJO"i.*~
solida, que de ordinario es una resina. Los iones en disoluci6n de carga
atrafdos a la fase estacionaria por fuerzas electrostaticas. La fase m6vil es un

B. A. Adams y E. L. Holmes obtuvieron las pnmeras resinas slntetlcas de intercamblo lonlco

en 1935. Las resinas son sOlidos organicos relatlvamente duros y amorfos. Los geles son relativarnente blandos.

Cromatografia
de exclusion molecular. Esta tecnica, tambien llamada cr(J.nultol"IIa~~
mtracion por gel 0 de permeacion por gel, separa moleculas por su tamafio, Las
culas de mayor tamafio pasan mas rapidamente que las de menor tamano. A
de ofras formas de cromatografia, no hay una interacci6n atractiva entre la fase
narias y el soluto en el caso ideal de una exclusion molecular. En su Iugar. la fase
lfquida 0 gaseosa pasa a traves del gel poroso. Los poros son bastante pequeOOs
excluir a los solutos grandes, pero no a los pequeiios. Las moleculas grandes
largo sin entrar en los poros. Las molecules pequeiias tardan mas tiempo en pasar
ves de la columna porque penetran dentro del gel, y por consiguiente deben
mas volumen antes de abandonar la columna.

Las moleculas grandes pasan a traves de la

columna mas rapldarnente que las rnoleculas
pequeiias.

Cromatografia
de afinidad. Esta forma de cromatografia, que es la mas selectiva,
interacciones especfficas entre una clase de moleculas de solute y una segunda molleCll""~.
que esta unida covalentemente
(inmovilizada) en la fase estacionaria. Por C.JCI:np~~
molecula inmovilizada podria ser un anticuerpo unido a una protein a ilptprrnl""""
pasa a traves de la columna una mezcla que eontiene un millar de protein as, 5610
tefna que reacciona con el anticuerpo se fija a la columna. Despues de lavar los
solutos de la columna, se libera .la proteina deseada modificando el pH 0 la fuerza

Aspectos instrumentales de la cromatografia

Caudal = Volumen de dlsolvente que pasa par

la columna en una unidad de tiempo.
Velocidad lineal de flujo = Dlstancia recorrlda
por el disolvente en 1a unidad de tlempo.

La velocidad con que la fase m6vil pasa a !raves de una columna cromatogriifica se
expresar como caudal 0 como velocidad lineal de flujo. Consideremos un
cromatografia de liquidos, en el que la columna tiene un diiimetro de 0,60 cm ,._....,.."'"
0,30 em) y la fase m6vil ocupa el 20% del volumen de la columna. Cada centflDl~~
longitud de la columna tiene un volumen de ('Trr2 X longitud) = '!T(0,30 cm)2(1
0,283 mL, de los cuaies el 20% (= 0,0565 mL) es fase m6vil (disolvente). El
este caso 0,30 mUmin, nos dice cuantos mL de- disolvente atraviesan la columna
minuto. La velocidad lineal de nujo nos dice cuantos centimetros recorre el ,1;." ........ ~~
dentro de la columna en un minuto. Como 1 em de columna contiene 0,05.9 5 mL de
m6vil, 0,30 mL ocuparian (0,30 mL)/(0,056 5 mL/cm) = 5,3 cm de columna. La
lineal de flujo que corresponde a 0,30 mUmin es 5,3 em/min.

El cromatog.rama
Los solutos eluidos de una columna croma((')griifica se observan con alguno de los
detectores que se describen en los capitulos siguientes,. Un cromatograma
es la
tacion de la-respuesta del detector en funci6n del tiempo de eludon. La figura 23.7
tra]o que podria observarse cuando una mezcla de octano, nonano y una muestra
cida se separan por cromat6grafia de gases, que se describe en el capitulo "iuuiClnlC\~~
tiempo de _retenc,ion, lp de un componente es el tiempo que transcurre desde la
de una mezcla en la columna hasta que ese componente llega a1 detector. La .
correspondiente,
volumen de retencion,
Vr, es el volumen de fase m6vil necesanl
eluir un soluto deterrninado de la columna.
La fase m6vil no retenida atraviesa la columna en el min~o
tiempo posi~le, ue
nado como tm El tiempo de retencion ajustado de un soluto es la difereoCUl en

23.3 Aspectos instrumentales de la

cromatografia

t;-------I

k--~------~------------__

t
Tiempo de

CH4

23.7

Figura
Cromatograma de gases esquematico que muestra c6mo se miden los tiempos
de retenci6n.

in ecci6n
Tiempo

--+

hemp<> que tarda un soluto en atravesar toda la columna y el que emplea un disolvente no

de retencion ajustado:

(23.14)

cromatografia de gases se considera habituaImente que tm es el tiempo necesario para

~ atraviese toda la columna (figura 23.7).
Si hay dos componentes, 1 y 2, la retencion relativa, ex,es el cociente de sus tiempos
de retencion ajustados.

Ct

t'r2
=-

(23.15)

t:,

1'(2 > I." y por tanto Ct > 1. Cuanto mayor es la retencion relariva, mayor es la sepat.1Cwn
entre los dos componentes. La retencion relativa es bastante independiente del cauy por consiguiente se puede usar como una ayuda para identificar los picos cuando se
~~~'jlIVllm;,~uvariaciones de caudal.
Para cada pico de un cromatograma se define el factor de capacidad, k', como

(23.16)

de capacidad:

EI factor de capacidad tarnbien se llama factor

de tetencion, raz6n de capacidad, 0 raz6n dereparto.

Cuantomas tiempo permanece un componente en la columna, mayor es su factor de capaPara controlar el funcionamieftlo de una columna determinada, una buena practica
medir periodicamente el factor de capacidad de un patron, el numero de platos (ecua23.28) y Ia asirnetrfa del pico (figura 23.13). Los cambios de estos parametres reflejan
degradacion de la columna.
.

--

Parametres de retendon

inyectaen un cromat6grafo de gases una mezcla de benceno, tolueno y metano. El metadio un pico muy agudo a los 42 segundos, mientras que el benceno tarda 251 segundos
en aparecer, y el tolueno 333 segundos. Hallar el tiempo de retencion ajustado y el factor
1
de capacidad de cada solute y la retencion relativa. .

.:WCION

Los tiempos de retencion ajustados son

Benceno: t;.

t, - tm

251 - 42

t: = 333 -

209 s

Tolueno:

Tolueno: k'

42

291 s

~ factores de capacidad son

Benceno: k'

tr -

= ---tm

tm

251 - 42
42

5,0

333 - 42
42

6,9

La retenci6n

relativa siempre se expresa mediante un nurnero mayor que I'

r,(tolueno)

333 - 42

r;(benceno)

251 - 42

a=

La definici6n

de capacidad

dada en la ecuaci6n

I 39
'

23.16 es equivalente

a dccir

tiempo que pa~a eI soluto en Ia fase estacionaria

k'
tiempo

que pas a el soluto en la fase m6vil

Veamos por que es asf, Si el soluto pasa todo su tiempo en la fase rnovil ~ nuda en I~ fa...:
estacionaria, se eluira, por definici6n, en un tiempo tJ11' Haciendo I,. = I", en la CI:UaL"il)n
23.16, resulta k' = 0, porque el soluto no esta nada en la fase estacionaria. SU[longamm que
el soluto pasa el mismo tiempo en la fase estacionaria que en la fase mcn il. En esc <':<1\0. el
tiempo de retenci6n sera t, = 2tm, Y k' = (2tm - tm)/tm = I. Si el soluto pasa tre-, vece-,m;i,
tiempo en ta fase estacionaria que en la fase m6vil, t, = 4 1m Y k' = (41111 - 1",)/1", = J
Si el soluto pasa tres veces mas tiempo en la fase estacionaria que en la rase Illli\ II.
habra el triple de moles de soluto en la fase estacionaria que en la fa\c 1110\"ilen un
momenta dado. EI cociente de la ecuaci6n 23.17 es equivalente a:
Tiempo

que pas a el soluto en la fase estacionaria

Tiempo

coeficiente

de particlon = K = _"

Cm

moles de soluto en 1<1fa,,~ cxtacionaria

moles de soluto en la ra~e In(h il

que pasa el soluto en la fase m6vil

donde Cs es la concentraci6n del soluto en la fase estacionaria.V, es el \ olumcn de la fao,c

estacionaria, Cm es la concentraci6n del soluto en la fase m6vil Y VOl es el volurncn de la
fase movil.
EI cociente C/Cm es el cociente de concentraciones
de soluto en la fa-.c C'iaeionana ~
m6vil. Si se trabaja con suficiente lentitud para que se alcance el equilibno, cl cocicmc
C/Cm es el coeficiente de reparto, K. introducido en el tema de extraccion e(\11disolvcntc
Por consiguiente. podemos transformar la ecuaci6n 23.18 en esta otra forma.

Relacion entre tiempo de

retencion y coeficiente de reparto:
que relaciona el tiempo de retencion
fases m6vil y estacionaria. Como

t;

k'

Vs

K-'

Vm

G(

Ec.23.16

t, - tm

I;

tm

Inl

con el coeficiente de reparto y 10, \ lllt.'lmene, de lak' cc K, la retencion relativa tarnbicn ,e puede exprc-

sar como
Fundamento f{sico de fa cromatograf{a.
Cuanto mayor es el cociente de coelicientes
de reparto entre la lase m6vil y la lase estacionaria, mayor es la separaci6n entre dos
componentes de una mezcla.

Retenci6n

relativa:

Esto es, la retenci6n relativa de dos solutos es proporcional al cociente de

de reparto. Este es el fundamento ffsico de la cromatograffa.

,U'" coelicienlt"

r:'

En el ejemplo anterior, el gas metano dio un pico agudo a 42 s, mientras que cl bencc~lO
cis6 251 s. La columna cromamgn'ifica tubular abierta tiene un diametro intenDr de 2=,0f.l r'
d 'pc,(l
Y esm recubierta en su eara interior con una capa de fase estacionaria de 1.0 fJ.i11 c~, . I
.
.
InO\I.
Estimar el coeficiente de reparto (K = C/Cm) del benceno entre la fase eSlncl(1lwna ~
y calcular la fracci6n de tiempo que el benceno pasa en la fase m6vil.

\!ecesitamos

calcular los volumenes relatives de las fases movil y estacionaria,

de fase estacionaria en su pared inte-

L~Ic'lliulill '1 cs un tuba abierto con un recubrimiento

ri(li'.

______Pared de la columna

----24<'

Area de la <eccion transversal

.m

J'

de la columna

= 1TI'T

1T! 12-1)1 = -1.83 X 104 iJ.1ll1

Area de lu seccion

transversal del recubrimienro

1-rrr::! X grueso
= 21T( 12-1.5) x (1.0) = 7.8 X 102 iJ.1ll1

RJdi,' J~ 1.1 ,.1\ iliad interior: 1'1 = 124 um

R.IJill 11<1,1" I centro de la fuse estacionaria:
r- = I :J.' urn

Lll, I'()ltililciles relatives de las fases son proporcionales

a las areas relativas de las secciotrun- \ cr-ales. porque cada fase se extiende por todo el tubo. Por tanto. VJV1I1 = (7.8 X
It!: jJ.IllC)/1 U)3 X 10" urn ') = 0.016 I. En el ejemplo anterior se vio que el factor de capa,'IJaJ del I .cnceno es
Ill"

t, -

till

= --

251 - 42

42

tm

5,0

Su,lilllYClidtleste valor en la ecuacion 23.19. resulta el coeficiente de reparto:

k'

V,
KVI11

=?

5,0

K(0,OI61)

K = 310

=?

Para hall.u' la fraccion de tiempo que pasa en la fase movil, se utili zan las ecuaciones 23.16
12J17:
A'

tiempo en la fase estacionaria

t, -

t;

till

=---=-

tiempo en la fase rnovil

t, = k'tlll

'111

donde I, c" cl tiernpo que pasa en la fase estacionaria.

till

La fraccion de tiempo que pasa en la

fN: mov il c,

Fracci6n de tiempo en la fase m6vil

k'
\'r)Il/ll/en

de retencion,

5,0

+ I

0,17

V" es el volurnen de fase rnovil necesario para eluir a un soluto

tJ~lcnnin;jdo de la columna.
\iJ/IIl1/ell de retencion:

V, =

tr'lIv

dnl1ueII, eS el caudal (volumen por unidad de tiempo) de la fase movil. EI volumen de

r~lenci(\11dt' Linsoluto determinado es constante en un amplio intervalo de caudales.

Del'rditlOlrio. las cromatograffas se hacen con fines anolificos (para separar e iclentificar
mediI' Ip\ componentes de una mezcla) 0 prepamtil'os (para purificar una cantidad signilicativ;t de un componente de una mezcla). La cromatograffa analftica normal mente se
reilliza t'llil columnas Im'gas y estrechas. Para conseguir una buena separacion en cromuIllgraffa preparativa. se Llsan columnas mas gruesas, que permiten mayores cargas
I,

Iflgura 23.8).

Si \c ha puesto a punto un procedimiento cromatografico para separar 2 mg de una

Illezcla ell una columna de un diametro de 1.0 cm, i,que tamano debe tener la columna para

Columna cromatografica preparativa a escala industrial, que puede purificar un

kilo de material. EI volumen de la columna es de
300 L. [Con autorizacion
de PROCHROM,
Inc.,
Indianapolis.

IN.]

23 lntrcdurdnn a las separaciones analiticas

separar 20 mg de mezcla? El modo mas directo de escalado es mantener la misma longifult

de columna y aumentar el area de secci6n transversal, a fin de mantener conslantc:eI
cociente entre la cantidad de muestra y el volumen de la columna. Como el area de la seo.
ci6n es -rrr2, siendo rei radio de la columna, el diametro buscado es

Reglas para un escalado:

Ecuacion de

mantener constante la longitud de la columna

area de la seccion transversal de la columna oc
masa del analito

escalado:

Masa mayor
Masa menor

rnasa,
(el simbolo

ex:

mantener constante
flujo:

a')

la velocidad lineal de

cabal,

(radiO mayor de cOlumna)2

radio menor de columna

(radiO mayor de COiUmna)2 _

2 mg

O,SOcm

radio

" de columna =
mayor

radio,

significa es 'proporcional

20 mg

masa2 = (rad~02)2

1,58 cm

Una columna de un diametro de alrededor de 3 em serfa la apropiada.

Para reprodueir la condiciones de la columna pequefia en una columna: mayor, se
mantener constante La velocidad lineal de flujo (no el caudal). Dado que en este ejemplo
area (y por tanto el volumen) de la columna mayor es 10 veces mayor que la de 13 columna
pequefia en este ejemplo, el caudal debe ser 10 veces mayor para mantener COD stante .Ii
velocidad lineal de flujo. Si la columna pequefia tuviera un caudal de 0,3 mUmin. 01
columna mayor deberia ser de 3 mUmin.

masa,

volumen de muestra aplicada a la columna oc

masa del analito

Dos faetores determinan ~l~grado con que se pueden separar los compuestos por cromll~;;,
grafia. Uno es la diferencia de tiempos de eluci6n de los respectivos picos: cuanto mas
tantes sean, mejor sera la separaci6n. El otro factor es la anchura de los picos: cuanto
anchos sean los picos, peor sera la separaei6n. Este apartado explica e6mo medir 18
cia de una separaei6n.

Resoludon
1

Al pasar p~r la columna cromatografica, los solutos tienden a difundirse segun una
siana, de desviaci6n estandar o (figura 23.9). Cuanto mas tiempo pasa el soluto

ell

\I
1\
I

.. 'I.
Punto de inflexi6n (Ia
poreion de la curva de

mayor pendiente)

~-----

1=0

Tiempo 0 volumen

W=

4(; ~----_.,

(inyeccion)

Figura 23. 9

Cromatograma ideal gaussiano, donde se muestra como S9 mide wy Wll2' EI

de w se obtiene extrapolando las tangentes en los puntos de inflexion hasta ta linea base.

_____________

_J

23.4 Eficacia de separacton

1-

2<1---1
1-3<1-1
Resoluci6n
=0,50

Resoluci6n
=0,75
\
\

I
\

/
/

I---

4<1-----1

-----

6<1----+-1

Besolucton

Resolucion
= 1,50

= 1,00
"iii
,,:::
OJ

C/l

'"
Tiempo-

Tiempo-

Resoluci6n de picos gaussianos de igual area y ampfltud. Las lineas a trazos

~\"IIIlIl!Serltan picos individuales, y las lineas continuas, suma de dOs picas. Las areas solapadas

rayadas.

.:Tt.....

m."" mas ancha se hace la banda. Las formas habituales de medir la anchura de banda
(I) la anchura Win, medida a una altura igual a a1 mitad de la altura del pico, y (2) la
en la base w, medida entre los cortes de las tangentes trazadas en los flancos de
pendiente. A partir de la ecuaci6n 4-3 de un pico gaussiano

= 2,35 a

En

y W =

cromatograffa

se puede demostrar

que

4a.
se define la resolucton entre dos picos como

.,

Resolucion

D.tr

=-

/1Vr
= --

wm

wm

0,589Llt,

= ---~

(23.23)

wll2m

00nde

illr 0 il V, es la separacion entre los picos (en unidades de tiempo 0 de volumen), y

"'. es 1a media de las anchuras de los picos en las unidades correspondientes.
(La anchura
de los picos se rnide en la base, como se indica en la figura 23.9.) La figura 23.10 muestra
II solapamiento de dos picos con diferentes grados de resolucion. En analisis cuantitativo,
muy conveniente que la resoluci6n sea> 1,5.

Resolucion

Illr

=-

wm

424 - 407

~(13

+ 16)

1,17

}6D

23 Introduction a las separaciones analiticas

/Columna

Principio

-u._~

------...:..::,!

_--=+"-'-----!

_!_

_I

/\
Perfil de concentraci6n

Fig ra 23.11

u
Ensanchamiento de una banda, que es estrecha al principio, a medida
viesa una columna crornatoqraftca,
.

que

Difusi6n
..~

r~

La ecuacjon 23.24 se llama primer a ley de difusi6n de Fick. Si se expresa la concentraclon en

moUm3, ~as unidades ~e D son m2/s.

La banda de un soluto se ensancha a medida que atraviesa la columna crc'm~ltll:nlll!l'

Idealmente, se aplica una banda infinitamente estrecha a la entrada de la columna y _.:..a.;:,.""
con una distribucion gaussiana a su salida (figura 23.11). En circunstancias menos '.I__
,_.,.,.,.'.>'
la banda se hace asimetrica.
Una causa importante del ensanchamiento
de banda es la difusuin. EI coefidenct
difusi6n rnide la velocidad a que se mueve al azar una sustancia desde una regi6e
mayor concentracion a otra de menor concentracion, La figura 23.12 muestra la ~:4'...:.l.c.L'.'.',!~
espontanea de un soluto a traves de un plano con un gradiente de concentracion
mimero de moles que atraviesa un metro cuadrado por segundo, llamado flujo (J) es
porcional al gradiente de concentraciones:

Definicion de
coeficiente de difusion:

.
Flujo

(mOl)
m2.s

"'" J

de
-D dx

La

constante de proporcionalidad
(D) es el coeficiente de difusion, y el signa
indica que el flujo se produce de la region de mayor concentracion a la de menor COIIeIIiIISfi(.
traci6n. En la tabla 23.1 figuran algunos coeficientes de difusion representatives. La
sion en liquidos es 1()4 veces menor que la difusion en gases. Las macromoleculas, co;lIO~~;'~i
ribonucleasa y la albumina, se difunden a una velocidad de 10 100 veces menor'l-'::'r.':...,.,.,I',
moleculas pequeiias.

Concentraci6n
alta

Concentracf6n
baja

(Tabla 23.1

I Coeficlentes

Soluto
Flujo=

H2O
Sacarosa
Glicina

moles por m2
porsegundo

CHPH
Ribonucleasa
(MF 13 7(0)

-.

Posici6n = x
Concentraci6n

Figura 23.12

=c

Albiimina de suero
(MF 65 000)
x+ dx
c-dc

EI flujo de las moleculas que se

difunden a traves de un plano de area unidad es
proporcional al gradiente de concentraci6n y al
coeficiente de difusi6n: J = -D(dddx).

12

CCI4
N2
CS2(g)
2(g)
H+
OH-

uNa+
K+
CI-

I-

de difusi6n representativos
Disolvente
H2O
H2O
H2O
H20' H20 (293 K)
H20 (293 K)

Hexane
.Heptano
CC14
Aire (293 K)
Aire (273 K)
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O
H2O

a 298 K
Coeficiente de difusion
2,3 x 10-9
0,52 X 10-9
1,1 X 10-9

10-9

' 1,6

0,12

x 10-9

0,059 X 10-9

4,0

10-9
10-9

3,2 X
3,4 X 10-9
1,0 X 10-5

10-5

1,8

9,3
5,3
1,0
1,3
2,0
2,0
2,0

X 10-9
X 10-9
10-9

X 10-9
X 10-9
X 10-9
X 10-9

Si un .luto ernpieza a pasar por la columna en forma de una capa infinitarnenre estreJc /II Ill' ,It:" por unidad de area de secci6n transversal de la columna. y se dispersa por
\ "lnisnll1 de difusi6n a rnedida que atraviesa la columna. el perfil gaussiano de la banda
nl(p'~cde(.k,LTibir mediante la ecuaci6n
'h,1

,(

i/)(iJlcll(/lIII~'l/t()

,r(l/llll/(lgl'tlil(,(1

de la ba~,eI{/
par d!fuSIOI1:

JllllJc c es II concentracion (rnol/rn'). / es riernpo, y x distancia a 10 largo de la columna a

j[lir del (,:nlro real de la banda. (EI centro de la banda siernpre es x = 0 en esta ecuaci6n.)
~lli11parand" las ecuaciones 23.5 y 4-3 se ve que la desviaci6n estandar de la banda es
DC\\'i(lcio/l

vandar de la banda:

(J

V2iSi

La anchura de banda es 7. vi, Si el tiempo de

elucion aumenta en un factor de 4, la difusion
ensanchara la banda en un factor de 2.

,._
L.! c(uaciLin 23,26 nos dice que la desviaci6n

JIfw,i<in vale
lineal II, (Ill"

estandar del ensanchamiento de la banda por

Si un soluto ha recorrido una distancia x a una velocidad de f1ujo
I. el tiempo que ha estado en la columna es t = x/ux. Por tanto.

-ru.

a2

= 2Dr = 2D!_ = (2D)x

= Hx

u;

ii,

t
Altura de plato

== H

La altura de plato es la constante de proporcionalidad entre la varianza (a2) de la

banda y la di-tuncia que ha recorrido (x). EI nombre esta tomado de la teorfa de destilacion,
en la que 1.1 <eparacion se Ileva a cabo en pasos discretos Ilamados platos. La altura de
plJIOtalllril.'ll se Llama altura equivaienre a 1111 plato teorico , En cromatograffa no existen
.plalo,>" ri'lco~,de manera que se debe considerar la altura de plato como un [ermino que
rd:lL'iona 1,1 anchura de una banda con la distancia que ha recorrido a traves de la columna.
CIIWI/O

111<11

Uv

u.

= caudal (volumen/tiempo)

= velocidad

lineal de flujo (distancialtiempo)

EI terrnino altura de plato procede de la teoria

de separaciones
por destilacion. Algunas
columnas de destllacion de gran eficacia se
construyen por medio de unidades discretas lIamadas platos, en cada uno de las cuales se
alcanza el equilibrio entre las fases liquida y
vapor. Siendo aun un adolescente, A. J. P
Martin, coinventor de la cromatografia de reparto, construyo columnas de destilaci6n de varios
pisos con botes de cafe. (No sabemos 10 que
destilaba.) Cuando formul6 la teoria de la cromatografia de reparto, adopt6 terminos de la
teoria de destilaci6n.

I)u/llella es la altura de plaTO, mas esrrechll es la hanc/a.

La eapat.:idad de una columna para separar componentes de una mezcJa rnejora al disminuir la altura de plato. Decimos que Ulla columna eficaz tiene mas platos te6ricos que
una colUllllla ineticaz, Los distintos solutos que pasan a traves de una misma columna tienl'n lIifel'l.:ntcs alturas de plato, porque tienen diferentes coeficientes de difusi6n. Las altur:1\lie pIal" I:!ncromatograffa de gases valen entre 0, I Y I mm, en cromatograffa de JfquiJo, de alIa dicacia (HPLC) valen aproximadamente
10 J.Lm, yen electroforesis capilar,
nl.:nosde I J.L1ll.
La altura de plato es la longitud a2/x, donde a es la desviacion estandar de la banda
~au~,ii1nlllit.: la tigura 23.9, y x es la distancia recorrida a traves de la columna. Para un
,oIUIOqUt' ,ale de una columna de longitud L. el numero de platos te6ricos (N) en toda la
cnlumna e, la longitud L dividida por la altura de plato:
L

Lx

N=-=-=-=H
a1
a1

Una pequena altura de plato da lugar a

picas estrechos, y esto permite mejores
separaciones.

16U
IV1

p(lrque.\ '- L Y u = w/4. En esta expresi6n, w tiene unidades de longitud y el numero de

plalos e, ,ldimensional. Si expresamos L y w (0 a) en unidades de tiempo en lugar de longilull,N lodavfa es adimensionaL Se obtiene la expresi6n mas uti I de N de la siguiente forma

\lIlIIero

de plafos en IIna columlla:

16~~ =
w-

f~?)

a-

donde I, r, el tiempo de retencion del pico y IV es la anchura en la base en la figura 23.9 ell
IlIlidade.1 de fiempo. Si usamos la anchura a la mitad de altura en lugar de la anchura en la
base. re"lilla
\'Iimero de platos en una columna:

5,55t~
N=-wT/2

Escoger un pica con factor de capacidad mayor

que 5, cuando se miden alturas de plato de una
columna,
Si N es constante,
demostrar que la anchura de un pica cromatogratico aumenta al aumentar el tiempo de retencion, Es decir, los picas sucesivos de un cromatograma se deben hacer cada vez mas anchos.

23 lntraducden a las separadones analiticas

Figura 23.13 Pica asirnetrtco,

que muestra los parametres que se
usan para estimar el nurnsro de platos te6ricos.

t,
TIempo_

Medida de numero de platos

Un soluto con un tiempo de retenci6n de 407 s tiene una anchura en la base de 13 sen
columna de 12,2 m de longitud. Hallar el mimero de platos y la altura de plato.

SOlUCION
N

16t2

_r
w2

=N =

132

1,57 X 1()4

12,2m

16.4072

-1,-57-X-l()4-

0,78 rom

Para estimar el mimero de platos te6ricos de un pico asimetrico, como el de la

23.13, trazar una linea horizontal a traves de la banda a 1110 de la altura maxima. Las
tidades A y B se pueden medir, y el mimerc de platos es3
Se deben medir todas las cantidades en las rnismas unidades, en minutos, 0 en centimetros del
papal de registrador.

N='

41,7(t/wo
AlB

donde

wO,1

1)2

1,25

es la anchura a 1110 de la altura (= A

B)

Factores que influyen en la resoluci6n

Cuanto mayor es la resoluci6n (ecuaci6n 23..23), mejor es la separaci6n
relaci6n entre el mimero de platos de una columna y la resoluci6n es

La ecuaclen 23.30 es equivalente a

..
reso IuClon
= -VN( "Y 4

ex

\IN

ex

V[

VN(ex-ex-=4

f)(

1)

donde "Y es el cociente de velocidades (m/s) de

los dos solutos a traves de la columna. Esta
forma alternativa de la ecuaci6n se trata en el
apartado 26.5.

resoluci6n

Resoluci6n

donde N es el mimero de platos te6ricos en la columna,

+k2J<., )

entre dos

,/

exes la retenci6n

relativa de 10&

k2

picos (ecuacion 23.15),

es el factor de capacidad del coniponente mas retenido
ci6n 23.16) y k~ es la media de los factores de capacidad de ambos componentes.
mimero de platos de dos picos no es el mismo, por ejemplo, NI y N2, hay que
por

Vii;ii;. y k2 por k:r,

Un rasgo importante de la ecuaci6n 23.30 es que la resoluci6n es proporcional a

Por tanto, duplicando la longitud de la columna la resolucion aumenta ell
La
23.14 muestra la influencia de la longitud de la columna en la separaci6n entre Ja
Janina de la t-fenilalanina-D, (tabla ILl), que tiene cinco atomos de deuterio en eI8Jlll'!.';SillJ.,:;,.1

Vi fiB1l1R,!jr~.

aromarico. La mezcla se pas6 a traves de un par de columnas de cromatografia de

mediante un sistema ingenioso de valvulas, que reciclaban la mezcla una y otra va a
ves de las mismas dos columnas. Despues de un paso en la figura 23.14, el tiempO
retencion relative,
es solarnente 1,03. Despues de 15 pasos, se consigui6 1.a
.' '"
hasta la linea base. El detalle de la figura 23.14 muestra que el cuadrado de la resOluclOll
proporcional aI ruimero de pasos, como predice la ecuaci6n 23.30.

ex,

_________________________________
- _J

23.5 lPor.que se ensanchan las bandas?

00

o
o

2
3

Phe-Ds

23.14

Figura
Separaci6n de L-fenilalanina
0,5 mM y t-fenilanatlna-D,
0,5 mM despues de
repetidos ciclos en un par de eolumnas Hypersil
C8 por eromatografia Ifquida (25 em x 4,6 mm),
eluidas con una mezela 10:90 aeetonitrilo:agua
como eluyente.
EI aqua contenia
Na2S04
25 mM y 0,1% de acldo trifluoroacetlco . [Tomado
de K. LAN Y J. W. JORGENSEN, -Pressure-mduced
Retention Variations in Reversed-F'hase AlternatePumping Recycle Chromatography, Anal. Chern.,
1998, 70,2773.)

Numero de pasos

5
5

10

15

10

La ecuaci6n 23.30 nos dice tambien que la resoluci6n aumenta al aumentar (1, y asimismo al aumentar el factor k Para cambiar la retenci6n relativa, (1, hay que cambiar la
f1Se estacionaria en cromatografia de gases 0 bien la fase estacionaria y la fase m6vil en
cromatografia de lfquidos. Recordemos que (1 esta relacionada con los coeficientes ge
repruto de los dos solutos en las dos fases .(ecua~i6n 23.20). Por eso al cambiar la naturafaa de las fases se cambia (1. Un aumento del factor de capacidad, k2" tambien determina
aumento de resoluci6n. Aumentar el factor de capacidad es equivalente a aumentar la
frac.ci6nde tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria, Hay un limite practice de
aumento del factor de capacidad, porque los tiempos de retencion se hacen demasiado
A1!rnnldesy los picos demasiado anchos. En la tabla 23.2 se resumen las ecuaciones
uneortaates en cromatografia.

2.

mas

Platos necesarios para una resolution dada

.:

Dos solutes tienen una retenci6n relativa (1 = 1,08 y tienen los factores de capacidad k~ =
Yk2 =; 5,4. El mimero de platos te6ricos es practicamente el mismo para ambos comi,Cuantos platos se necesitan

para tener una resoluci6n

de 1,5? i,Y para una reso-

lucian de 3>O? Si la altura de plato es 0,20 mm, i,que longitud debe tener la columna para
IIIlaresoluci6n de 1,5?
Usando la ecuaci6n 23.30 resulta:

Resolucion
.

1.5

VN(I,08
- 1)(
5,4 )
4
1,08
1 + 5,2

Para duplicar la resoluciona Sf) se

una resolucion de 1,5, la longitud
(S,6s X 1()3 platos) =1,73 m.

=> N

8,65 X 103 platos

requeririan 4 veces mas platos = 3,46 X 1()4platos. Para

de columna que se neeesitarfa sena (0,20 mmlplato)

se ensanchan las bandas?4

La banda

de un soluto se ensancha inexorablemente

a medida que recorre una columna en
(figtu:a 23.11), y llega al detector con una desviaci6n estandar 0'. Cada
lIllO:delos mecanismos ~duales
que contribuyen al ensanchamiento
produce una desviaci6n estandar 0';. La varianci--ob_zyrvada (O'~bs) es la suma de las varianzas de todos los
IIlecanismos:

una cromatografia

La varianza es aditiva:

(23.31)

La varianza
estandar,

es aditiva,

pero no la desviaci6n

23 Introduccion a las separaciones analiticas

(Tabla 23.2

I Resumen

de ecuaciones cromatograficas

Magnitud
/ Coeficiente
vTiempo

Ecuacion
de reparto

de retenci6n

Volumen de retenci6n

V Factor

Parametres

de capacidad

Cs = Concentraci6n
Cm = Concentraci6n

t, = Tiempo de retenci6n del soluto que interesa

tm = Tiempo de retenci6n del solute no retenido
u. = Caudal = Volumenlunidad de tiempo
V. = Volumen de fase estacionaria

ajustado

Vr = t.-u;
k' = t;ltm = KV.rV

de soluto en la fase estacio~

de soluto en fase m6vil

Vm = Volumen de fase m6vil

Is

= Tiempo que pas a el soluto en la fase eSUtCIolnariii

::;;,

tm = Tiempo que pasa el soluto en la fase m6vil

Retenci6n

relativa

Niimero de platos

t;2

kz

K2

t;J

k;.

KJ

a=-=-=-

16t;
5.55t;
N=-=-w2

(j2

Altura de plato

Los subindices

H=-=-

1 y 2 se refieren ados

solutes

'

w = Anchura

wIn

en la base
a rnitad de altura

wJn = Anchura

L
rr = Desviaci6n

estandar deJabanda

x = Distancia recorrida por el centro de la banda

L = Longitud de columna
N = Ntimero de platos de la columna

Resoluci6n

Resoluci6n

At,

=-

Wm

AV,

= --

At, = Diferencia de tiempos de retenci6n

A V, = Diferencia de vohimenes de retencion

Wm

wm
Resoluci6n

VN (--)
a-I
= -4
a

k2 )

( --I+k:n

= Anchura

media medida en la base en las ~

unidades que el numerador (tiempo 0 VUlIU"""

Niimero de platos

= Retencion
'kz = Factor de
a

k:n =

relativa

capacidad del segundo pico

Media de factores de capacidad

Ensanchamtento fuera de la columna

Algunos factores independientes de la columna contribuyen al ensanchamiento. Por
plo, los solutos no se pueden aplicar a la columna en forma de una zona infinitameote
de modo que la banda tiene una anchura. finita incluso antes de entrar en la columna. SI
banda se aplica comb un segmento de anchura At (medida en unidades de tiempo), su
tribuci6n a la varianza de la anchura de banda final es

Varianza deb ida a La

inyeccion

deteccion:

(J'2
inyecci6n

(J'2
detector

---

(At)2
12

Una relaci6n igual es valida para el ensanchamiento

en el detector, que exige un tiernpo
para que la muestra pase a traves de el. A veces es posible hacer la detecci6n en la
columna, y entonces se elirnina el ensancharniento de banda causado por un detector ~
rado.

Ensanchamiento de banda antes y despues de la columna

a::

Una banda que sale de una columna a un caudal de 1,35 mUmin tiene una aochura
de altura de 16,3 segundos. La muestra se aplic6 en forma de un pequefio segrne_n~
volumen de 0,30 mL, Y el volumen del detector es 0,20 mL. Hallar las varianzas 10
sail"
das en la inyecci6n y en la detecci6n. l,CuaJ sena la anchura a la mitad de altura si el en
chamiento ocurriese s610 en la columna?
.

ill)
La figura 23.9 nos dice que la anchura a mitad de altura vale win = 2,35a. Por
la varianza total observada es

a~bs =

WI/?)2
( 2,35

(163)2
2,;5

48,11 82

cOlltribucion de la inyeccion es afnyecci6n = (~mnyecci6n/l2. El tiempo de inyeccion

= (0,30 mL)/(J,35 mL/~in) = 0,222 min = 13,3 s por tanto,

,....,......

23.5 (Par que se ensanchan las bandas?

es

'~~

a2

inyeccidn

11(1

'6
myecc. n

12

13 3
= _'_
= 148182
2

12

'

t"J1l1ilogarnelue,el tiempo pasado en el detector es ~tdetector= (0,20 mL)/(1,35

s yaJeteclor = (At)aetector 112 = 6,58 S2. La varianza observada es
2-2
a obs
- a columna+2 a inyecciou

48,11 = a~olumna + 14,81

+2

a detector

'*

6,58

mL/min)

acolumna = 5,17 s

anchura debida al ensancharniento de columna es wll2 = 3,5 acoluinna= 12,1 segundos,

aproximadamente es igual a tres cuartos de la anchura observada.

EI peor ensanchamiento de banda que se puede dar se debe al gran espacio muerto que
pueden tener algunas columnas preparadas en el propio laboratorio, en cuyo caso cada
gota que sale de la columna se rnezcla con un volumen significativo de eluato que ya
wste en el espacio muerto de la columna. Para minimizar el ensanchamiento de banda, se
minimizar los espacios muertos y la longitud de los tubos. Las rnuestras se deben
i!tl.'..'1"~unifonnemente en forma de una zona estrecha, y haeerlos entrar en la columna
de mezclar con el eluyente,

de altura de plato '

altura de plato (ll) es proporcional ala varianza de la banda cromatografica
(ecuacion
2317). Cuanto menor es la altura de plato, mas estrecha es la banda. La ecuacion de
JIID Deemter nos dice como influye la columna y la velocidad de flujo en la altura de
plato: .
"
.
.

ul,laCi6n de van Deemter

fa altura de plato:

B
u~

7'

Caminos
multiples

Difusi6n
longitudinal

CUx_

,.

(23.33)

<,
Tiernpo
de equilibro

donde u..c es la velocidad lineal de flujo y A, B Y C son constantes para una columna y una
estacionaria dadas. Al cambiar la columna y la fase estacionaria, cambian los valores
A, B y C. La ecuacion de van Deemter nos dice que existen mecanismos de ensanchallliento de banda que son proporcionales a la velocidad de flujo, otros inversamente prorV"-LV"i:U\;:S
a la velocidad de flujo, y finalmente otros independientes
de la velocidad
13).
En las- columnas ernpaquetadas, todos estos terminos contribuyen al ensanchamiento
de banda. En columnas tubulares abiertas, el termino de camino multiple (A) es 0, de
lIlanera que el ancho de banda disrninuye y la resolucion aumenta. En electroforesis capiJar (capitulo 26), tanto A como C tienden a 0, reduciendose asf la altura de plato a valores
!lOr debajo de una micra y permitiendo separaciones extraordinarias.

lase

Columnas empaquetadas: A, B, C
0
Columnas tubulares abiertas: A = 0
Electroforesis capilar: A = C = 0

23 lntreduccidn a las separaciones analiticas

10

9
8

, ,

A+ -

Ux

Figura 23.15 Aplicaci6n de la ecuaci6n

de van Deemter a la cromatografia de
gases. Los parametres de la ecuaci6n de
van Deemter son A = 1,65 mm, B = 25,8
mm . mUmin. y C = 0,023 6 mm . minlmL.
[Los puntos experimentales
in the van

Deemter

- - - -\: - - - - - - - - - - ~.,:.;----\-6amiriOSlI'- .....

"',
-

son datos tom ados

H. W. MooDY, The Evaluation

+ Cu.

_-

--y-- -

->

'1'Ei'i

Dilusi6n

/Iongitudlnal

------

01 the Parameters

Equation-,

J. Chem.

cd.,

1982, 59,290.J

Velocidad de Ilujo (mLlmin)

Difusi6n longitudinal
Si se aplicase una fina banda de soluto, en forma de disco, en el centro de la colum.~.
banda se ensancharfa lentamente a medida que las molecules difunden desde la
mayor concentracion dentro de Ia banda hacia regiones de menor concentraci6n en
des de la misma. Este ensanchamiento por difusi6n de una banda se llama difusiOn
tudinaI, porque la difusi6n tiene lugar a 10 largo del eje de la columna, y
.--~''':.
toda la banda pasa a 10 largo de la columna por el flujo del disolvente (figura 23.16).
EI termino Btu; de la ecuaci6n 23.33 se debe a la difusi6n longitudinal.
rapido es el flujo lineal, menos tiempo pasa en la columna, y menor en:,anch,unieneUI~lk~1
produce por difusi6n. La ecuaci6n 23.26 nos dice que la varianza debida a la

l'CI~.:~1j

Dado que la difusi6n longitudinal en un gas es

mucho mas raplda que la difusi6n en un liquido,
la velocidad de flujo 6ptimo en cromatografia de
gases es mayor que en cromatografia de liquidos.

(J'2 =

Altura de plato debida a

la difusion longitudinal:

2D t
m

(J'2

2DmL

=--

2Dm

HD=-=--=L
Ux

Figura 23.16 La difusi6n longitudinal origina el termino Blux en la ecuaci6n de van

Deemter. EI soluto se difunde continuamente
desde el centro concentrado de su zona.
Cuanto mayor es la velocidad de flujo, menos
tiempo pasa en la columna, y menor es la difusi6n longitudinal.

B
Ux

pasar

Zona de soluto despues de

mucho tiempo en la columna

Direcci6n de paso

donde Dm es el coeficiente de difusion del soluto en La fase movil, t es el tiempo y HD es la

de plato debida a la difusi6n longitudinal. El tiempo necesario para recorrer la longituG de la columna es Uu, donde L es la longitud de la columna y It, es la velocidad lineal

23.5 tPor que se ensanrhan las bandas?

altura

de flujo.

Tiempo finitn de equilibrado entre las fases

EI termino CUx- de la ecuacion 23.33 se debe al tiempo finito que necesita el soluto para
alcal1Zar el equilibro entre las fases rnovil y estacionaria. Aunque algo de soluto se queda
epla fase estacionaria,

el resto, que se encuentra

en la fase movil, avanza, y de ahi resulta

un ensancharniento de toda la zona (figura 23.17).

La altura de plato debida al tiempo finito de equilibrado,

It uansjerenci_:!.de masa,

tambien !lamado el termino

Cs

C=

2k'

d2

3(k'

1)2 Ds

1 + 6k'

llk'2

24(k'

1)2

(23.35a)

r2

Dm

(23.35b)

donde k' es el factor de capacidad, d es el espesor de la fase estacionaria y D. es el coeficiente de difusion del soluto en la fase estacionaria. AI disminuir el grosor de la fase estacionaria (tf) disminuye la altura de plato debida a transferencia de masa, y aumenta la eficacia, debido a que el soluto puede difundirse mas rapidamente desde las partes mas
II'OJfuociasde la fase estaeionaria haeia la fase movil. AI disminuir el radio de la columna
(r) se reduce la altura de plato, porque disminuye la distancia que debe reeorrer el soluto
por difusion hasta alcanzar la fase estacionaria.
La altura de plato debida a la transferencia de masa disminuye tambien aumentando la
temperatura, porque aumenta el coeficiente de difusion del soluto en la fase estacionaria. En
figura 23.18, un aumento de temperatura permite que la velocidad lineal de flujo aumente
en un factor de 5 ntientras se mantiene eonstante la resolucion. Esto es posible porque a
ttmperatura elevada aumenta la velocidad de transferencia de masa entre las fases.

3
4
2

0,4

0,6

0,8

Equilibrio lento
(CUx)

(23.35)

donde C, es la velocidad de transferencia de masa a traves de la fase estacionaria y Cm es

Ja rransferencia de masa a traves de la fase movil, Las ecuaciones concretas para Cs Y Cm
dependen del tipo de cromatografia.
En cromatografia de gases usando una columna tubular abierta, los terminos son

0,2

Anchura de banda

es

Altura de plato debido al

tiempo finito de equilibrado:

l00C
5mLlmin

Fase
estacionaria

4
30C
1 mLlmin

369
Tiemoo (min)

12

Figura 23.18 Cromatograffa Ifquida, donde se

muestra la disminuci6n del tiempo de analisis con
resoluci6n constante cuando se eleva la temperatura de 30 C a 100 C. 1, uracilo; 2, p-nitroanilina;
3, benzoato de metilo; 4, fenetol; 5, tolueno. La
columna de diametro 4,6 mm x 100 em de long itud esta empaquetada con 6xido de cireonio de un
tamano de partfculas de 4,5 IJ.m, recubiertas con
un 2,1% de polibutadieno. La eluci6n se hizo con
acetonitrilo, al 20% en volumen, en agua. [Tomado
de J. LI, Y.Hu Y P. W. CARR,"Fast Separations at Elevated
Temperatures on Polybutadiene-Coated
Zirconia
ReversedPhase Material .., Anal. Chem., 1997, 69,
3884.] En fases estacionarias basadas en sllice, la
temperatura se mantiene normal mente por debajo de 60 C para evitar la hidr6lisis de la sllice.

Anchura de banda
despuas de un
cierto recorrido

Figura 23.17 EI tiempo finito que necesita el

soluto para lIegar al equilibrio entre las fases
m6vil y estacionaria origina el terrnino Cu, de la
ecuaci6n de van Deemter. Cuanto mas lento es
el flujo lineal, mas complete as el equilibrio, y
menor es el ensanehamiento.

23 lntroducdon a las separadones analiticas

nempo

__

eua.-

Figura 23.19

Ensanchamiento de banda a causa de los multiples caminos del flujo.

menores son las partfculas de la fase estacionaria, menos serio es este problema. Este
chamiento no existe en columnas tubulares abiertas. [Adaptado de H. M. McNAIR Y E. J. 6oNw.J,
Gas Chromatography

Anteriormente

al terrnino A se Ie solia liamar

(Palo Alto, CA: Varian Instrument

Division, 1968).]

Caminos multiples del flujo

difusi6n turbulenta.

El termino A de la ecuaci6n de van Deemter (ecuaci6n 23.33) se debe.a multiples ~"'_ ., ..,,~
sobre las cuales no. existe una teorfa clara, La figura 23.19 es una explicaci6n gr8tica
una de ellas. Dado. que algunos caminos de flujo son mas largos que otros, las mollecu.
que entran en la columna a un mismo tiempo por la izquierda se eluyen a diferentes
PDS por la derecha. Por simplicidad, se engloban diversos fenomenos en la constame A
Ia ecuaci6n.
Comparada con columnas empaquetadas,
columnas tubulares abiertas pueden dar:

las

1. Mayor resoluci6n

2. Menor tiempo de analisis

3. Mayor sensibilidad
4. Menor capacidad de muestra

Para una presi6n dada, el caudal es proporcional a la secci6n transversal de la columna e

inversamente proporcional a su longitud:
caudal

ex ---

area

longitud

Las columnas tubulares abiertas, comparadas

con las empaquetadas, permiten:
1. Mayor velocidad lineal de flujo 0 columnas

mas largas.
2. Menores alturas de plato, 10 que significa
mejor resoluci6n.

Ventajas de las columnas tubulares abiertas

En cromatografia de gases se pueden usar columnas tubulares abiert.as 0 colnmnas ~,_.,.,"",,""
quetadas. Para tiempos parecidos de analisis, las columnas tubulares abiertas dan
resoluci6n y mayor sensibilidad a pequefias cantidades de analito. Las columnas tubula",,'
abiert.as tienen rnenos capacidad de muestra, pDr 10. que no son utiles en separaciones
parativas.
I
Las particulas en una columna empaquetada se oponen al flujo de la fase m6vil,
que la velocidad lineal de flujo no puede ser muy rapida. Para una misma
columna y presi6n aplicada, la velocidad lineal de flujo en una columna tubular
mucho mayor que en una columna empaquetada. PDr tanto, una columna tubular
puede ser 100 veces mas larga que la columna empaquetada, para una caida de presioo
velocidad lineal de flujo semejantes. Si la altura de plato es la misma, la columna mas
da 100 veces mas platos te6ricos, y proporciona una resolucion mucho mayor.
La altura de plato se reduce en una columna tubular abierta, porque no existe
bucion de caminos multiples de flujo al ensancharniento
de banda (figura 23.19). En
curva de van Deemter para una columna empaquetada, como. se ve en la figura 23.15.
termino A representa la mitad de la altura de plato para Ia velocidad de flujo 6ptima
minima), que es pr6xima a 30 mUmin. Si no existiera el termino A, el numero de plalO5
la columna se duplicaria. Para obtener un gran rendimiento con una COIUDlOa k.",.'''' '.'J,",
abierta, el radio. de la columna debe ser pequeno y la fase estacionaria debe ser ran ~
como sea posible, para asegurar un rapido intercambio de soluto entre las fases m6vi11
estacionaria.

Longitud de columna, L
Velocidad lineal de gas
Altura de plato para el oleato de metilD
FactDr de capacidad, k', para el oleato de metilo
Platos te6ricos, N
Resoluci6n del estearatD de metilo y del oleato de metilo
Tiempo de retenci6n del Dleato de metilD

2,4

8 cmls
0,73 mm
58,6
3290
1,5
29,8 min

23.5 ,Por que se ensanchan las bandas?

La tabla 23.3 compara la eficacia de columnas empaquetadas y tubulares abiertas en

rnatograffa de gases usando la misma fase estacionaria. Para tiempos de analisis simila~ la columna tubular abierta da una resolucion siete veces mejor (10,6 frente a 1,5) que el
columna empaquetada. 0 bien, se podria mejorar la velocidad perdiendo resoluci6n. Si
Ja cOlumna tubular abierta se redujera de longitud a 5 m, los mismos solutos podrian separ~ con una resoluci6n de 1,5, pero el tiempo se reduciria de 38,5 a 0,83 minutos.

;ia

Untoque de realismo: bandas asimetncas

LaS bandas tienen forma gaussiana cuando el coeficiente de reparto, K (= CICm), es inde~diente de la concentraci6n del soluto en la columna. En las columnas reales, cuando la
concentraci6n del soluto aumenta, K varia, y las bandas se distorsionan>, La representaci6n
de C$ en funcion de Cm (a una temperatura dada) se llama isoterma. En la figura 23.20 se
81uestran tres isotermas comunes y la forma de las bandas que resultan. La isoterma del
centro es la ideal, que origina un pico simetrico.
J..a-jsoterma superior de la figura 23.20 se produce por sobrecarga de la columna, es
decir. por aplicarle demasiado soluto. A medida que aumenta la concentraci6n del soluto, se
va soJubilizando cada vez
en Ia fase estacionaria. LJega a haber tanto soluto en la fase
CS(aCionariaque esta empieza a parecerse al sol uta. (Existe una regla empirica en quimica
qut dice que 10 semejante se disuelve en 10 sernejante.) El frente de un pico sobrecargado
pesenta una concentraci6n sucesivamente creciente. A1 aumentar la concentraci6n, la banda
sesobrecarga. EJ soluto es tan soluble en la zona sobrecargada, que apenas queda ya nada de
despues del pico. La banda emerge de la columna gradualmente, pero acaba bruscamente.
La isoterma inferior de la figura 23.20 se origina cuando cantidades pequefias de
.IOlutose retienen con mas fuerza que cantidades grandes. Eso conduce a una sub ida brusca
dr concentraci6n al principio de la banda, y a una larga cola de concentraci6n con desIISO gradual de la concentraci6n despues del pico.
Los puntos que interaccionan con fuerza con el soluto originan colas. En cromatograffa
de gases, un soporte frecuentemente utilizado es la tierra de diatomeas, que son esqueletos
de sflice hidratada de algas. Los grupos hidroxilo superficiales de diatomeas forman enlaces
"","~- .._ hidr6geno con solutos pol ares, originando asf intensas colas. La silanizaci6n
reduce las
porque bloquea los grupos hidroxilo con grupos no polares de trimetilsililo.

mas

OH

I
-Si - 0-

Cs = concentraci6n
estacionaria

del soluto en la tase

Cm = concentraci6n

del soluto en la fase m6vil

La sobrecarga produce picos que van au mentando gradualmente, y acaban de forma abrup-

tao

Se presentan largas colas cuando algunos puntas retienen el soluto con mas fuerza que otros.

OR

I
Si -

+ (Cli:lhSiNHSi(CH3)3
Hexametildisilacina

Superficie protegida

(23.36)

l.a.o; columnas de vidrio 0 de sflice usadas en cromatografia de gases 0 de lfquidos tambien se

puedensilanizar para minimizar la interacci6n del soluto con los puntos activos de 1a columna.

~I~
/

Tiempo

t-K:~~~~te
-s

K aumenta

Figura 23.20

Isotermas comunes
forma de
las band as que resultan en cromatograffa.