Anda di halaman 1dari 77

MAKALAH REKAYASA GENETIKA

STRATEGI MUTAGENESIS GEN ISO-1-CYTOCHROME CYEAST


PEMICU 3 : MUTAGENESIS DAN MODIFIKASI

KELOMPOK 7
Cindyara Nayanda

1406473942

Ferizka Shalima Chaeruniza

1406533440

Gugum Permana

1406567315

Nabila Putri Salsabila

1406533466

Ruth

1406533642

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI BIOPROSES


DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2016

KATA PENGANTAR
Pertamatama kami mengucapkan puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas
kuasa-Nya penulis bisa menyelesaikan laporan Pemicu 3 : Mutagenesis dan Modifikasi
dengan baik dan tepat waktu. Laporan ini dibuat atas dasar pemicu ketiga dari mata kuliah
Rekayasa Genetika.
Dalam penulisan laporan ilmiah ini, banyak halangan dan rintangan yang terjadi. Penulis juga
berterima kasih kepada seluruh pihak yang terlibat baik secara langsung maupun tidak
langsung dalam penyelesaian laporan ilmiah ini, yaitu:
1. Dosen mata kuliah Rekayasa Genetika, Dr. Eng. Muhamad Sahlan, S.Si, M.Eng
yang telah membimbing penulis selama proses penulisan laporan ini.
2. Orang tua penulis yang senantiasa memberikan dukungan selama proses pembuatan
laporan ilmiah ini.
3. Seluruh rekan Teknologi Bioproses UI, seluruh angkatan, serta segala pihak yang
telah membantu penulis.
Penulis menyadari banyaknya kekurangan yang terdapat dalam laporan ilmiah ini. Oleh karena
itu, penulis meminta maaf atas semua kesalahan yang terjadi pada laporan ini. Penulis juga
mengharapkan saran, masukan, dan umpan balik dari para pembaca untuk tulisan ini. Akhir
kata penulis mengucapkan terima kasih atas bantuan dari berbagai pihak dan berharap semoga
laporan ini dapat bermanfaat bagi para pembaca.

Depok, November 2016

Penulis

DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ............................................................................................................................... 3
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................... 5
DAFTAR TABEL ....................................................................................................................... 6
ABSTRAK ................................................................................................................................. 8
BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................................. 9
1.1 Latar Belakang ................................................................................................................. 9
1.2 Tujuan .............................................................................................................................. 9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................................11
2.1

Mengapa Diperlukannya Mutagenesis pada Kasus Ini ................................................11

2.2

Struktur dan Fungsi Gen Iso 1 Cytochrome c dari Yeast .......................................11

2.3

Pertimbangan Pemilihan Mutasi..................................................................................13

2.4

Teknik Kloning ............................................................................................................14


2.4.1 Kriteria Vektor dan Host ......................................................................................14
2.4.2 Perbanyakan Gen Menggunakan PCR ...............................................................23
2.4.3 Desain Primer PCR ............................................................................................24
2.4.4 Langkah Langkah Umum Insersi Gen yang Diinginkan ke Vektor ....................25

2.5

Metode Metode Screening dan Seleksi ....................................................................36


2.5.1 Metode Blue-White sreening ..............................................................................36
2.5.2 Metode Seleksi Resistensi Antibiotik ..................................................................38
2.5.3 Metode Lanjutan (SDS-PAGE dan Mass Spectroscopy).....................................39

2.6

Teknik Mutagenesis ....................................................................................................39


2.6.1 Jenis Jenis Mutagenesis ..................................................................................39
2.6.2 Pemilihan Vektor dan Host yang Tepat Untuk Teknik Mutagenesis ....................45
2.6.3 Pemilihan Sel Inang (Host) .................................................................................46
2.6.4 Introduksi Gen Mutan Mengandung Multi- Situs Mutasi Menggunakan PCR ......47

BAB III STRATEGI MUTAGENESIS ........................................................................................52


3.1

Pemilihan Vektor dan Sel Inang (Host) yang Tepat .....................................................53

3.2

Langkah Langkah Insersi Gen Iso-1-Cytochrome cWild Type ..................................59

3.3

Transformasi yang Digunakan Dalam Proses Kloning Gen Iso-1-Cytochrome c .........61

3.4

Pemilihan Mutasi yang Membuat Protein ....................................................................64

3.5

Introduksi Gen Mutan dengan Menggunakan PCR ......................................................64


3

3.6

Transformasi Vektor (Plasmid) Mutan ke Sel Inang (Host) ..........................................69

3.7

Screening dan Seleksi XL-10 Gold Ultracompetent .....................................................70

3.8

Retransformasi Vektor Mutan ke Sel Inang Lain untuk Ekspresi Protein .....................70

3.9

Uji Ekspresi Protein Iso-1-Cytochrome Mutan .............................................................71

BAB IV PENUTUP ....................................................................................................................75


DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................76

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.
Gambar 2.
Gambar 3.
Gambar 4.
Gambar 5.
Gambar 6.
Gambar 7.
Gambar 8.
Gambar 9.
Gambar 10.
Gambar 11.
Gambar 12.
Gambar 13.
Gambar 14
Gambar 15
Gambar 16
Gambar 17.
Gambar 18
Gambar 19.
Gambar 20
Gambar 21.
Gambar 22
Gambar 23.
Gambar 24.

Struktur Gen Iso 1 Cytochrome C yeast .......................................................11


Proses Ligasi menggunakan DNA ligase............................................................29
E.coli sebaiknya ditransformasi pada fase log ....................................................31
Proses Elektroporasi (Sumber : btxonline.com) ..................................................32
Metode Biolistik ..................................................................................................35
Penguraian X-gal menjadi galaktosa dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo..........36
Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ ........................37
Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ i ......................38
Ekstensi Primer PCR..........................................................................................44
Skema umum Introduksi Mutasi Menggunakan PCR (Sumber : Addgene.com) .48
Skema Introduksi Mutasi PCR dengan Protokol QCM Lightning........................48
Ilustrasi Desain Primer (Zheng, et.al., 2004).......................................................50
Ilustrasi desain primer ........................................................................................50
Diagram Alir Pengerjaan ....................................................................................52
Vektor pBluescript II SK (+) (Sumber : www. transomics.com) ...........................54
Daerah MCS pBluescript II SK (+/-) (Sumber : Stratagene) ................................54
Proses Purifikasi Plasmid Menggunakan Elektroforesis Gel ...............................60
Hasil Blue-White Screening ................................................................................62
E.coli yang tidak memiliki gen AmpR ..................................................................63
Diagram Alir Uji Ekspresi Protein........................................................................71
Hasil SDS-PAGE ................................................................................................73
Langkah-langkah mempersiapkan protein untuk MS ..........................................73
Mekanisme Mass-Spectrometry .........................................................................74
Mensekuens Asam Amino .................................................................................74

DAFTAR TABEL
Tabel 1
Tabel 2
Tabel 3
Tabel 4
Tabel 5
Tabel 6
Tabel 7
Tabel 8.

Jenis-jenis Plasmid yang Biasa Digunakan dalam Kloning......................................14


Jenis E.coli yang biasa digunakan dalam kloning ...................................................20
Strain yang Biasa Digunakan Dalam Ekspresi Protein ............................................21
Genotip yang umum ditemukan dari berbagai strain E.coli......................................22
Berbagai strain E.coli yang dapat digunakan sebagai sel inang ..............................47
Kebutuhan template berdasarkan basa yang ingin diPCR ......................................51
Fitur yang terdapat dalam pBluescript SK (+) dan keterangannya ..........................55
Massa Asam Amino ................................................................................................71

ABSTRAK

Mutasi merupakan perubahan struktural atau komposisi genom suatu jasad yang
dapat terjadi karena faktor luar (mutagen) atau karena kesalahan replikasi, dan dapat
diturunkan pada generasi berikutnya. Peristiwa terjadinya mutasi disebut mutagenesis dan
individu yang mengalami mutasi disebut mutan.
Mutasigendisebut juga mutasi titik (pointmutation), yang menyebabkan asam amino
yang dikodekan gen akan berubah,jadiakan terbentuk protein yang berbeda dengan protein
yang dihasilkan sebelumnya.
Meskipun begitu, mutasi tidak selamanya menjadi hal yang buruk. Ada pula mutasi
yang bersifat jinak atau menguntungkan, misalnya pada kasus ini: iso-1-sitokrom c
merupakan sitokrom yang terlibat dalam sistem transpor elektron, yang mampu
mengkatalisis

reaksi

mirip

peroksidase

dalam

keberadaan

akseptor

elektron

sepertihidrogenperoksida.Padayeast,mutaniso-1-sitokrom c terbukti lebih tinggi stabilitas


proteinnya, tidak mudah terdenaturasi, dan tahan terhadap faktor lingkungan yang ekstrim.
Maka dari itu, pada makalah ini, akan dibahas mengenai strategi yang dilakukan untuk
mutagenesis.
Pada proses mutagenesis ini plasmid yang digunakan adalah pBluescript II SK (+) dan
vektornya XL-10 Gold ultra competent, dengan metode yang digunakan adalah PCR. Proses PCR
didahului dengan proses kloning gen iso-1-cytochrome c ke pBluescript SK (+) kemudian
menjadikan plasmid itu sebagai template mutagenesis. Untuk mengetahui keberhasilan
transformasi plasmid ke XL-10 Gold diadakan screening dan seleksi resistensi antibiotik serta uji
ekspresi protein mutan, dengan terlebih dahulu mengadakan retransformasi dari XL-10 Gold ke
BL21 sebelum uji ekspresi protein mutan.

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Mutasi adalah perubahan yang terjadi pada bahan genetik (DNA maupun RNA), baik
pada taraf urutan gen (disebut mutasi titik) maupun pada taraf kromosom.Mutasi pada
tingkat kromosomal biasanya disebut aberasi. Mutasi pada gen dapat mengarah pada
munculnya alel baru dan menjadi dasar munculnya variasi-variasi baru pada spesies.
Meskipun secara biologi sebagian terbesar mutasi menyebabkan gangguan pada individu,
bahkan kematian, mutasi sebenarnya adalah salah satu kunci bagi kemampuan beradaptasi
suatu jenis (spesies) terhadap lingkungan baru atau yang berubah.Sisi positif ini
dimanfaatkan oleh sejumlah bidang biologi terapan.
Peristiwa mutasi atau perubahan materi genetik, di samping segregasi dan
rekombinasi, akan menciptakan variasi genetik yang berguna untuk mengantisipasi
perubahan kondisi lingkungan yang sewaktu-waktu dapat terjadi. Meskipun tidak selalu,
perubahan urutan asam amino pada suatu protein dapat menyebabkan perubahan sifat-sifat
biologi protein tersebut.Hal ini karena pelipatan rantai polipeptida sebagai penentu struktur
tiga dimensi molekul protein sangat bergantung kepada interaksi di antara asam-asam
amino dengan muatan yang berlawanan.
Peran mutasi salah satunya adalah dapat mengetahui fungsi gen yang termutasi
tersebut. Dengan termodifikasinya gen tersebut maka kita dapat mengetahui perubahan apa
yang terjadi terhadapnya. Bila suatu asam amino pada suatu gen disubtitusi, sebagai
contoh, substitusi sebuah asam amino oleh asam amino lain yang muatannya sama,
misalnya substitusi histidin oleh lisin, sering kali tidak berpengaruh terhadap struktur
molekul protein tersebut. Namun, ada tidaknya pengaruh substitusi suatu asam amino
terhadap perubahan sifat protein bergantung kepada peran asam amino tersebut dalam
struktur dan fungsi protein.

1.2 Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini antara lain :
1.

Mengetahui urutan pembuatan protein mutan

2.

Mengetahui cara membuat primer yang dibutuhkan dalam pembuatan protein mutan

3.

Mengetahui alasan penggunaan sel dan vektor nya dalam pembuatan protein mutan

4.

Mengetahui metode untuk memastikan keberhasilan dalam pembuatan portein mutan

5.

Dapat memastikan proses transformasi vektor yang di buat dapat berhasil

10

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mengapa Diperlukannya Mutagenesis pada Kasus Ini
Mutagenesis merupakan metode pengembangan protein dengan cara mendesain
struktur protein sehingga mendapatkan sifat-sifat yang diinginkan. Sifat-sifat yang diinginkan
adalah berupa kemampuan protein-protein tersebut bekerja secara optimal pada kondisi
ekstrem yang telah disebutkan. Sejauh ini, rekayasa molekul protein dilakukan dengan dua
pendekatan, yaitu pendekatan pada level genetika dan pendekatan pada level protein. Pada
pemicu ini dilakukan mutagenesis untuk meningkatkan stabilitas gen iso 1-cytochrome c
dengan mengganti salah satu asam amino pada sekuensnya. Metode rekayasa protein pada
tatanan genetika dengan cara mengubah urutan DNA sehingga dengan sendirinya urutan
asam amino akan terekayasa. Secara garis besar, metode rekayasa protein pada tataran
genetika dikelompokkan menjadi desain rasional (rational design) dan evolusi terarah (directed
evolution). Metode desain rasional difokuskan pada amino spesifik yang memiliki peran dalam
aktivitas biologisnya. Sementara itu, pada metode evolusi terarah, rekayasa dilakukan secara
acak, dan selanjutnya mutan yang memiliki karakteristik yang diinginkan.
Mutagenesis diperlukan pada kasus ini untuk membentuk protein iso-1-cytochrome c
yang lebih stabil dibandingkan protein wild type, yang selanjutnya dapat lebih leluasa
digunakan untuk produksi skala industri.
2.2 Struktur dan Fungsi Gen Iso 1 Cytochrome c dari Yeast

Gambar 1. Struktur Gen Iso 1 Cytochrome C yeast


(Sumber : wikimedia.commons.com )

Struktur dari gen iso 1-cytochrome c memiliki nominal resolusi 1.23 A. Pada model atomik
mengandung 893 protein atom, dan juga 116 molekul air dan 1 sulfat anion. Selain itu gen ini
11

terdiri dari 886 atom hidrogen yang termasuk dalam molekul protein. Crstallographic R-faktor
gen ini adalah sebesar 0.192 dengan refleksi12,513 reflections dan nilai F lebih besar atau
sama dengan 3 sigma (F) pada range resolusi 6.0 sampai 1.23 A. Ketepatan kordinasi gen ini
diperkirakan lebih baik daripada 0.18 A. Gen iso 1-cythochrome c ini memiliki tipikal molekul
cytochrome c lipat, dengan ikatan polypeptida yang terbentuk menjadi alfa-heliks. Inspeksi pada
konformasi dari heliks pada molekul menunjukan adanya ketidakaturan struktur dibanfingkan
struktur alpha-heliks geometri pada umumnya.
Analisis pada internal mobilitas dari gen iso 1-cytochrome c ini menunjukan bahwa daerah
yang paling kaku pada struktur gen ini merupakan molekul yang lokasinya berdekatan dengan
grup heme. Gen ini memiliki derajat saturasi dari ikatan hidrogen yang cukup tinggi, dengan
90% semua atom polar ditemukan pada ikatan hidrogen. Geometri intramolekul dari ikatan
hydrogen diteliti mengunakan resolusi tinggi struktur protein.
Fungsi dari gen ini adalah gen ini merupakan electron carrier protein. Bentuk teroksidasi
dari cytochrome c heme grup dapat menerima electron dari cytochrome c1 subunit dari
cytochrome reductase. Cytochrome c kemudian mentrasfer electron tersebut ke cytochrome
oksidase kompleks. Terakhir akan ditransfer ke rangkaian mitokondrial electron transport.
Sedangkan fungsi molekularnya adalah sebagai berikut.

Transpor elektron, mentransfer elekron dari CoQH2-cytochrome c reduktase


kompleks dan aktivitas cytochrome c oxidase kompleks

aktivitas protein serine/threonine phosphatise

Ikatan metal ion

Ikatan protein

Ikatan heme

Aktivitas pembawa elektron

Sebagai komponen seluler, gen ini berfungsi sebagai komponen pada sitosol, ruang
mitokondrial intermembrane, protein fosfatase tipe 2A, mitokondria, membran dalam
mitokondria, rangkaian sistem respirasi, dan pada nukleus.
Dalam proses yang melibatkan reaksi biologis, gen iso-1-cytochrome c terlibat dalam
respon terhadap oksigen reaktif, proses apoptik, respirasi seluler, proses reaksi oksidasi, dan
transport elektron dalam mitokondria.
Sekuens lengkap gen iso-1-cytochrome c pada yeast adalah sebagai berikut.
1

TTATTCTTAT TTCTTCAATT TAATTTAATT TAATATAACT ATATATCAAT AATGCCAGCT

61

CCATACGAAA AAGGTTCAGA AAAGAAAGGT GCTACTTTAT TCAAAACTAG ATGTTTACAA

121

TGTCATACCG TTGAAAAAGG TGGTCACAT AAAGTTGGTC CAAATTTACA TGGTGTTTTC

12

181

GGTAGAAAAT CCGGTTTAGC TGAAGGTTAT TCTTATACTG ATGCTAATAA AAAGAAAGGA

241

GTTGAATGGT CTGAACAAAC CATGAGTGAT TAATTTAGAAA ACCCAAAGAA AATATTCCT

301

GGTACTAAAA TGGCTTTTGG TGGTTTAAAA AAACCAAAGG ATAGAAATGA TTTAGTTACT

361

TATTTAAAGA AAGCTACTTC TTAAATATCA TAATAAAACA AGTGTTTTTT TGTTTTTTTT

421

GGGTTGGTATT TAT

2.3 Pertimbangan Pemilihan Mutasi yang Menghasilkan Protein Paling Stabil pada Gen Iso
1 Cytochrome c
Energi bebas Gibbs G(Tref) merepresentasikan kestabilan dari suatu protein. Semakin
besar (semakin positif) nilai energi bebas Gibbs, maka protein tersebut semakin stabil.
Persamaan energi bebas Gibbs adalah:
( ) = (). (1)
Di mana H menunjukkan entalpi dari masing-masing protein mutan, S menunjukkan
entropi dari masing-masing protein mutan, G(Tref) adalah energi bebas Gibbs dari masingmasing protein mutan, dan Tref adalah temperatur referensi. Ada kondisi di mana G suatu
protein sama dengan nol, yaitu pada saat protein terdenaturasi setengahnya. Temperatur di
mana protein terdenaturasi setengahnya dinyatakan dengan Tm. Dengan memasukkan nilai
nilai H, S, dan Tref, maka besar G(Tref) dapat diketahui
Untuk mengukur seberapa stabil suatu protein, seseorang dapat menggunakan DSC atau
Differential Scanning Calorimetry. Biomolekul (protein) yang akan diuji berada pada
kesetimbangan antara bentuk native (protein yang terlipat) dan bentuk terdenaturasi. Kemudian
dilakukan pengukuran perubahan kapasitas kalor selama proses denaturasi dan temperatur,
dan mengeplot nilai keduanya ke dalam suatu grafik. Entalpi dari protein juga diukur dalam
metode ini.
Kestabilan protein juga dapat ditentukan dari asam amino yang menyusun protein
tersebut. Berdasarkan Ponnuswamy, dkk. (1982), residu asam amino yang cenderung
menstabilkan protein adalah asam amino yang bermuatan (Asp, Glu, Lys, dan Arg) dan yang
nonpolar (Cys, Leu, Trp, dan Tyr) karena residu-residu asam amino tersebut meningkatan
hidrofobisitas yang nantinya dapat menstabilkan protein. Sementara residu asam amino yang
cenderung men-destabilisasi protein adalah golongan polar-netral-pendek (Ser, Thr, Gln, dan
Gly) dan nonpolar-pendek (Val, Ala). Namun, pada penelitian mengenai hubungan temperatur
optimal untuk hidup organisme termofilik dan asam amino, kombinasi yang paling
mempengaruhi temperatur optimal adalah Ile, Val, Tyr, Trp, Arg, Glu, dan Leu. (Zeldovich et.al,
2007)

13

2.4 Teknik Kloning


2.4.1 Kriteria Vektor dan Host yang Tepat Untuk Proses Kloning Gen Iso-1-Cytochrome
cWild Type ke Plasmid
i) Pemilihan Vektor
Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan
yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan
memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang
dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E.coli, adalah plasmid,
bakteriofag, kosmid dan fagemid/fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat
digunakan pada khamir (ragi).
a.

Plasmid
Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang
dapat melakukan replikasi secara otonom karena memiliki titik awal replikasi
(origin of replication = ORI) sendiri. Plasmid tersebar di antara organisme prokariot
dengan ukuran bervariasi dari 1 kb hingga lebih dari 250 kb. Agar dapat digunakan
sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:
Tabel 1 Jenis-jenis Plasmid yang Biasa Digunakan dalam Kloning

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

14

1. Mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang
sebingga dapat dengan mudah melintasinya. Secara umum, plasmid dapat
membawa DNA sisipan sampai 15 kb. Sisipan yang terlalu besar akan
menimbulkan ketidakstabilan saat replikasi, apalagi jika copy number-nya
tinggi. Plasmid yang terlalu besar juga akan membutuhkan waktu yang lebih
lama saat bereplikasi. Maka dari itu, sekuens yang tidak penting sebaiknya
tidak perlu diinsersi ke dalam plasmid.
2. Mempunyai copy number yang tinggi, karena pada banyak kasus, semakin
besar yield plasmid rekombinan dari kultur sel inang, maka semakin baik.
Meskipun pada beberapa kasus, high copy number dapat menjadi masalah
ketika protein rekombinan (biasanya pada protein membran) bersifat toksik
bagi sel inang pada konsentrasi tinggi.
3. Mempunyai sekurang-kurangnya satu gen penanda yang dapat menandai
masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang (menunjukkan

apakah

transformasi yang telah dilakukan berhasil atau tidak). Penanda dapat berupa
gen resisten antibiotik: ampicillin (AmpR) yang mengkode enzim pengkatalis
hidrolisis cincin beta laktam ampicillin; kanamycin/neomycin (KanR) yang
mengkode

protein

aminoglycoside

phosphotransferase

pencegah

kanamycin/neomycin untuk melakukan transpor aktif ke dalam sel; tetracycline


(tetR) yang mengkode protein pencegah tetracycline untuk masuk ke dalam
bakteri; chloramphenicol (CmR atau Cat) yang mengkode protein pengkatalis
asetilasi chloramphenicol sehingga tidak dapat berikatan dengan ribosom.
4. Mempunyai tempat pengenalan enzim restriksi endonuklease (biasanya dalam
Multiple Cloning Sites atau polylinkers) sebagai tempat penyisipan fragmen
DNA. Biasanya, insersi gen dilakukan di MCS.
5. Memiliki situs identifikasi histokimia. Pada banyak MCS plasmid, ditemukan
pula sekuens pengkodean fragmen dari lacZ yang memudahkan blue-white
screening. Penguraian substrat kromogenik X-

galaktosidase yang dikode oleh gen LacZ dan merupakan tetramer yang
menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Jika dilakukan delesi
pada fragmen DNA LacZ-, maka fragmen LacZ- akan menjadi tidak
berfungsi. Insersi fragmen gen menyebabkan gen LacZ menjadi inaktif atau
tidak sempurna dan tidak bisa menyandi -galaktosidase yang dapat
menghidrolisis X-gal pada medium menjadi galaktosida dan 5,5-dibromo-4,415

dikloro-indigo yang berwarna biru, tetapi jika plasmid tidak mempunyai gen
insersi atau bakteri tidak mengalami transformasi genetik dengan plasmid
rekombinan, maka LacZ akan mengekspresikan enzim -galaktosidase.
6. Mempunyai titik awal replikasi (ORI) sehingga sel inang dapat mengenali
plasmid yang masuk melalui transformasi (tidak akan didegradasi oleh enzim
sel inang), dan plasmid rekombinan dapat melakukan replikasi di dalam sel
inang.
7. Memiliki situs promoter. Situs ini penting karena RNA polimerase berikatan
pada situs promoter ketika melakukan transkripsi. Jika vektor memiliki promoter
yang lemah, ia tidak akan mampu mengekspresikan fragmen DNA yang telah
diklon. Dalam beberapa vektor, terkadang terdapat lebih dari satu ORI dan
promoter yang disertakan, satu untuk diekspresikan dalam E.coli dan yang
lainnya untuk ekspresi di sel eukariotik.
8. Memiliki kompatibilitas dengan plasmid sel inang. Terkadang, plasmid yang
berbeda tidak dapat berada dalam satu sel inang yang sama, hal ini terjadi jika
keduanya membagi fungsi yang dibutuhkan untuk replikasi atau pembagian ke
sel anak. Kompetisi langsung keduanya dapat menuntun pada hilangnya salah
satu plasmid selama dikultur.
Plasmid memiliki beragam jenis, dua yang terkenal adalah pUC dan pBluescript.
Banyak plasmid yang didesain untuk mencapai ekspresi tingkat tinggi dari protein
rekombinan yang dikode gen sisipan.
b.

Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang menginfeksi bakteri. Ada beberapa macam
bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning, yaitu bakteriofag dan
M13.
a. Bakteriofag
DNA yang diisolasi dari partikel fag mempunyai konformasi linier untai
ganda dengan panjang 48,5 kb, yang masing-masing ujung fosfatnya
komplementer satu sama lain sehingga memungkinkannya untuk berubah
konformasi menjadi sirkuler. DNA tipe alami tidak cocok untuk digunakan
sebagai vektor kloning karena terdapat lebih dari satu tempat pengenalan
restriksi untuk setiap enzim yang biasa digunakan. Bakteriofag mempunyai
dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.

16

Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA , yaitu vektor
insersional (vektor yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA
asing) dan vektor substitusi (vektor yang untuk membawa fragmen DNA asing
sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial
dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut).
b. Bakteriofag M13
M13 mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408
basa. Ketika berada di dalam sel inang, genom M13 berubah menjadi untai
ganda sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100
salinan, membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke
permukaan sel inang.
c.

Fagemid atau Fasmid


Fagemid atau fasmid pada dasarnya merupakan plasmid yang memiliki ORI untuk
fage untai tunggal (seperti f1), sehingga bakteri yang ditransformasi oleh plasmid
ini akan diinfeksi oleh fage pembantu (seperti M13 atau f1) dan mampu
menghasilkan salinan plasmid beruntai tunggal, yang dapat dikemas menjadi
kepala fage. Jika tidak ada fage pembantu, maka DNA akan dipropagasi seperti
plasmid normal dalam bakteri, karena adanya gen ORI pada plasmid.

d.

Kosmid
Merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggunakan kos dari DNA
dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32
hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag dan
plasmid.

e. Vektor YACs (Yeast Artificial Chromosomes)


Seperti halnya kosmid, YACs dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA
plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir
yang digunakan terdiri dari sekuens telomer, sentromer, dan titik awal replikasi.
YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Dengan
kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia.
f.

Vektor YEPs (Yeast Episomal Plasmid)


Vektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada Saccharomyces
cereviceae dirancang atas plasmid alami berukuran 2 m (2 mikron). Plasmid ini
memiliki sekuens DNA sepanjang 6 kb, yang mencakup titik awal replikasi dan
17

dua gen yang terllibat dalam replikasi. Segmen plasmid 2 mikronnya membawa
titik awal replikasi, sedangkan segmen kromosom khamirnya membawa suatu
gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat
dalam biosintesis leusin. Meskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada
umumnya, YEps dapat terintegrasi ke dalam kromosom khamir inangnya.

ii)

Pemilihan Sel Inang


Sel inang merupakan tempat di mana vektor rekombinan yang akan diperbanyak
dalam kloning akan ditempatkan. Sel ini juga menjadi agen yang akan
memperbanyak hasil kloning melalui proses perkembangbiakannya. Terdapat
bermacam-macam sel yang dapat dijadikan sebagai sel inang dalam kloning, di
antaranya adalah sel bakteri, yeast, sel mamalia, tumbuhan, dan serangga. Sel inang
yang dipilih untuk kloning harus memiliki kriteria sebagai berikut:
a.

Memiliki transformasi yang efisien


Sel inang yang digunakan diharapkan memiliki kemampuan memasukkan
plasmid atau DNA ke dalam selnya dengan cepat dan tidak mudah terdegradasi.
Oleh karena itu, sel inang yang digunakan biasanya telah mengalami mutasi
deoR untuk mempercepat penyerapan DNA dari luar serta memiliki gen hsdM
yang berfungsi mensintesis metilase untuk mencegah degradasi DNA.

b.

Dapat menangani vektor yang masuk dengan stabil


Plasmid yang telah berhasil masuk ke dalam sel dan tidak dipotong oleh enzim
restriksi masih dapat mengalami masalah dalam proses replikasi. Plasmid ini
dapat mengalami delesi maupun inversi. Untuk menjaga kestabilan dari plasmid
biasanya digunakan 3 sistem rekombinan, menggunakan produk dari gen
recBCD, recE, dan recF.

c.

Disablement
Sel inang diharapkan dapat ditekan kemampuan hidupnya di alam luar sehingga
dapat meminimalisir pencemaran akibat sel yang terlepas dari laboratorium.

Selama ini, mikroorganisme E. coli banyak digunakan dalam industri bioteknologi dan
merupakan mikroorganisme pilihan untuk kloning gen pada sebagian besar
percobaan. Penggunaan E. coli sebagai sel inang kloning dipilih karena ia cepat
membelah, media pertumbuhannya murah, serta mudah dilakukan peningkatan skala

18

produksi untuk industri. Selain itu, terdapat beberapa alasan mengapa E. coli banyak
digunakan sebagai sel inang:
a. E. coli memiliki genetika yang sudah dimengerti dengan baik sehingga mudah
dimanipulasi menjadi apa yang dinginkan.
b. E. coli mampu bereproduksi dan tumbuh dengan sangat cepat (mampu
menggandakan populasinya setiap 20 menit).
c. E. coli mampu bertahan di segala kondisi dan tidak membutuhkan medium kultur
yang sulit atau mahal.
d. E. coli bukanlah bakteri yang membahayakan jika ditangani dengan baik
(sebagian besar E.coli tidak menimbulkan bahaya kesehatan).
e. E. coli siap melakukan transformasi dengan vektor, dan dapat dijadikan sel
kompeten (sel-sel yang mampu mengambil DNA asing). Transformasi dengan
mikroorganisme lainnya seringkali kurang berhasil.
f.

E. coli merupakan organisme sel tunggal sehingga tidak menimbulkan


kontroversi etik saat menumbuhkan, memanipulasi, maupun membunuhnya,
tidak seperti organisme percobaan multiseluler seperti tikus.
i. Meskipun E. coli terbukti memiliki banyak kelebihan untuk ekspresi
protein heterolog, ia juga memiliki beberapa keterbatasan sebagai sel
inang, antara lain:

g. E. coli tidak dapat melakukan modifikasi produk protein. E. coli hanya digunakan
untuk sintesis protein hewan yang tidak perlu proses modifikasi pascatranslasi
seperti insulin. E. coli tidak dapat melakukan modifikasi pascatranslasi karena ia
tidak mempunyai pola glikosilasi atau fosforilasi normal untuk beberapa protein
eukariotik yang dihasilkan dalam sel bakteri, sehingga protein yang dihasilkan
akan menjadi tidak stabil, atau memiliki aktivitas biologis terbatas, bahkan tidak
menunjukkan aktivitas biologis sama sekali.
h. E.coli tidak mempunyai kemampuan folding protein rekombinan dengan baik.
Seringkali, ekspresi yang terlalu berlebihan dapat menghasilkan inclusion bodies,
agreat tak larut dari protein yang salah terlipat. Namun, hal ini dapat diatasi
dengan memilih strain E. coli yang banyak mensintesis protein chaperon. Protein
ini akan bertanggung jawab terhadap protein folding di dalam sel bakteri.
i.

E. coli tidak dapat mensintesis protein yang terlalu panjang. Banyak protein
eukariotik (terutama dari mamalia) jauh lebih besar daripada protein bakteri dan
tidak dapat disintesis oleh mudah oleh E. coli.
19

j.

E. coli mungkin mendegradasi protein yang asing baginya. Maka dari itu,
digunakan strain E. coli mutan yang tidak punya enzim protease, sehingga
protein hasil teknologi rekombinan tidak didegradasi.

Tabel berikut menunjukkan jenis E. coli yang biasa digunakan dalam kloning.

Tabel 2 Jenis E.coli yang biasa digunakan dalam kloning

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

20

Sedangkan, E. coli yang biasa digunakan dalam ekspresi protein, antara lain :
Tabel 3. Strain yang Biasa Digunakan Dalam Ekspresi Protein

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

21

Tabel 4. Genotip yang umum ditemukan dari berbagai strain E.coli

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

22

2.4.2 Perbanyakan Gen Menggunakan PCR Untuk Amplifikasi Sekuens Gen Wild Type
Polymerase Chain Reaction atau PCR adalah teknik atau metode penggandaan
(replikasi) DNA secara in-vitro. Teknik ini memungkinkan kita untuk melakukan replikasi DNA di
luar sel atau tubuh organisme hidup. Melalui teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
melimpah dengan dalam waktu singkat sehingga bisa membantu pekerjaan peneliti atau bidang
lainnya terkait dengan penggunaan DNA sebagai objek kajian. Misalnya untuk , penentuan
strain atau spesies organisme tertentu, deteksi penyakit, deteksi atau kajian gen, terapi gen,
serta di bidang forensik.Teknik ini pertama kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983
sehingga beliau memperoleh hadiah Nobel atas temuannya tersebut.
Reagen yang digunakan:
1.

DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan yang
digunakan sebaiknya berkisar antara 105 106 molekul. Dua hal penting tentang
cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.

2.

Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 28 basa


nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA yang mempunyai
kandungan G + C sebesar 50 60% untuk kestabilan penempelan primer.

3.

Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP) terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP
mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Komponen ini
yang diperlukan untuk reaksi polimerasi.

4.

Enzim DNA Polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai
DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies
ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase Taq tahan
terhadap pemanasan berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer
yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder.

5.

Larutan buffer PCR umumnya mengandung 10 50 mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu


20oC); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20
sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1% disamping
itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.

Pada saat ini sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung reagenreagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak perlu
mencampurkanya satu persatu.

Prinsip Kerja

23

Secara prinsip, PCR merupakan reaksi berulang atau berantai yang melibatkan 20-40
siklus, tergantung kebutuhan, yang terdiri atas 3 tahap sebagai berikut :
1.

Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-960C.


Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-masing
terpisah menjadi untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-vivo, proses ini
dibantu oleh sejumlah enzim seperti enzim helikase dan girase. Karena sifatnya yang
unik, dimana DNA terdenaturasi pada suhu tinggi dan kemudian dapat terenaturasi
kembali pada suhu rendah, maka sifat ini dijadikan dasar untuk tahap denaturasi
proses PCR dengan menggunakan pemanasan. Pemisahan ini memungkinkan
penempelan primer yang komplemen dengan DNA target pada sekuen yang sesuai.
Durasinya berkisar 1-5 menit, tergantung kandungan basa GC dari sekuen DNAnya.
Semakin tinggi GC nya, maka waktunya lebih lama. Sepertihalnya pernah disebutkan
bahwa ikatan GC (3 ikatan hidrogen) lebih kuat dibandingkan dengan AT.

2.

Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-600C


Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer dapat
menempel pada bagian DNA yang komplementer dengan urutan basanya.
Penempelan tersebut sifatnya spesifik. Suhu annealing yang tidak cocok
menyebabkan kegagalan dalam replikasi DNA yang benar. Suhu Annealing (TA) bisa
dihitung berdasarkan suhu melting (TM). Jika suhunya terlalu tinggi dari yang
seharusnya, maka primer tidak dapat menempel pada DNA cetakan, sementara jika
suhunya terlalu rendah akan menyebabkan penempelan pada daerah atau sekuen
DNA yang tidak sesuai.

3.

Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 720C (opsional).


Pada tahapan ini, enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan
menambahkan pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat, pada sisi 3
primer yang telah menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung
pada jenis enzim polimerase yang digunakan. Khusus untuk Taq Polimerase, 72oC
adalah suhu yang biasa digunakan.

Desain Primer PCR


Desain primer untuk mengklon produk PCR ini merupakan aspek yang sangat penting.
Berikut adalah hal-hal yang harus diperhatikan dalam mendesain primer:

Situs restriksi : diperlukan penambahan situs restriksi yang sesuai untuk kloning
(yang bisa dipotong oleh enzim restriksi tertentu, umumnya 6-8 pasangan basa).
24

Pemilihan situs restriksi memperhatikan hal-hal berikut; 1) jangan sampai enzim


restriksi memotong wilayah dalam DNA insert dan 2) sesuai dengan situs restriksi
plasmid resipien/ vektor.

Sekuens Tambahan : diperlukan pasangan basa ekstra setelah situs restriksi pada
ujung 5 primer (umumnya 3-6 pasangan basa), untuk meningkatkan efisiensi
pemotongan

Sekuens hibridisasi : sekuens ini adalah sekuens yang diampilifikasi (umumnya 1821 pasangan basa)

2.4.3 Langkah Langkah Umum Insersi Gen yang Diinginkan ke Vektor


Terdapat tiga langkah atau tiga kegiatan utama dalam menjalankan suatu rekayasa
genetika. Dalam kasus ini, rekayasa genetika dilakukan pada DNA plasmid. Tiga kegiatan
tersebut adalah pemotongan, modifikasi, dan penyambungan.
Pemotongan
Pemotongan merupakan kegiatan memotong DNA plasmid pada urutan basa tertentu.
Urutan basa ini tergantung pada jenis enzim restriksi yang digunakan pada saat memotong
DNA plasmid. Biasanya enzim-enzim ini mengenali suatu urutan basa palindrom tertentu
(biasanya pada enzim restriksi Tipe II yang akan dijelaskan kemudian), seperti yang ditunjukkan
pada gambar ini.

Enzim restriksi, misalnya EcoRI, akan mengenali urutan basa seperti itu dan memotong di
antara basa G dan A pada kedua untai. Hasilnya, segmen tersebut akan menjadi seperti ini.

Jarak antara basa G dan A kemudian dapat disisipkan fragmen DNA lain dari organisme lain
yang sifatnya kita inginkan berada di organisme ini. Sebenarnya, mekanisme pemotongan DNA
ini sudah terjadi alami dalam tubuh bakteri sebagai cara untuk mempertahankan diri.
Mekanisme pemotongan ini menjadi semacam alat bagi bakteri untuk memonitor setiap DNA
baru yang masuk ke tubuh bakteri dan menghancurkannya apabila DNA tersebut terbukti asing
25

bagi bakteri. Enzim restriksi endonuklease ini juga mengenali sekuens tertentu pada DNA baru
dan menghancurkan DNA asing dalam beberapa fragmen, bisa terjadi pada situs yang spesifik
maupun penghancuran secara acak. Ilmuwan yang merekayasa gen suatu bakteri tidak
menginginkan fragmen asing pengkode sifat yang diinginkan dihancurkan oleh bakteri itu
sendiri saat fragmen itu diintroduksi ke dalam bakteri, maka plasmid bakteri yang sudah
terpotong terlebih dulu harus menjalani modifikasi sebelum disisipkan fragmen DNA asing.
Molekul-molekul yang Terlibat
1.

Enzim Restriksi Endonuklease


Seperti yang disinggung pada bagian sebelumnya, restriksi endonuklease sebenarnya

merupakan bagian dari mekanisme pertahanan bakteri dari DNA asing. Enzim restriksi
endonuklease, seperti disinggung pula pada bagian sebelumnya, berasosiasi dengan enzim
pemodifikasi yang memetilasi DNA. DNA akan selalu terlindungi dari degradasi bahkan setelah
replikasi. Hal ini disebabkan karena replikasi menggunakan prinsip semikonservatif. Replikasi
semikonservatif mereplikasi molekul yang termetilasi pada kedua untai, menghasilkan dua
molekul anak yang ter-hemimetilasi. Hemimetilasi sudah cukup untuk mencegah pemotongan
oleh enzim restriksi endonuklease.
Tipe II paling banyak digunakan dalam rekayasa genetika. Keuntungan dari penggunaan
Tipe II dibanding Tipe I dan Tipe III adalah restriksi dan modifikasi dilakukan dengan enzim
yang berbeda, maka pemotongan DNA dapat dilakukan tanpa modifikasi. Keuntungan kedua
adalah aktivitas restriksi tidak memerlukan kofaktor seperti ATP atau S-adenosilmetionin
sehingga lebih mudah digunakan. Keunggulan yang terpenting adalah Tipe II mengenali
sekuens tertentu yang spesifik dan memotong di dalam sekuens tersebut. Tipe IIs mempunyai
kofaktor yang sama dengan Tipe II, namun enzim tipe ini memotong di titik yang jauh dari
sekuens pengenalan.
Sistem restriksi bersama dengan sistem modifikasi mempunyai empat tipe yang berbeda
berdasarkan cara kerjanya. Keempat tipe tersebut adalah Tipe I, Tipe II, Tipe III, dan Tipe IIs.
Tipe I memakai satu enzim dengan subunit berbeda-beda untuk pengenalan, pembelahan
(pemotongan), dan metilasi dengan kegiatan pengenalan dan metilasi pada sekuens tunggal
namun memotong DNA hingga 1000 bp. Tipe II menggunakan dua enzim berbeda yang samasama melakukan pengenalan pada sekuens target yang sama dan simetris, dan kedua enzim
ini dapat memotong atau memodifikasi sekuens pengenalan.
TipeIII menggunakan satu enzim yang mengandung dua subunit berbeda, satu
subunit untuk pengenalan dan modifikasi, dan satu subunit lain untuk memotong DNA.
Enzim ini mengenal dan memetilasi pada sekuens yang sama namun memotong DNA
26

hingga 24-26 bp. Tipe terakhir yaitu tipe IIs menggunakan dua enzim yang berbeda
dengan sekuens pengenalan yang asimetrik; pemotongan berlangsung pada satu sisi dari
sekuens pengenalan hingga 20 bp. Sistem-sistem ini juga dikenal dengan sistem R-M
(Restriction-Modification).
2.

DNA-ase
Pada kondisi tertentu di mana enzim restriksi endonuklease tidak dapat digunakan,

pemotongan DNA dapat menggunakan DNase. Hal ini bisa saja disebabkan karena suatu
DNA memiliki komposisi basa yang tak lazim sehingga mempunyai banyak sekuens
pengenalan. Atau misalnya ada kebutuhan untuk membagi DNA menjadi segmensegmen yang sangat banyak. Namun, penggunaan DNase menimbulkan satu masalah
yaitu tidak dihasilkannya sekuens untai tunggal yang unik pada ujung-ujung molekul.
Semua ujung juga tidak tumpul. Pengkloningan fragmen-fragmen yang terbentuk menjadi
sulit, tapi hal itu dapat diatasi dengan pemilihan DNA polimerase yang tepat.
Modifikasi
Modifikasi merupakan proses pengubahan pada DNA plasmid agar plasmid tersebut
dapat survive jika dipotong di tempat tertentu yang berpotensi mematikan. Modifikasi ini
misalnya metilasi basa-basa tertentu pada sejumlah urutan DNA atau pelibatan fosfatase
untuk menghilangkan fosfat yang dihasilkan dari proses pemotongan pada urutan basa
tertentu yang berpotensi mematikan.
Molekul-molekul yang Terlibat
1.

Fosfatase
Fosfatase adalah enzim yang membuang fosfat dari DNA dan menggantinya

dengan gugus hidroksil. Fosfatase berperan dalam mengeblok reaksi penyambungan


yang tidak diinginkan, misalnya untuk mencegah plasmid yang sudah terpotong untuk
menempel dengan ujung lengketnya sendiri. Fosfatase biasa digunakan jika ujung dari
pemotongan yang dihasilkan adalah ujung tumpul atau pemotongan yang hanya memakai
satu jenis enzim restriksi saja.
2.

Polimerase
Polimerase yang digunakan pada proses modifikasi terdiri dari empat macam, yaitu

DNA polimerase bergantung-DNA, DNA polimerase bergantung-RNA, RNA polimerase


bergantung-DNA, dan polimerase tak bergantung-template.
Penyambungan (Ligasi)
Penyambungan adalah proses penggabungan fragmen DNA donor dengan fragmen
DNA inang pada urutan basa tertentu.. Ada 3 metode yang dapat digunakan untuk
27

melakukan

melakukan

penyambungan

(ligasi).

Metode

pertama

memanfaatkan

kemampuan DNA ligase untuk menggabungkan secara kovalen ujung-ujung lengket


(kohesif) yang terbuka. Metodekedua bergantung kepada DNA ligase bakteri E.coliyang
terinfeksi T4 untuk membentuk ikatan fosfodiester antar fragmen ujung tumpul. Metode
ketiga memanfaatkan enzim deoksinukleotidiltransferase terminal untuk sintesis ujung
tunggal 3 homopolimer pada ujung fragmen.
1.

Metode menggunakan DNA Ligase


Metode menggunakan DNA ligase dipakai pada E.colimaupun pada E.coli yang

terinfeksi bakteriofag T4. DNA ligase bekerja dengan menyegel nicks beruntai tunggal di
antara nukleotida berdekatan pada rantai DNA duplex. Meskipun reaksi yang dikatalisis
oleh enzim pada E.colimaupun pada E.coli yang terinfeksi T4 itu sama, namun enzimenzim pada kedua jenis E.coli tersebut memiliki kofaktor yang berbeda. Enzim T4
membutuhkan ATP sebagai kofaktor, sementara enzim E.colimembutuhkan NAD+. Pada
kedua jenis E.colitersebut, kofaktor akan berpisah dan membentuk komplek enzim-AMP.
Kompleks tersebut akan berikatan dengan nick yang mengekspos 5 fosfat dan 3-OH,
dan membuat ikatan kovalen pada tautan fosfodiester.
2.

Metode Pembentukan Ekor Homopolimer


Metode ini melibatkan penempelan ekor yang terdiri dari sekuens homopolimer

yang komplementer. Kemudian, dengan penambahan sekuens oligo(dA) pada ujung 3


pada satu populasi molekul DNA dan sekuens oligo(dT) pada ujung 3 pada populasi
molekul DNA yang lain, maka kedua molekul DNA tersebut dapat menempel untuk
membentuk lingkaran-lingkaran dimerik.

28

Gambar 2. Proses Ligasi menggunakan DNA ligase


(Sumber : Old dan Primrose, 2001)

Enzim deoksinukleotidiltransferase akan melakukan penambahan nukleotida secara


berulang pada ujung 3-OH jika disajikan dengan deoksinukleotida fosfat yang tunggal.
DNA dengan ujung 3-OH yang terekspos , yang dapat dihasilkan dari pra-perlakuan
dengan eksonuklease atau pemotongan dengan enzim restriksi seperti PstI, sangat
cocok untuk enzim transferase tersebut. Namun, ternyata cara ini juga dapat diterapkan
pada DNA yang dipotong oleh EcoRI.
3.

Metode Penggabungan Molekul DNA Tanpa Enzim Ligase


Shuman (1994) telah mendeskripsikan sebuah pendekatan untuk mensintesis

molekul-molekul

rekombinan

di

mana

ia

menggunakan

enzim

vaccinia

DNA

topoisomerase yang dapat melakukan pemotongan dan penggabungan kembali dari


molekul DNA. Kemudian Heyman dkk. menerapkan sifat dari vaccinia topoisomerase
untuk mengembangkan teknologi penyambungan DNA secara kovalen tanpa memakai
ligase. Jika biasanya penggunaan ligase dapat memakan waktu semalaman, maka
dengan teknologi ini penyambungan dapat berlangsung dalam lima menit saja.

29

Molekul-molekul yang Terlibat


1.

T4 DNA Ligase
T4 DNA ligase dikodekan oleh bakteriofag T4, dan dibuat dalam tubuh E.coliyang
terinfeksi. DNA ligase ini dapat mengerjakan penyambungan baik untuk ujung tumpul
maupun ujung lengket (sticky end) dan membutuhkan ATP agar bisa bekerja. Enzim
ini juga membutuhkan 3-OH dan 5-fosfat agar dapat melakukan penyambungan.

2.

DNA ligase E.coli


Merupakan enzim yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri, ia tidak dapat melakukan
penyambungan ujung tumpul. Juga membutuhkan 3-OH dan 5-fosfat seperti T4 DNA
ligase namun membutuhkan NAD+ alih-alih ATP.

3.

Topoisomerase
Topoisomerase merupakan enzim lain yang mempunyai aktivitas penyambungan.
Normalnya,

topoisomerase

berfungsi

untuk

mempengaruhi

derajat

puntiran

(supercoiling) dari molekul DNA. Topoisomerase bekerja dengan memisahkan kedua


untai DNA untuk menurunkan tegangan kemudian menyatukan kedua untaian DNA
itu lagi. Penyambungan dengan topoisomerase memungkinkan proses yang lebih
cepat dibanding jika menggunakan DNA ligase konvensional.
4.

Rekombinase
Banyak ragam dari sistem rekombinasi berbasis fag yang mengkatalisis pemisahan
dan penyambungan kembali dari molekul pada situs yang spesifik. Rekombinase
dimanfaatkan untuk modifikasi genetik dari hewan transgenik. Sistem rekombinasi ini
salah satunya digunakan pada bakteriofag lambda, di mana virus tersebut
mempunyai sistem untuk mengarahkan rekombinasi antara genom dari virus dengan
kromosom dari inang dan mengkatalisis proses insersinya.

5.

Tranposase
Elemen genetik yang transposable dapat berpindah-pindah dari satu titik di DNA ke
titik lain menggunakan enzim transposase. Enzim ini dapat digunakan untuk insersi
origin of replication atau gen yang resisten terhadap antibiotik.

2.4.4 Metode Metode Transformasi yang Dapat Digunakan


i)

Metode Langsung
1.

Metode Kejutan Panas (Heat Shock)


Merupakan metode transformasi pada bakteri E.coli yang pertama kali
dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa. Metode ini
30

merupakan metode paling sederhana di mana bakteri E.coli yang akan


ditransformasi diinkubasi pada larutan yang mengandung kation divalen
(umumnya magnesium klorida, kemudian kalsium klorida pada kondisi dingin,
yang kemudian dipaparkan pada pulsa heat shock).
Membran sel E.coli mempunyai ratusan pori-pori yang disebut dengan
zona adisi, dan tersusun dari molekul-molekul negatif. Bakteri E.coli memiliki
permukaan

yang

bermuatan

negatif

akibat

adanya

fosfolipid

dan

lipopolisakarida, sehingga digunakan kation divalen yang berfungsi untuk


melindungi muatan negatif DNA agar dapat melekat pada permukaan E.coli.
Walaupun ukuran zona adisi terbilang cukup besar untuk DNA yang akan
masuk, karena DNA juga bermuatan negatif, maka akan terjadi tolakan.
Penggunaan larutan CaCl2 sebagai medium akan menyumbangkan ion
kalsiumnya yang bermuatan positif, sehingga keadaan menjadi netral.
Penurunan temperatur sampai 00C menyebabkan molekul lipid menjadi lebih
diam dan keadaan menjadi lebih stabil. Selain itu, pemaparan E.coli pada
larutan kation divalen yang bertemperatur dingin akan melemahkan struktur
permukaan E.coli dan mempengaruhi porositas membran sel sehingga pada
saat terjadi lonjakan temperatur, membran selnya menjadi tidak selektif
terhadap molekul asing (dan permeabel terhadap DNA plasmid). Akan terjadi
induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil dapat masuk ke
bagian dalam sel. Selanjutnya, pemaparan heat shock akan membentuk
ketidakseimbangan termal pada kedua sisi membran sel, sehingga DNA
plasmid dapat masuk melalui pori-pori sel atau dinding sel yang dirusak
tersebut.

Gambar 3. E.coli sebaiknya ditransformasi pada fase log


(Sumber : Pearson Education, 2013)

31

Seperti yang sudah dijelaskan, bakteri yang mudah dilewati DNA disebut
bakteri kompeten. E.coli akan bersifat kompeten jika ia sedang tumbuh dengan
sangat cepat (berada pada fase log, dibanding pada fase-fase lainnya). Maka
dari itu, tahap transformasi genetik sebaiknya dilakukan saat E.coli berada dalam
fase log.

2. Elektroporasi

Gambar 4. Proses Elektroporasi (Sumber : btxonline.com)

Metode elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik


untuk membentuk lubang-lubang pada membran sel, sehingga DNA plasmid
dapat memasukinya. Aliran listrik yang digunakan dalam elektroporasi akan
menyebabkan membran sel mengalami kerusakan dan terbentuknya pori
sementara pada lapisan hidrofobik sekitar 2 nm, sehingga sel bakteri dapat
menyerap DNA eksogenus dari larutan suspensi.

Sebagian sel akan

bertransformasi dengan stabil, sehingga dapat diseleksi selanjutnya.


Dua mekanisme yang konsisten dalam elektroporasi adalah: pembukaan
kompartemen baru (interior dari sel) agar DNA dapat berdifusi secara pasif ke
dalam sel bakteri, dan aliran ruah dari medium yang mengandung DNA plasmid,
menuju ke sel bakteri. Difusi molekul DNA memang akan sedikit lambat, tetapi
jarak antara sel dan DNA sangat kecil sehingga mekanisme ini memungkinkan
DNA plasmid untuk masuk dalam sel bakteri. Sel bakteri juga dapat menerima
10% dari volume aliran ruah yang dipengaruhi oleh kekuatan osmotik
mediumnya. Elektroporasi dilakukan dengan mengintroduksikan suspensi sel
terkonsentrasi dan plasmid DNA rekombinan pada medan listrik dengan
amplitudo yang sangat tinggi. Proses elektroporasi sangat bergantung pada dua

32

karakteristik pulsa listrik: kekuatan medan listrik dan panjang pulsa (konstanta
waktu-hambatan-kapasitas). Sedangkan, efisiensi elektroporasi bergantung pada
banyak faktor, seperti temperatur, parameter medan listrik (voltase, resistansi
dan kapasitansi), bentuk topologis DNA, dan faktor sel inang (latar belakang
genetik, kondisi tumbuh, dan kondisi setelah kejutan listrik).
Frekuensi transformasi menunjukkan fungsi yang linear dengan konsentrasi
DNA dalam enam tingkat orde. Sedangkan, efisiensi transformasi merupakan
fungsi dari konsentrasi sel bakteri. Sebagian besar sel bakteri yang tetap hidup
merupakan bakteri yang kompeten, dan 80% di antaranya bertransformasi pada
konsentrasi DNA yang tinggi. Dari penelitian Dower et al., didapatkan hubungan
sebagai berikut:
1. Besar pulsa terhadap panjang pulsa
Melemahkan medan listrik akan meningkatkan panjang pulsa yang
dibutuhkan untuk melakukan transformasi genetik pada sel bakteri secara
maksimal, sedangkan mengurangi panjang pulsa akan meningkatkan amplitudo
yang dibutuhkan medan untuk melakukan transformasi genetik. Kombinasi yang
optimal antara kekuatan medan dan panjang pulsa menghasilkan efisiensi
transformasi sebanyak 2-3 x 109/g.
2. Frekuensi transformasi terhadap konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA plasmid menentukan probabilitas sel yang akan
ditransformasi. Frekuensi transformasi bergantung pada volume (konsentrasi
DNA) dan transforman yang diperoleh merupakan produk hasil kali dari frekuensi
dan jumlah sel bakteri.
3. Pengaruh pra- dan pasca-inkubasi sel bakteri dan DNA
Menambah waktu inkubasi DNA dengan sel bakteri sebelum diberi
perlakuan

elektroporasi

akan

meningkatkan

kemungkinan

transformasi.

Meskipun begitu, waktu inkubasi yang berlebihan dapat menyebabkan


terpotongnya plasmid rekombinan yang diintroduksikan karena sel bakteri
menghasilkan nuklease dalam suspensi sel.
Elektroporasi merupakan metode transformasi genetik dengan efisiensi
transformasi tinggi (efisiensi transformasi merupakan rasio yang menunjukkan
jumlah bakteri yang dapat menerima plasmid dengan sukses per total bakteri
yang disebar). Selain itu, dari penelitian Sheng, et al., diketahui bahwa
elektroporasi merupakan langkah transformasi genetik yang tepat apabila DNA
33

plasmid yang diintroduksikan pada E.coli berukuran besar. Elektroporasi


memperbesar kemungkinan transforman dapat mengambil DNA plasmid
berukuran besar dengan gradien voltase dan konstanta waktu yang berbedabeda. Efisiensi transformasi DNA plasmid berukuran besar juga tetap tinggi
dengan menggunakan metode elektroporasi.
Elektroporasi merupakan metode transformasi genetik dengan efisiensi
transformasi tinggi (efisiensi transformasi merupakan rasio yang menunjukkan
jumlah bakteri yang dapat menerima plasmid dengan sukses per total bakteri
yang disebar). Selain itu, dari penelitian Sheng, et al., diketahui bahwa
elektroporasi merupakan langkah transformasi genetik yang tepat apabila DNA
plasmid yang diintroduksikan pada E.coli berukuran besar. Elektroporasi
memperbesar kemungkinan transforman dapat mengambil DNA plasmid
berukuran besar dengan gradien voltase dan konstanta waktu yang berbedabeda. Efisiensi transformasi DNA plasmid berukuran besar juga tetap tinggi
dengan menggunakan metode elektroporasi.

3.

Polyethylen glycol-mediated protoplast(PEG)


Merupakan proses introduksi DNA yang dilakukan tanpa melalui vektor
perantara. Transformasi protoplas umumnya dilakukan pada tanaman monokotil
jenis serealia. Teknik ini menggunakan senyawa polyethylen glycol (PEG)
sebagai perantara masuknya DNA ke dalam kromosom tanaman. Keberhasilan
teknik transformasi dengan PEG masih rendah karena regenerasiprotoplas
sangat bergantung pada jenis genotipe yang dipakai dan tidak dapat
diaplikasikan pada semua sel tanaman.

4.

Biolistik (Particle Bombardment)


Metode biolistik (biolistic), particle bombardment, atau biolistic particle
delivery system merupakan metode transfer gen yang digunakan untuk
melakukan transformasi sel secara in situ. Metodeini diawali dengan proses
pelapisan partikel macroprojectiles (seperti emas atau tungsten atau logam berat
lainnya) dengan plasmid DNA sebagai microprojectiles.

34

Gambar 5. Metode Biolistik


(Sumber : Brooks, 2015)

DNA target akan diletakkan diatas permukaan emas sekitar 0.51.5 m,


kemudian dilakukan penembakan dengan perangkat gene gun yang menembak
dengan tekanan tinggi. Materi genetik yang dimasukkan ke dalam sel disebut
sebagai trans gene. DNA yang sudah terlapisi dengan emas akan masuk ke
dalam jaringan dan melakukan integrasi ke dalam DNA kromosom secara acak.
Metode

ini

dirancang

untuk

transformasi

sel

tumbuhan,

dan

mampu

mentransformasi hampir semua jenis sel dan tidak terbatas pada materi genetik
dari nukleus, tetapi plastida dan organel yang memiliki materi genetik lainnya
juga dapat ditransformasi.
ii)

Metode Tidak Langsung


Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri Gram positif yang bersifat
fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri tersebut mempunyai kemampuan yang
secara alami dapat mentransfer potongan DNA (transfer DNA) ke dalam genom
tanaman dan menyebabkan terbentuknya tumor (crown gall), yang merupakan
sumber karbon bagi A. tumefaciens. Kemampuan A. tumefaciens tersebut digunakan
untuk menyisipkan gen bermanfaat ke dalam tanaman seperti gen yang berperan
dalam perbaikan sifat. Transformasi dengan A. tumefaciens memiliki beberapa
keuntungan, seperti mudah dilakukan, integrasi ke dalam genom DNA yang stabil,
dan efisiensi transformasi yang cukup tinggi. Transformasi dengan A. tumefaciens
juga memiki efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal yang dihasilkan lebih
35

tinggi. Akan tetapi, keberhasilan transformasi A. tumefaciens masih terbatas pada


genotipe tanaman tertentu.
2.5 Metode Metode Screening dan Seleksi
2.5.1 Metode Blue-White sreening
Skrining biru-putih (blue-white screening) merupakan salah satu teknik visual screening
umum pada bakteri Gram negatif seperti E.coli. Prinsip dari metode ini didasarkan pada reaksi
penguraian X-gal yang merupakan substrat kromogenik.

Gambar 6. Reaksi penguraian X-gal menjadi galaktosa dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo


(Sumber : commons.wikimedia.org)

Penguraian X-gal dan peningkatan fenotipe Lac operon diinduksi oleh adanya
isopropilthio--D-galaktosida (IPTG) dan dikatalisis oleh enzim -galaktosidase yang dikode
oleh gen LacZ, yang merupakan gen pertama dalam Lac operon E.coli. Enzim -galaktosidase
merupakan tetramer yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, dan tiap-tiap
monomer terdiri atas 2 bagian: LacZ- dan LacZ-. Jika dilakukan delesi pada fragmen DNA ,
maka fragmen akan menjadi tidak berfungsi. Insersi fragmen gen penghasil iso-1-sitokrom c,
yang akan mengganggu fragmen LacZ-, sehingga gen LacZ menjadi inaktif atau tidak
sempurna (maka dari itu, metode ini disebut inaktivasi insersi). Gen LacZ yang tidak sempurna
tidak bisa menyandi -galaktosidase yang dapat menghidrolisis X-gal pada medium menjadi
galaktosida dan 5,5-dibromo-4,4-dikloro-indigo yang berwarna biru, tetapi jika plasmid tidak
mempunyai gen penghasil -glukosidase atau bakteri tidak mengalami transformasi genetik
dengan plasmid rekombinan, maka LacZ akan mengekspresikan enzim -galaktosidase.
Berarti, dalam skrining ini, gen -glukosidase merupakan marka seleksi. Sehingga, pada
medium padat, koloni bakteri E.coli yang menghasilkan enzim -galaktosidase menjadi
berwarna biru, sedangkan koloni yang tidak menghasilkan enzim tetap berwarna putih.
36

Gambar 7. Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ mengganggu fragmen LacZ- dan
menghambat pembentukan peptida , sehingga enzim -galaktosidase tidak berfungsi (Sumber : Nicholl, 2008)

Hal-hal yang Harus Diperhatikan


Meskipun prinsip teknik blue-white screening mudah, teknik ini mempunyai beberapa
kelemahan, antara lain: teknik blue-white screening merupakan teknik screening, bukan teknik
seleksi (pemilihan klon yang tepat). Selain itu, pembedaan bakteri hanya didasarkan pada
identifikasi warna koloninya saja. Hasil screening bisa saja menunjukkan false positive,
kemungkinan-kemungkinan false positiv bisa berupa:
1. Gen LacZ yang tidak berfungsi dan tidak dapat mengkode Iso-1-sitokrom c T103,
melainkan hanya Iso-1-sitokrom c atau gen yang diinsersi tidak termutasi.
2. Dapat juga terdapat kemungkinan kemungkinan kasus dimana gen LacZ yang tidak
berfungsi dan tidak dapat mengkode Iso-1-sitokrom c T103, dan tidak juga mengkode
Iso-1-sitokrom c atau dalam kata lain belum diinsersi oleh gen. sehingga tidak dapat
mengubah X-gal menjadi senyawa berwarna biru.
3. Kemungkinan ketiga adalah E.coli belum sama sekali terinsersi oleh plasmid.
Jadi, koloni putih yang terlihat bukanlah koloni bakteri yang memiliki plasmid mutasi,
tetapi hanya koloni bakteri dengan 3 kemungkianan diatas.

37

Gambar 8. Insersi gen yang diinginkan pada multiple cloning site gen LacZ mengganggu fragmen
LacZ- dan menghambat pembentukan peptida , sehingga enzim -galaktosidase tidak berfungsi
(Sumber : Nicholl, 2008)
2.6

2.5.2 Metode Seleksi Resistensi Antibiotik


Dari kemungkinan-kemungkinan false positif tadi, kemungkian ketiga dapat dihindari
menggunakan seleksi resistansi antibiotik ampicilin. Sel yang belum diinsersi oleh plsmid tidak
akan memunyai resistansi kepada antibiotik ampicilin karena itu sel akan mati pada keadaan
lingkingan yang mengandung ampicilin.
Antibiotik seperti ampicillin merupakan penisilin semisintetik yang stabil terhadap asam
atau amidase tetapi tidak tahan terhadap enzim -laktamase. Bakteri yang telah dimasukin
plasmid rekombinan dengan gen AmpR mampu menyandi enzim -laktamase yang
menghidrolisis ikatan 4-cincin betalaktam dari antibiotik beta-laktam seperti ampicillin, dan
mendegradasinya sehingga bakteri tidak akan mati karena keberadaan antibiotik tersebut.
Maka dari itu, ketika bakteri yang mengandung plasmid plasmid ditumbuhkan dalam media
38

yang mengandung ampicillin, maka bakteri tersebut akan tetap tumbuh, sementara bakteri yang
tidak membawa plasmid akan mati. Berarti, dalam seleksi ini, gen pembawa sifat resisten
terhadap ampicillin merupakan marka seleksi yang dapat membedakan bakteri yang berhasil
melakukan transformasi genetik dengan plasmid rekombinan dan yang tidak. Selain itu, metode
seleksi resistensi antibiotik merupakan metode yang cukup penting dilakukan untuk
mempertahankan gen AmpR yang terdapat dalam plasmid.

2.5.3 Metode Lanjutan (SDS-PAGE dan Mass Spectroscopy)


Metode ini digunakan untuk mendeteksi protein Iso-1-sitokrom mutan dan mensekuens
asam aminonya. Metode ini telah kita peklajari sebelumnya pada pemicu 2 (SDS-PAGE) dan
pada semseter 3(mass spectroscopy)

2.6 Teknik Mutagenesis


2.6.1 Jenis Jenis Mutagenesis
Mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan dalam informasi genetik dari suatu
organisme secara stabil dengan menggunakan mutagen fisik dan kimia. Ini dikembangkan oleh
Charlotte Auerbach. Yang merupakan ilmuwan wanita pertama yang mempelajari tentang
pengaruh mutagen kimia.
Mutagenesis digunakan sebagai alat genetik untuk menginduksi mutasi pada cara-cara
tertentu yang pada gilirannya dapat digunakan untuk menentukan fenotipe organisme, fungsi
gen dan bahkan nukleotida.
Mutasi dapat terjadi secara random atau terarah. Ada berbagai jenis metode
mutagenesis, seperti :
Directed mutagenesis
Directed Mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan kode asam amino di tingkat DNA.
Struktur 3D ditandai dari protein menggunakan X-Ray kristalografi dan prosedur analitis lainnya
membantu dalam menentukan asam amino dari protein harus diubah untuk mencapai properti
tertentu. Namun, ini tidak mungkin untuk sebagian besar protein dan karenanya strategi trial
and error digunakan untuk membuat perubahan dalam nukleotida untuk menghasilkan
perubahan tertentu dalam protein.
Keuntungan :

Harga Mutasi tinggi

Semua mutasi dapat diinduksi

Investigasi sistematis dan rinci dari mutasi ditargetkan dapat dibuat.


39

Berbagai jenis Directed Mutagenesis adalah:

Oligonukleotida Directed Mutagenesis Dengan M13 DNA

Oligonukleotida diarahkan Mutagenesis dengan Plasmid DNA.

PCR Amplified oligonukleotida Directed Mutagenesis

PCR Mutagenesis digunakan untuk mengubah urutan nukleotida metode DNA dan dapat
digunakan untuk mengubah asam amino untuk menguji fungsi dari domain dalam protein dan
untuk menilai fungsi promotor. Berbagai cara memperkenalkan mutasi pada PCR adalah
Directed Mutagenesis Site. Seperti namanya, metode ini memperkenalkan mutasi pada lokasi
tertentu di primer DNA strand.
Keuntungan: Metode berdasarkan PCR berguna dalam studi mutasi tertentu dalam DNA
yang pada gilirannya berguna dalam studi aspek yang berbeda dari fungsi protein
Akan tetapi, metode ini mempunyai keterbatasan, yaitu :

Mutasi DNA sulit untuk meniru sebagai sel kompeten yang akan digunakan adalah
mahal.

Membutuhkan sequencing untuk mengkonfirmasi mutasi.

Primer spesifik diperlukan

Random Mutagenesis
Random Mutagenesis juga dikenal sebagai pemuliaan molekuler. Dalam hal ini gen yang
non spesifik berubah pada satu atau lebih tingkat kodon untuk menghasilkan campuran gen
bermutasi yang pada gilirannya dapat dipilih dan disaring untuk gen dengan aktivitas katalitik
yang diinginkan. Oligonukleotida primer adalah satu set heterogen urutan DNA untuk
menghasilkan serangkaian mutasi di bagian didefinisikan dari gen sasaran.
Keuntungan dari random mutagenesis adalah sebagai berikut.

Peran asam amino dalam kerja protein tersebut tidak diperlukan.

Sejak berbagai mutan diproduksi dalam proses ini, beberapa protein yang menarik dan
berguna dapat dihasilkan.

Random mutagenesis terbagi menjadi beberapa jenis, yaitu :

1.

Error-prone PCR. Pendekatan ini menggunakan " sloppy " versi PCR, di mana
polimerase memiliki tingkat kesalahan yang cukup tinggi (sampai 2%) untuk
mengamplifikasi jenis sekuens. PCR dapat menyebabkan kesalahan, termasuk
meningkatkan

MgCl2

dalam

reaksi,

menambahkan

MnCl2

atau

menggunakan

konsentrasi yang tidak sama dari masing-masing nukleotida. Setelah amplifikasi, urutan
pengkodean mutan harus dikloning ke dalam plasmid yang sesuai. Kelemahan dari
40

pendekatan ini adalah ukuran perpustakaan yang dibatasi oleh efisiensi langkah kloning.
Meskipun mutasi titik adalah jenis yang paling umum dari mutasi rawan kesalahan PCR,
penghapusan memungkinkan. Ada sejumlah error-prone PCR kits tersedia, termasuk dari
Stratagen dan Clontech.

2.

Rolling circle error-prone PCRadalah varian dari error-prone PCR di mana jenis sekuen
pertama dikloning ke plasmid, maka seluruh plasmid diperkuat dalam kondisi error-prone.
Amplifikasi seluruh plasmid kurang efisien daripada memperkuat urutan coding sendiri.

3.

Strain mutator. Dalam pendekatan ini jenis sekuen yang dikloning ke plasmid berubah
menjadi strain mutator, seperti Stratagen XL1-Red. XL1-merah strain E.coli yang
kekurangan

tiga

dari

jalur

perbaikan

DNA

primer

(muts,

mutD

dan

Mutt)

menyebabkannya untuk membuat kesalahan selama replikasi dari itu DNA, termasuk
cloning plasmid. Akibatnya setiap salinan plasmid direplikasi di strain ini memiliki potensi
untuk menjadi berbeda dari tipe lain. Salah satu keuntungan dari strain mutator adalah
berbagai mutasi dapat dimodifikasi termasuk substitusi, delesi dan frame-shift.
Kelemahan dengan metode ini adalah strain menjadi semakin lemah karena terakumulasi
semakin banyak mutasi di dalamnya genom sendiri sehingga beberapa langkah
pertumbuhan, plasmid isolasi, transformasi dan pertumbuhan kembali yang biasanya
diperlukan.

4.

Temporary mutator strains. Temporary mutator strains dapat dibuat dengan


mengekspresikan alel mutator seperti mutD5 (versi negatif dominan mutD) yang
membatasi kemampuan sel untuk memperbaiki lesi DNA. Dengan mengungkapkan
mutD5 dari promotor diinduksi adalah mungkin untuk memungkinkan sel untuk siklus
antara mutagenik (mutD5 ekspresi) dan normal (mutD5 ekspresi off) periode
pertumbuhan. Periode pertumbuhan yang normal memungkinkan sel untuk pulih dari
mutagenesis, yang memungkinkan strain ini tumbuh selama lebih dari strain mutator
konvensional. Jika plasmid dengan asal suhu-sensitif replikasi digunakan, plasmid
mutagenik dapat dengan mudah dihapus mengembalikan perbaikan DNA normal, yang
memungkinkan mutan yang akan ditanam untuk analisis / skrining.

5.

Insertion mutagenesis. Finnzymes memiliki kit yang menggunakan sistem berbasis


transposon secara acak memasukkan sepasang urutan 15-base seluruh urutan
kepentingan, baik itu insert terisolasi atau plasmid. Ini menyisipkan 5 kodon ke urutan,
memungkinkan setiap gen dengan penyisipan untuk diekspresikan (yaitu tidak ada frameshift atau menghentikan kodon yang penyebabnya). Oleh karena penyisipan adalah acak,

41

setiap salinan dari urutan akan memiliki sisipan yang berbeda dan

menghasilkan

sejumlah besar mutan dengan mencakup biaya rendah dan kecepatan yang tinggi.

6.

Ethyl methanesulfonate (EMS) adalah mutagen kimia. EMS aklylates residu guanidin,
menyebabkan mereka harus benar disalin selama replikasi DNA. Sejak EMS langsung
kimiawi memodifikasi DNA, EMS mutagenesis dapat dilakukan baik secara in vivo (yaitu
seluruh sel mutagenesis) atau in vitro. Contoh in vitro mutagenesis dengan EMS di mana
gen

PCR

mengalami

reaksi

dengan

EMS

sebelum

diikat

ke

plasmid

dan

ditransformasikan.

7.

Nitrous acid adalah mutagen kimia lain. Kerjanya dibantu oleh adenin dan sitosin residu
yang dapat menyebabkan titik transversi mutasi (A / T untuk G / C dan sebaliknya).

8.

DNA shuffling adalah metode yang sangat kuat di mana salinan gen yang sama masingmasing dengan berbagai jenis mutasi secara acak dikocok. Hal ini dilakukan acak
dengan DNA sel kemudian secara acak kembali bergabung dengan fragmen
menggunakan self-priming PCR.

Metode Dalam Site-Directed Mutagenesis


Site-directed mutagenesis adalah metode biologi molekuler yang digunakan untuk
membuat perubahan tertentu dan disengaja untuk urutan DNA dari gen dan produk gen. Sitedirected mutagenesis disebut juga spesifik lokasi mutagenesis atau oligonukleotida diarahkan
mutagenesis, digunakan untuk menyelidiki struktur dan aktivitas biologis DNA, RNA, dan
molekul protein, dan untuk rekayasa protein. Site-directed mutagenesis adalah salah satu teknik
yang paling penting dalam laboratorium untuk memperkenalkan mutasi ke urutan DNA. Namun,
dengan mengurangi biaya sintesis oligonukleotida, sintesis gen buatan sekarang, terkadang
digunakan sebagai alternatif untuk site-directed mutagenesis.
PCR Site-Directed Mutagenesis
Keterbatasan situs pembatasan dalam cassette mutagenesis dapat diatasi menggunakan
polymerase chain reaction (PCR) dengan oligonukleotida primer, sehingga sebuah fragmen
yang lebih besar dapat dihasilkan, meliputi dua situs restriksi. Amplifikasi eksponensial dalam
PCR menghasilkan fragmen yang mengandung mutasi yang diinginkan dalam jumlah yang
cukup untuk dipisahkan dari aslinya, plasmid unmutated dengan elektroforesis gel, yang
kemudian dapat dimasukkan dalam konteks aslinya menggunakan teknik biologi molekuler
rekombinan standar. Ada banyak variasi teknik yang sama.

42

Metode yang paling sederhana menempatkan situs mutasi ke salah satu ujung fragmen
dimana salah satu dari dua oligonukleotida digunakan untuk menghasilkan fragmen
mengandung mutasi. Ini melibatkan satu langkah dari PCR, tetapi masih memiliki masalah
yang melekat memerlukan situs pembatasan cocok dekat lokasi mutasi kecuali primer yang
sangat panjang digunakan. variasi lain, oleh karena itu, mempekerjakan tiga atau empat
oligonukleotida, dua di antaranya mungkin oligonukleotida non-mutagenik yang mencakup dua
situs restriksi nyaman dan menghasilkan sebuah fragmen yang dapat dicerna dan diligasi ke
plasmid, sedangkan oligonukleotida mutagenik mungkin melengkapi lokasi dalam fragmen
yang jauh dari situs pembatasan.
Metode ini memerlukan beberapa langkah dari PCR sehingga fragmen final yang akan
diligasi dapat berisi mutasi yang diinginkan. Proses desain untuk menghasilkan fragmen
dengan mutasi yang diinginkan dan situs restriksi yang relevan dapat menjadi rumit. Sitedirected mutagenesis sangat berguna untuk menjelaskan fungsi dari gen atau protein, atau
untuk menciptakan varian enzim dengan fungsi baru dan ditingkatkan. Sekarang ada banyak
pendekatan yang tersedia untuk menghasilkan mutan site directed.
Teknik yang akan memungkinkan untuk menghasilkan berbagai mutasi, yaitu diantaranya
sebagai berikut.
1.

Teknik 1 : PCR dengan primer yang telah dimodifikasi


Jenis site-directed mutagenesis menggunakan primer PCR dirancang untuk mengandung
perubahan yang diinginkan. PCR primer urutan hanya menggantikan urutan asli, dengan
syarat adanya perubahan yang cukup minimal untuk memungkinkan primer untuk anil
untuk sasaran yang dituju.
Syarat penggunaan :

Limited base identity berubah pada akhir urutan target

5 'atau 3' sisipan terminal <100 basa

2. Teknik 2 : Ekstensi Primer PCR

43

Gambar 9. Ekstensi Primer PCR


(Sumber : neb.com)

Ekstensi primer menggunakan nested primer untuk mutasi daerah sasaran.


Dalam diagram, primer B dan C mengandung urutan mis-matched untuk menyisipkan
basa. Putaran pertama PCR menggunakan primer A-B dan C-D untuk membuat dua
produk dengan urutan mutasi.
Tahap kedua PCR adalah di mana urutan baru dibuat. Karena primer B dan C
mengandung urutan komplementer, produk dari putaran pertama akan berhibridisasi
setelah mereka berubah sifatnya mengikuti siklus PCR pertama. Primer A-D kemudian
dapat digunakan untuk memperkuat produk yang sangat panjang yang berisi mutasi yang
diinginkan. Perubahan metode ini juga dapat membuat penghapusan atau penambahan
kembali.
Syarat penggunaan :

3.

Terbatas, non-random basa mengubah internal menjadi sekuens target

Insersi >100 basa

Delesi < 50 basa

Delesi > 50 basa

Teknik 3 : Invers PCR


Inverse PCR digunakan untuk bermutasi plasmid. Metode ini menggunakan dua

primer back-to-back untuk memperkuat seluruh plasmid dan produk linear kemudian
diikat kembali ke bentuk melingkar. Primer daerah yang mengikat dapat diubah dengan
mengubah urutan primer mengandung mutasi yang diinginkan. Sisipan dapat dibuat di
44

sekitar daerah mengikat primer dengan menambahkan urutan mengapit ke primer, dan
penghapusan dapat dilakukan dengan hanya menyisakan ruang antara dua primer.
Syarat penggunaan IPCR adalah sebagai berikut.

Insersi > 100 basa

Delesi < 50 basa

Delesi > 50 basa

2.6.2 Pemilihan Vektor dan Host yang Tepat Untuk Teknik Mutagenesis
i) Pemilihan Vektor
Pembentukan DNA untai tunggal menjadi penting ketika melakukan DNA
sequencing dan site-directed mutagenesis. DNA untai tunggal merupakan template yang
optimal untuk sebagian besar polimerase, karena situs spesifik pada DNA terklon harus
diganti dengan presisi dan telah ditentukan sebelumnya. Maka dari itu, vektor yang
digunakan dapat berupa bakteriofag M13 atau plasmid (fagemid pBluescript).
M13 dapat digunakan untuk sekuensing DNA (penentuan urutan basa) dan
mutagenesis tapak terarah (site-directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA M13
dapat dijadikan template polimerisasi DNA dalam kedua proses tersebut. Fitur unik dari
bakteriofag M13 adalah ia dapat bereplikasi dalam bentuk DNA untai tunggal. DNA M13
akan diselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif
tanpa menyebabkan lisis. Karena fag M13 terselubungi dengan cara pembentukan
kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat
disisipkan kepadanya. Semua DNA untai tunggal merupakan satu untai DNA spesifik,
yaitu untai (+). Untai ini dikemas dalam protein selimut bakteriofag, yang melindungi DNA
saat berada di luar sel E. coli. Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali
daerah pada DNA-nya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Tempat pengenalan
restriksinya pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk
mengatasi masalah tersebut.
Vektor fagemid juga dapat digunakan dalam beberapa strain E. coli untuk
menghasilkan DNA untai tunggal yang mengandung urasil yang menggantikan residuresidu timin, dan merupakan substrat yang baik untuk beberapa tipe oligonucleotidedirected mutagenesis.
Fagemid merupakan vektor chimeric, yang merupakan turunan dari ssDNA
bakteriofag M13, fd, atau f1 yang bereplikasi secara normal sebagai plasmid dalam sel
inang bakteri. Fagemid secara lengkap mengombinasikan fitur-fitur yang dimiliki oleh
45

plasmid dan filamen bakteriofag. Vektor ini merupakan plasmid dengan copy number yang
tinggi dan membawa versi termodifikasi dari daerah antargen bakteriofag.
Fagemid mempunyai beberapa fitur-fitur menguntungkan yang mengatasi masalah ketika
melakukan kloning dengan bakteriofag M13, antara lain:
1.

Mempunyai positive selectable marker yang dapat menseleksi bakteri mana yang
telah terintegrasi dengan fagemid (berhasil melakukan transformasi genetik).

2.

Menghasilkan DNA untai tunggal lebih tinggi.

3.

Mengeliminasi proses subkloning fragmen DNA dari plasmid ke vektor bakteriofag


filamen yang lama.

4.

Mengurangi frekuensi dan jumlah delesi dan pengurutan ulang dalam DNA untai
tunggal secara signifikan.

5.

Bisa mengisolasi DNA berukuran beberapa kb untuk diisolasi dalam bentuk untai
tunggal.

2.6.3 Pemilihan Sel Inang (Host)


Pemilihan sel inang untuk mutagenesis sebenarnya tergantung dari jenis mutagenesis yang
sedang dilakukan. E. coli merupakan salah satu sel inang yang dapat digunakan untuk
mutagenesis. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan sel inang, antara lain:
1. Untuk site-directed mutagenesis:
Memiliki genotip mutS, mutH, atau mutL. Pada dasarnya, bakteri memiliki sistem penolakan
modifikasi berupa pembenaran mismatch repair. Maka dari itu, sel inang yang digunakan
haruslah sel yang kehilangan kemampuannya untuk membenarkan mismatch. Hal ini akan
menuntun pada efisiensi mutasi yang tinggi. Karena site-directed mutagenesis sering
melibatkan intermediet yang mengandung heterodupleks mutan dan wild type, diperlukan
juga mutS yang menstabilisasi heterodupleks DNA saat site-directed mutagenesis
berlangsung.
2. Untuk random atau chemical mutagenesis:
Memiliki genotip mutD. Frekuensi spontanitas terjadinya mutasi pada E. coli dapat
ditingkatkan sampai sebanyak 3-4 kali oleh mutasi mutD, yang mengkode 3 5 subunit
eksonuklease dari holoenzim DNA polimerase III. Maka, random mutagenesis dapat dicapai
dengan mempertahankan plasmid dalam strain mutD

untuk sejumlah generasi dan

selanjutnya melakukan transformasi plasmid termutasi ke strain tester mutD +.


3. Untuk Kunkel mutagenesis:

46

Memiliki genotip dut

dan ung

yang tidak mengekspresikan dUTPase atau uracil-N-

glycosylase, yang mengakibatkan substitusi sesekali timin oleh urasil pada DNA yang
disintesis. DNA template untai tunggal didapatkan dari sel inang bergenotipe dut dan ung ,
kemudian primer mutan ditempelkan pada template dan untai kedua disintesis. Transformasi
heterodupleks selanjutnya menjadi strain ung+ mengakibatkan degradasi untai induk yang
mengandung urasil, sehingga akan dijumpai lebih banyak untai mutan.
Tabel 5. Berbagai strain E.coli yang dapat digunakan sebagai sel inang untuk mutagenesis

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

2.6.4 Introduksi Gen Mutan Mengandung Multi- Situs Mutasi Menggunakan PCR
Langkah - langkah umum introduksi gen mutan dengan menggunakan PCR digambarkan
dengan skema sederhana berikut ini.
1.

Plasmid untai ganda (dapat juga untai tunggal) yang akan digunakan sebagai template
ditempeli oleh primer yang telah di-desain sedemikian rupa sehingga mengandung mutasi
yang diinginkan.

2.

Menjalankan proses PCR untuk mensintesis sekuens komplementer dengan template.

3.

Template kemudian dihancurkan dengan menggunakan enzim restriksi bergantungmetilasi DpnI sehingga terbentuk plasmid mutan yang sirkuler.

4.

Mentranformasi

plasmid

mutan

ke

bakteri

superkompeten.

Untuk

memastikan

transformasi berhasil dapat menggunakan validasi dengan PCR atau cara-cara lain.

47

Gambar 10. Skema umum Introduksi Mutasi Menggunakan PCR (Sumber : Addgene.com)

Gambar 11. Skema Langkah Langkah Introduksi Mutasi PCR dengan Protokol QCM Lightning
(Sumber : agilent.com)

Kriteria pembuatan primer termasuk temperatur leleh (Tm) dan lain-lain dapat mengadopsi
protokol Stratagene Quikchange Lightning untuk mutagenesis multi-site, yaitu sebagai
berikut.
1.

Kedua primer mutagenik (yang komplementer) harus mengandung mutasi yang diinginkan
dan menempel pada sekuens yang sama pada untai yang berlawanan dari plasmid.

48

2.

Panjang primer harus berada pada rentang 25 45 basa. Lebih dari 45 basa dapat
digunakan namun memperbesar risiko terbentuknya struktur sekunder.

3.

Temperatur leleh (Tm) minimal 750C. Rumus untuk menghitung temperatur leleh secara
umum adalah

Dengan N adalah panjang primer (dalam basa) dan nilai dari (%GC) dan (%mismatch)
adalah bilangan bulat.
Sementara rumus untuk menghitung primer untuk mengintroduksi insersi atau delesi
adalah:

Dengan N adalah jumlah basa dalam primer (N tidak termasuk jumlah basa yang diinsersi
atau yang didelesi).
4.

Mutasi yang diinginkan harus berada di tengah tengah primer, diapit oleh 10-15 basa
yang bersesuaian dengan template.

5.

Kandungan GC minimal adalah 40% dan primer diakhiri dengan satu atau lebih basa G
atau C.
Terdapat ketentuan lain dalam membuat primer yang dikemukakan oleh Zheng, dkk.

Zheng, dkk. mengadakan riset menggunakan modifikasi ketentuan primer dari protokol
Stratagene Quikchange . Dihasilkan syarat pembuatan primer yaitu sebagai berikut.
1.

Sedikitnya delapan basa berada pada bagian non-overlapping pada ujung 3.

2.

Mutasi target harus berada pada kedua primer.

3.

Sedikitnya satu basa G atau C mengakhiri primer pada ujung 3


Dengan menggunakan prosedur yang dikemukakan Zheng, dkk., situs mutasi dapat diapit

oleh minimal 4 basa pada ujung 5 dan 6 8 basa pada ujung 3 (alih-alih 10-15 basa seperti
pada protokol standard Stratagene Quikchange), dan juga tidak ada batasan T m untuk primer
yang disintesis. Berikut adalah ilustrasi desain primer yang dibuat oleh Zheng, dkk., di mana ia
membuat kedua primer mempunyai bagian yang komplementer (overlapping) dan ujung 3 yang
non-overlapping.

49

Gambar 12. Ilustrasi Desain Primer (Zheng, et.al., 2004)

Situs mutasi yang berdekatan (hanya dipisahkan belasan atau dua puluhan basa) tidak
memungkinkan untuk perancangan primer yang mengikuti protokol standard dari Stratagene
Quikchange, oleh karena itu, Jensen, dkk. (2005) menciptakan sebuah teknik untuk
mensintesis primer yang mengandung dua atau lebih mutasi yang berdekatan. Seperti Zheng,
dkk., mereka menggunakan dua primer yang overlap parsial namun mutasi yang diinginkan
tidak berada pada bagian overlap; dan bagian overlap ada pada ujung 3', tidak seperti pada
Zheng, dkk. yang bagian overlapnya ada pada ujung 5. Hasil perbanyakan PCR primer ini
menjadi primer untuk perbanyakan PCR menggunakan DNA template.

Gambar 13. Ilustrasi desain primer


(Jensen, et.al, 2005)

Untai antisense mengandung komplemen dari situs mutasi yang letaknya setelah mutasi
yang ada pada untai sense.
Sementara untuk langkah langkah amplifikasi PCR mengadopsi protokol Stratagene
Quikchange Lightning adalah sebagai berikut.
1.

Mempersiapkan template DNA untai ganda menggunakan protokol miniprep StrataPrep


Plasmid Miniprep Kit.

50

2.

Mempersiapkan sintesis untai mutan untuk siklus termal. Komponennya adalah sebagai
berikut.
Tabel 6 Kebutuhan template berdasarkan basa yang ingin diPCR

(Sumber : Casali dan Preston, 2003)

3.

Jika thermal cycler tidak mempunyai hot-top assembly, tiap reaksi di-overlay dengan
minyak mineral kira-kira 30 L.

4.

Menjalankan siklus termal PCR menggunakan primer yang telah didesain dengan rincian
sebagai berikut.
Segmen 1 : Satu siklus PCR pada suhu 950C selama 2 menit
Segmen 2 : Terdiri dari 30 siklus PCR pada suhu 950C selama 20 detik, lalu 550C selama
30 detik, dilanjutkan dengan suhu 650C selama 30 detik per kb panjang plasmid.
Segmen 3 : Satu siklus PCR pada 650C selama lima menit.

5.

Setelah siklus termal dijalankan, reaksi ditempatkan di es selama 2 menit untuk


mendinginkan reaksi hingga 370C.

6.

Mendigesti template dengan enzim restriksi DpnI dengan menambahkan DpnI ke setiap
reaksi amplifikasi di bawah minyak mineral menggunakan pipet.

7.

Mencampurkan campuran pada nomor 4 secara hati-hati, melakukan mikrosentrifugasi


selama 1 menit, dan menginkubasi pada suhu 370C selama 5 menit untuk
menghancurkan template DNA.
Protokol Stratagene Quikchange Lightning Multi merupakan protokol khusus untuk

mutagenesis dengan banyak situs mutase (multi-site). Protokol ini memiliki keunggulan yaitu
tiga kali lebih cepat dibandingkan protokol standar Stratagene Quikchange dan lebih efektif.
Selain itu, protokol Stratagene Quikchange biasa digunakan untuk insersi dan deles
51

BAB III
STRATEGI MUTAGENESIS
Diagram Alir Proses Kloning dan Proses Mutagenesis

Gambar 14 Diagram Alir Pengerjaan


(Sumber: Dokume Pribadi)

52

Terlebih dahulu kloning dilakukan karena tidak ada plasmid yang secara alami mengandung
gen iso-1-cytochrome c dari yeast.
3.1 Pemilihan Vektor dan Sel Inang (Host) yang Tepat
Untuk mensimplifikasi proses dan menghemat biaya, maka digunakan vektor serta sel
inang yang sama untuk kloning dan mutagenesis. Yang berbeda hanyalah sel inang untuk
ekspresi protein mutan.
a. Dasar Pertimbangan dalam Pemilihan Vektor Kloning dan Mutagenesis
Dalam kasus ini, vektor yang dipilih adalah pBluescript II SK (+). Fagemid pBluescript dipilih
karena ia memenuhi syarat-syarat yang dibutuhkan sebagai vektor, antara lain memiliki banyak
situs pengenalan restriksi, memiliki selectable marker berupa gen resisten antibiotik ampicillin
(AmpR), memiliki penanda histokimia berupa gen LacZ, dan sebagainya seperti yang telah
dibahas di bagian tinjauan pustaka. Selain itu, beberapa keuntungan dalam menggunakan
vektor pBluescript II, antara lain:
Tidak melakukan replikasi melalui siklus M13, sehingga mengurangi kecenderungan
untuk mendelesi DNA sisipan, bahkan jika gen sisipan mencapai 10 kb.
Pengemasan pBluescript II yang mengandung sisipan terbilang efisien karena
ukurannya lebih kecil daripada M13 jenis wild-type.
Mutagenesis pada pBluescript II bersifat menguntungkan karena sisipan termutagenesis
terletak di antara promoter T3 dan T7, sehingga transkripsi mutan dapat disintesis
secara in vitro tanpa subkloning ke vektor bakteriofag M13.
Vektor pBluescript II berasal dari E. coli strain dam+ yang termetilasi dan merupakan
template yang tepat untuk mutagenesis. Vektor ini juga dapat bereplikasi secara
konvensional sebagai plasmid untai ganda. Fagemid ini memang didesain untuk cloning
DNA, pengurutan DNA, site-directed mutagenesis, dan transkripsi dalam sistem tunggal
in vitro, subtractive hybridization, dan strand-specific radiolabeled probes.
Salah satu fitur yang ada pada vektor pBluescript tetapi tidak dijumpai pada vektor pUC
adalah promoter yang mengapit MCS, membuatnya bisa melakukan transkripsi DNA
sisipan pada kedua untai. Kedua promoter T7 dan T3 dikenali oleh RNA polimerase
bakteriofag yang dapat disediakan in trans. Mereka tidak menyalin gen plasmid sel
inang atau gen plasmid lain, sehingga transkripsi DNA sisipan bisa lebih spesifik.

53

Gambar 15Vektor pBluescript II SK (+) (Sumber : www. transomics.com)

Gambar 16Daerah MCS pBluescript II SK (+/-) (Sumber : Stratagene)

54

Tabel 7. Fitur yang terdapat dalam pBluescript SK (+) dan keterangannya (Sumber : Stratagene)

Vektor pBluescript merupakan fagemid. Ia mengandung ORI bakteriofag M13,


sehingga dapat menghasilkan DNA untai tunggal yang bermanfaat bagi pengurutan
DNA (DNA sequencing) atau mutagenesis tapak terarah (site-directed mutagenesis).
Replikasi untai tunggal diinisiasi dengan menginfeksi fage pembantu yang mengkode
fungsi penting. Protein gen II yang dikode fage pembantu mengenalkan nick di situs
spesifik daerah antargen fagemid dan menginisiasi replikasi pBluescript yang
memiliki gen sisipan secara lengkap (tapi tidak termasuk sekuens lambda fage),
menghasilkan banyak salinan plasmid DNA untai tunggal yang kemudian
disirkulerisasi oleh protein gen II. Salinan ini kemudian dikemas dalam partikel
bakteriofag, yang nantinya disekresikan ke medium. Partikel bakteriofag ini dapat
diperoleh menggunakan presipitasi polietilen glikol dan DNA untai tunggal dipurifikasi
menggunakan ekstraksi fenol. Vektor pBluescript memiliki copy number sebesar 300500.
Untuk pBluescript, terdapat dua orientasi yang mungkin, yaitu + jika ia memiliki
orientasi sama dengan ORI plasmid (sense)dan - jika ia memiliki orientasi
berlawanan dengan ORI plasmid (antisense). Terdapat dua orientasi polylinker yaitu
KS dan SK, di mana pada orientasi KS, situs restriksi KpnI lebih dekat pada promoter
LacZ dan SacI lebih jauh dari promoter LacZ, dan SK sebaliknya.
Semua pBluescript II memiliki panjang sekitar 2961 pb, dan merupakan turunan dari
vektor pUC19. Fagemid pBluescript II mengandung 454 pb daerah antargen fage f1
(berhubungan dengan M13), yang termasuk dalam 307 pb ORI.
pBluescript II memiliki polylinker ekstensif dengan 21 situs pengenalan enzim restriksi
yang unik sebagai MCS. Polylinker tersebut diapit oleh promoter T7 dan T3 RNA
polimerase yang digunakan dalam mensintesis RNA in vitro untuk PCR. Sekuens
promoter polylinker T7 dan T3 RNA polimerase terdapat di bagian N-terminal
55

fragmen gen LacZ. Fagemid pBluescript II yang tidak disisipi gen iso-1-sitokrom pada
polylinker akan menghasilkan koloni biru pada sel inang yang tepat. Sedangkan,
fagemid yang berhasil disisipi gen iso-1-sitokrom akan menghasilkan koloni putih,
karena gen tersebut mengganggu daerah pengkodean fragmen gen LacZ.

b. Dasar Pertimbangan dalam Pemilihan Sel Inang untuk Kloning dan Mutagenesis
Karena dalam kasus ini yang digunakan adalah site-directed mutagenesis, maka sel
inang yang dipilih harus memenuhi kriteria-kriteria untuk site-directed mutagenesis. Dari
tabel di bawah, dapat dilihat bahwa sel inang yang mungkin digunakan adalah E.coli
strain BMH 71-18 mutS atau E.coli strain XL-mutS. Strain tersebut merupakan turunan
dari E.coliK-12.

Gambar 3.Plate vektor mutan dalam E. coli XL-10 Gold ultracompetent


(Sumber: www.people.virginia.edu)

Pada kasus ini, karena yang dilakukan adalah multi-site directed mutagenesis, di mana
dilakukan pada beberapa titik, maka sesuai dengan protokol Quikchange, sel inang
yang direkomendasikan adalah XL-10 Gold ultracompetent yang memiliki efisiensi
transformasi 5 kali lebih tinggi dibanding XL-1 Blue. Efisiensi transformasinya mencapai
> 5 x 109 transforman. XL-10 Gold sendiri merupakan turunan dari lini sel kompeten XL-

56

1 atau XL-2 Blue MRF, sehingga koloni yang dihasilkannya lebih banyak. XL-10 Gold
memiliki fenotipe-fenotipe sebagai berikut:

Hte yang meningkatkan efisiensi transformasi bagi DNA plasmid terligasi berukuran
besar. Untuk mencegahnya kehilangan efisiensi, maka sel inang ini harus disimpan
pada temperatur -800C.

endA1

(endonuclease

deficient)

yang

menghilangkan

aktivitas

nonspesifik

endonuklease I, sehingga meningkatkan yield dan kualitas plasmid DNA yang


terisolasi.

gyrA96 yang menunjukkan mutasi DNA gyrase, sehingga meningkatkan resistansi


terhadap nalidixic acid.

lac mcrA183 (mcrCB-hsdSMR-mrr)173. McrA, McrCB, McrF, Mrr, dan HsdR telah
dihilangkan dari sel ini. McrA dan McrCB mengenali dan memotong sekuens DNA
sitosin termetilasi, Mrr mengenali dan memotong sekuens DNA adenine termetilasi,
juga sekuens DNA sitosin termetilasi yang spesifitasnya berbeda dari McrA dan McrCB.
Aktivitas ini dinamakan McrF. Sedangkan, mutasi hsdR mencegah pembelahan DNA
terklon oleh sistem endonuklease EcoK (hsdR).

recA1 (recombination deficient) yang memastikan stabilitas gen sisipan.

Tn10 (TetR) dan CamR yang melambangkan transposon yang mengkode resistensi
pada antibiotik tetracycline dan chloramphenicol.

Amy yang menunjukkan bahwa ia dapat mengekspresikan amilase sehingga dapat


menggunakan amilosa.

supE44 yang menekan mutasi kodon amber yang membaca kodon UAG dalam
translasi dan menyisipkan asam amino glutamin.

thi-1 yang menunjukkan keperluan nutrisi thiamine untuk memberikan pertahanan.

proAB yang menunjukkan bahwa ia membutuhkan prolin dalam medium tumbuh karena
biosintesis prolinnya termutasi.

lacIq ZM15 dengan delesi fragmen alfa N-terminal dari gen LacZ, menyebabkan fungsi
beta galaktosidase bergantung pada ekspresi fragmen LacZ dari plasmid. Adanya
lacIqZM15 menyebabkan analisis vektor pada sel inang dapat menggunakan bluewhite screening.

F yang menunjukkan genotip pembawa tambahan gen untuk faktor fertilitas atau
episome F.

57

c. Dasar Pertimbangan dalam Pemilihan Sel Inang untuk Ekspresi

Gambar 4.Bakteri E. coli BL-21 (DE3)


Sumber: www.the-odin.com

E. coli dengan strain yang berbeda akan memiliki genotipe yang berbeda pula. Ada E.
coli yang dikhususkan untuk transformasi dan kloning, ada pula E. coli yang
dikhususkan untuk ekspresi protein. Umumnya, E. coli tidak dapat memiliki keunggulan
untuk dua sifat secara bersamaan. Strain E. coli XL-10 Gold ultracompetent memang
unggul dalam efisiensi transformasi dan kloning plasmid, namun tidak begitu unggul
dalam hal ekspresi protein iso-1-sitokrom c. Maka dari itu, jika ingin menghasilkan yield
protein yang lebih besar, maka fagemid mutan yang telah mengalami replikasi dalam
sel inang dapat dipurifikasi kemudian ditransformasi ke E. coli strain BL-21 (DE3), yang
memiliki genotipe pendukung ekspresi protein, antara lain:

ompT yang memutasi protease membran luar, sehingga meningkatkan yield dari
protein rekombinan.

gal yang memutasi metabolisme galaktosa sehingga bakteri tidak dapat memanfaatkan
galaktosa.

hsdSB yang menginaktivasi aktivitas pengenalan situs Eco (menghilangkan sistem


restriksi dan metilasi Eco).
E. coli turunan DE3 ini mengandung gen T7 RNA polimerase yang dikontrol oleh
promoter lacUV5. Ekspresinya diinduksi oleh IPTG. E. coli ini menghasilkan ekspresi

58

tingkat tinggi dan mudah terinduksi, dan digunakan untuk protein nontoksik seperti iso1-sitokrom c.
3.2 Langkah Langkah Insersi Gen Iso-1-Cytochrome cWild Type ke Plasmid pBluescript
SK (+)
a. Pembuatan Primer Untuk Perbanyakan Gen Iso-1-Cytochrome c yeast dengan
PCR
Gen yang akan diinsersi terdiri dari semua basa nukleotida dalam sekuens gen iso-1cytochrome c yeast. Maka primer yang terbentuk adalah :
Forward primer
5 GGGCCC GGGTAC ATG TTATTC 3 (garis bawah menunjukkan situs restriksiKpnI)
Reverse primer
5 ATA AATACCAACCC CTA GAGCTC GGGCCC 3 (garis bawah menunjukkan situs
restriksiSacI)
b. Proses Amplifikasi Gen Iso-1-Cytochrome c Dengan PCR
Proses PCR melibatkan pengulangan tiga tahap ini:
Denaturasi :Denaturasi adalah proses pemisahan dua untai nukleotida dari molekul
DNA. pada suhu 900 950 C selama 30 detik. Akibat dari pemanasan, ikatan
hidrogen antara basa nitrogen pada untai ganda akan melemah sehingga putus dan
menjadi dua buah untai tunggal DNA.
Penempelan Primer (Annealing) :Proses ini adalah ketika primer menempel di untai
tunggal DNA. Desain primer harus memiliki situs restriksi yang sama dengan situs
restriksi vektor, agar dapat komplemen dengan DNA vektor. Proses ini dilakukan pada
suhu 40 650 C selama 20-40 detik.
Ekstensi (Pemanjangan) :Setelah primer menempel pada template yang
komplemen, enzim polimerase memulai sintesis. Suhu yang digunakan berkisar antara
75 800 C. Enzim Taq Polimerase yang tahan terhadap suhu tinggi akan mensintesis
DNA baru dari ujung 3 primer dengan memasangkan nukleotida dNTP pada template,
sehingga pada akhirnya akan dihasilkan 2 buah DNA double strand baru.
Temperatur leleh untuk masing-masing primer yang telah didesain dianalisis
menggunakan multiple primer analyzer dari Thermofischer (masing-masing 56,3 dan
64,3oC). GC content dari kedua primer tersebut juga dalam rentang yang
direkomendasikan (40-60%)yaitu masing-masing 57,1% dan 55,2%. Kedua primer
juga tak menimbulkan primer dimer baik self-dimer maupun cross dimer (dapat

59

menempel dengan primer lainnya). DNA polimerase yang tepat digunakan untuk PCR
pada suhu tinggi adalah Taq polimerase.

c. Proses Insersi Gen Iso 1- Cytochrome c ke Plasmid pBluescript SK (+)


Prosedur Pengerjaan
1. Pemotongan plasmid pBluescript SK II (+)
Pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi KnpI (657bp) danSacI
(759bp)yang berada di Multiple Cloning Sites (MCS). Agar dapat bekerja dengan
baik, enzim restriksi membutuhkan buffer yang diantaranya berisi ion dan garamgaraman.
2. Purifikasi pBluescript SK II (+) dan gen iso-c-1-cytochromec
Langkah ini diperlukan untuk memurnikan pBluescript SK II (+) dan gen iso-c-1cytochromedari enzim yang merestriksinya dan juga dari potongan-potongan lain
yang tidak diperlukan. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Plasmid yang diinginkan dan fragmen gen yang diinginkan dapat terlihat
sebagai pola pada gel.

Gambar 17.Proses Purifikasi Plasmid Menggunakan Elektroforesis Gel (Termofischer.com)

60

3. Modifikasi gen iso-1-cytochrome cmenggunakan metilase


Modifikasi dengan penambahan gugus metil dilakukan agar sistem restriksi
E.colinantinya tidak akan memotong gen iso-1-cytochrome cyang dianggap asing
baginya.
4. Penyambungan pBluescript SK II (+) dengan iso-1-cytochrome c
Pada langkah ini, plasmid pBluescript SK II (+) yang sudah terpotong dicampurkan
dengan gen iso-1-cytochrome cdan DNA ligase T4 dalam satu tabung untuk
memperoleh pBluescript SK II (+) yang mengandung gen yang diinginkan.
3.3 Transformasi yang Digunakan Dalam Proses Kloning Gen Iso-1-Cytochrome c
yeast ke Bakteri E.coli
Transformasi yang digunakan adalah transformasi heat shock karena ukurannya di
bawah 7 kb. Langkah langkah transformasi heat shock adalah sebagai berikut.
1. Bakteri E.coli yang tidak mengandung plasmid rekombinan (tidak resisten terhadap
ampicillin dan tidak dapat menghasilkan enzim -glukosidase) ditumbuhkan hingga
mencapai fase log, lalu diintroduksi pada lingkungan larutan CaCl2 dingin dengan
temperatur 00C.
2. Plasmid rekombinan yang resisten terhadap ampicillin dan dapat menghasilkan enzim glukosidase ditambahkan pada bakteri E.coli yang belum mengandung plasmid
rekombinan, yang masih diinkubasi dalam es selama 20-30 menit. Plasmid rekombinan
sebaiknya tidak ditambahkan terlalu banyak karena larutan sel bakteri yang jenuh oleh
plasmid rekombinan akan menurunkan efisiensi transformasi.
3. Sel bakteri diberi kejutan panas secara tiba-tiba dengan menaikkan temperatur sampai
420C selama 50 detik. Kejutan panas sebaiknya tidak diberikan terlalu lama karena akan
mengurangi jumlah transforman. Bakteri E.coli kompeten kemudian dapat dimasuki oleh
plasmid rekombinan dengan mudah.
4. Transforman diinkubasi dalam agar pada temperatur 370C selama 60-90 menit untuk
membiarkan plasmid terintegrasi dalam E.coli dengan sempurna, juga agar sifat fenotipe
dapat diekspresikan.
5. Bakteri E.coli yang telah diberi perlakuan agar bisa bertransformasi genetik lalu
ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampicillin, dan diinkubasi selama 24 jam.

61

3.1 Pemilihan Klon yang Tepat Menggunakan Skrining Biru-Putih dan Seleksi Resistensi
Antibiotik
Setelah plasmid rekombinan berhasil masuk dalam E.coli dan melakukan replikasi,
selanjutnya kita melakukan skrining dan seleksi untuk menentukan apakah gen yang
diinginkan (iso-1-cytochrome c) telah sukses terligasi pada vektor E.coli dan mengetahui
apakah E.coli berhasil melakukan transformasi genetik dengan plasmid rekombinan, juga
memilih klon mana yang tepat untuk dikultur selanjutnnya. Metode ini dipilih karena plasmid
yang digunakan (plasmid pBluescript II SK (+)) memiliki LacZ, tetapi pada tahap
sebelumnya kita telah menginsersi gen -glukosidase pada multiple cloning site gen LacZ
yang mengganggu fragmen LacZ- dan menghambat pembentukan peptida , sehingga
enzim -galaktosidase tidak berfungsi sempurna dan tidak dapat menguraikan substrat
IPTG menjadi galaktosa dan senyawa berwarna biru. Berarti, bakteri E.coli yang telah
mengalami transformasi genetik dengan plasmid rekombinan akan menghasilkan warna
putih. Sedangkan, E.coli yang mengalamai transformasi genetik dengan plasmid yang tidak
sukses terligasi gen yang diinginkan atau tidak mengalami transformasi genetik sama sekali
akan menghasilkan warna biru.

Gambar 18 Hasil Blue-White Screening


(Sumber : sigmaaldrich.com)

Hasil blue-white screening dapat digambarkan sebagai berikut : koloni bakteri


berwarna biru dan putih. Koloni putih merupakan koloni yang diperkirakan mengandung
fragmen gen penghasil -glukosidase, sedangkan koloni biru diperkirakan merupakan koloni
yang tidak mengandung fragmen gen penghasil -glukosidase.
Selain itu, karena plasmid pBluescript II SK (+) yang memiliki gen pembawa sifat
resistensi terhadap terhadap antibiotik ampicillin (AmpR), maka metode inaktivasi insersi

62

(skrining biru putih) digabungkan dengan metode resistensi antibiotik. Gen AmpR yang
terdapat dalam plasmid pBluescript II SK (+) akan menyandi enzim -laktamase yang
mampu menghidrolisis ikatan 4-cincin betalaktam dari antibiotik beta-laktam seperti
ampicillin, dan mendegradasinya sehingga bakteri E.coli tidak akan mati karena keberadaan
antibiotik tersebut. Maka dari itu, ketika E.coli pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan
dalam media yang mengandung ampicillin, maka E.coli tersebut akan tetap tumbuh,
sementara E.coli yang tidak membawa plasmid rekombinan akan mati.
Seleksi dengan resistensi antibiotik merupakan metode yang cukup penting
dilakukan untuk mempertahankan gen AmpR yang terdapat di pBluescript II SK (+). Tanpa
adanya ampicillin, E.coli cenderung
kehilangan resistensinya setelah beberapa kali pembelahan sel, padahal sifat
resistensi ini penting dalam proses produksi selanjutnya, agar E.coli tidak mudah mati
dalam lingkungan yang mengandung ampicillin di dalamnya.

Gambar 19.E.coli yang tidak memiliki gen AmpR (tidak berhasil melakukan transformasi genetik) akan
tumbuh dalam medium yang tidak mengandung ampicillin(Sumber: Pearson Education, 2016)

Setelah melewati tahap skrining dan seleksi, dapat diketahui bahwa E.coli yang
berhasil melakukan transformasi genetik dengan plasmid rekombinan adalah E.coli yang
menghasilkan warna putih ketika diskrining dan tetap hidup saat ditumbuhkan dalam
medium yang mengandung ampicillin.
Prosedur Pengerjaan
Langkah-langkah dalam melakukan skrining biru-putih dan seleksi resistensi
antibiotik, meliputi:
1. Preparasi agar Luria-Bertani sebagai medium yang berisi nutrien pertumbuhan bakteri.
2. Penambahan substrat kromogenik (X-gal) dan IPTG.
3. Autoklaf medium (tahap ini opsional, tergantung strain E.coli yang digunakan).
63

4. Penambahan antibiotik ke dalam medium, berupa ampicillin.


5. Penempatan piringan dalam laminar flow chamber.
6. Penyebaran E.coli yang sudah melakukan transformasi genetik pada piringan agar
menggunakan sterile spreader.
7. Inkubasi piringan pada temperatur 370C selama 24-48 jam. Koloni biru dan putih akan
muncul pada permukaan agar, dan pilih koloni bakteri berwarna putih untuk
selanjutnya dilakukan kultur.

3.4 Pemilihan Mutasi yang Membuat Protein Iso-1-Cytochrome Paling Stabil


Mutasi yang kami pilih adalah mutasi pada tiga titik yaitu Q69E/K96A/T103C. Penggantian
Threonine menjadi Sistein dan penggantian Glutamine menjadi Asam Glutamat
memberikan kontribusi yaitu menstabilkan protein (termasuk asam amino stabilizing),
sementara pergantian Lysine menjadi Alanine tidak terlalu berpengaruh dalam peningkatan
Tm, di mana Tm juga dapat mengindikasikan kestabilan suatu protein.
3.5 Introduksi Gen Mutan dengan Menggunakan PCR
Gen iso-1-cytochrome c yang telah lolos uji ekspresi merupakan gen yang dapat
menghasilkan protein iso-1-cytochrome c wild type yang fungsional. Oleh karena itu,
plasmid yang mengandung gen yang tepat tersebut dapat dijadikan template untuk
introduksi gen mutan menggunakan PCR. Jadi, plasmid pBluescript SK (+) yang
mengandung gen iso-1-cytochrome yang fungsional diisolasi dari koloni E.coli kemudian
dijadikan template untuk PCR.
i) Pembuatan Primer Untuk Mutagenesis
Pertama-tama diperlukan suatu desain primer yang mengandung situs mutasi yang
diinginkan. Karena mutasi yang dipilih memiliki tiga situs mutasi, maka secara kasar
akan ada tiga pasang primer (terdiri dari primer forward dan reverse).
Sekuens asam amino dan sekuens nukleotida dari gen iso-1cytochrome c adalah
sebagai berikut.

64

Keterangan :
Pada Sekuens protein
Lingkaran merah : Threonine (T) ke 103
Lingkaran kuning : Lysine (K) ke 96
Lingkaran biru : Glutamine (Q) ke 69
Pada Sekuens gen
Garis merah : Start kodon (Methionine / M)
Garis biru : Glutamine (Q) ke 69
Garis hijau : Lysine (K) ke 96
Garis ungu : Threonine (T) ke 103

1. Pembuatan Primer Set 1 (primer yang mengandung mutasi pada Glutamine ke 69


menjadi Asam Glutamat)
Kodon DNA Glutamine diketahui dari sekuens di atas adalah CAA, sedangkan
kodon DNA Asam Glutamat adalah GAA atau GAG. Solusi yang paling mudah
untuk mengubah Glutamine menjadi Asam Glutamat adalah mengganti basa C
pada CAA menjadi G.
Lima

belas

basa

nukleotida

di

ujung

kodon

CAA

adalah

GTTGAATGGTCTGAA, sedangkan 15 basa nukleotida di ujung 3 basa C (tempat


introduksi mutasi) adalah AAACCATGAGTGATTA (agar panjang primer minimal 25
basa).
65

Maka primer forward yang terbentuk adalah :


5 GTTGAATGGTCTGAAgAAACCATGAGGATTA 3 dengan yang digarisbawahi
adalah kodon asam amino mutan.
Primer reverse yang terbentuk adalah reverse dari primer forward :
5 TAATCCTCATGGTTTcTTCAGACCATTCAAC 3 dengan huruf kecil adalah
mutasi yang akan diintroduksi.

2. Pembuatan Primer Set 2 (Primer yang mengandung mutasi pada Lysine ke 96


menjadi Alanine dan mutasi pada Threonine ke 103 menjadi Sistein)

Kodon DNA Lysine diketahui pada sekuens di atas adalah AAG, sementara kodon
DNA Alanine adalah GCT, GCC, GCA, GCG. Karena kodon DNA Lysine sudah
memiliki basa G maka solusi yang paling mudah adalah mengubah kedua basa A
menjadi G dan C.
Sementara kodon DNA Threonine diketahui pada sekuens di atas adalah ACT,
sementara kodon DNA Sistein adalah TGT dan TGC. Solusi termudah adalah
mengubah nukleotida A dan C menjadi T dan G.

Karena mutasi pada Lysine dan pada Threonine hanya berjarak 19 basa, maka
tidak mungkin membuat primer dengan protokol standard Stratagene Quikchange
yang mensyaratkan bahwa mutasi yang diinginkan harus diapit oleh 10 15 basa
yang sesuai dengan template di kedua ujungnya. Maka itu, kami melakukan
pendekatan yang diajukan oleh Jensen, dkk., yaitu sebagai berikut.
a.

Membuat primer yang overlap parsial, dengan bagian forward mengandung


mutasi K96E dan bagian reverse mengandung mutasi T103C (mutasi K96E
dan T103C tidak dalam daerah overlap)

b.

Melakukan elongasi dengan PCR menggunakan primer yang overlap tersebut,


dengan bagian yang non-overlap menjadi template.

c.

Hasil elongasi dengan PCR tersebut akan menghasilkan untai ganda yang
mengandung kedua mutasi yang diinginkan.

d.

Untai ganda hasil PCR tadi digunakan lagi sebagai primer untuk PCR dengan
plasmid yang mengandung sekuens gen wild type sebagai template. Proses
PCR menggunakan molekul-molekul dan siklus yang diberikan oleh
Stratagene Quikchange.
66

Proses di atas diilustrasikan sebagai berikut.

Desain primer yang kami ajukan adalah sebagai berikut, mengadopsi cara
pembuatan primer oleh Higuchi, dkk dan Zheng, dkk.

PCR 1
Primer forward : 5 CCAAgcGGATAGAAATGATTTAGTT 3
Bagian overlap dari primer forward : 5 GGATAGAAATGATTTAGTT 3
Situs mutasi T103C : 5 tgT 3
Sekuens setelah situs mutasi : 5 TATTTAAAG 3
Primer

reverse

sebelum

di-reverse

GGATAGAAATGATTTAGTTtgTTATTTAAAG 3
Primer reverse akhir : 5 CTTTAAATAAcaAACTAAATCATTTCTATCC 3

PCR 2
Akan terbentuk produk pada akhir PCR 2 yang akan menjadi primer bagi
templateyaitu :
Forward : 5 CCAAgcGGATAGAAATGATTTAGTTtgTTATTTAAAG 3
Reverse : 5 CTTTAAATAAcaAACTAAATCATTTCTATCCgcTTGG 3
Kedua primer memenuhi persyaratan primer dalam protokol Stratagene
Quikchange Lightning dalam jumlah basa dalam primer. Namun untuk
mutagenesis dengan banyak situs (multi-site), umunya hanya digunakan salah satu
primer saja, baik reverse atau forward. Pada kesempatan kali ini kami hanya
menggunakan primer forward saja.
Jadi, Primer Set 1 : 5 GTTGAATGGTCTGAAgAAACCATGAGGATTA 3
Dan Primer Set 2 : 5 CCAAgcGGATAGAAATGATTTAGTTtgTTATTTAAAG 3
Berikut adalah parameter primer dari kedua set primer di atas.
67

Panjang primer :
Primer Set 1 : 31 bp
Primer Set 2 : 37 bp

Tmprimer :
Primer Set 1 : 72,490C
Primer Set 2 : 65,440C

Kandungan GC
Primer Set 1 : 38,7%
Primer Set 2 : 29,7%

Kandungan GC dan Tm lebih rendah dari kriteria ideal; namun menurut beberapa
sumber, masih tetap dapat dijalankan PCR dengan baik karena ukuran primer
tergolong kecil. Untuk mengatasi hal ini dapat dilakukan adalah memanipulasi ion-ion
pada buffer misalnya jumlah Mg2+, Na+ , atau K- agar kestabilan primer tetap terjaga.
ii) Proses Pembuatan Plasmid Mutan Menggunakan PCR
Plasmid (vektor) yang digunakan sebagai template adalah pBluescript yang berukuran
2961 kb. pBluescript adalah phasmid yang dapat bertindak sebagai DNA sirkuler
beruntai tunggal maupun ganda. Maka, pemakaian primer forward untuk PCR dengan
pBluescript sebagai template merupakan pilihan yang sesuai.
Protokol PCR yang kami gunakan mengadopsi protokol Stratagene Quikchange
Lightning yang khusus digunakan untuk introduksi banyak situs mutasi (multi-site).
Kami tidak menggunakan protokol reguler Stratagene Quikchange karena protokol
tersebut hanya dapat digunakan untuk situs mutasi tunggal.
Langkah langkah proses introduksi mutasi menggunakan PCR adalah sebagai
berikut.
1. Mempersiapkan template DNA untai ganda menggunakan protokol miniprep
StrataPrep Plasmid Miniprep Kit.
2. Mempersiapkan komponen-komponen untuk reaksi PCR dengan rincian sebagai
berikut.
a. 10x Quikchange Lightning Multi reaction buffer sebanyak 2,5 L
b. dsDNA template sebanyak 50 ng (sebelum menjalankan siklus termal dsDNA
dijadikan ssDNA terlebih dahulu)
c. Primer mutagenic masing-masing 100 ng
d. Campuran dNTP sebanyak 1 L
68

e. Quikchange Lightning Multi enzyme blend sebanyak 1 L


3. Melapisi (overlay) reaksi dengan minyak mineral sebanyak 30 L.
4. Menjalankan siklus termal menggunakan parameter siklus.
Segmen 1 : Satu siklus PCR pada suhu 950C selama 2 menit
Segmen 2 : Terdiri dari 30 siklus PCR pada suhu 950C selama 20 detik, lalu 550C
selama 30 detik, dilanjutkan dengan suhu 650C selama 30 detik per kb panjang
plasmid.
Segmen 3 : Satu siklus PCR pada 650C selama lima menit.
5. Setelah siklus termal dijalankan, reaksi ditempatkan di es selama 2 menit untuk
mendinginkan reaksi hingga 370C.
6. Mendigesti template dengan enzim restriksi DpnI dengan menambahkan DpnI ke
setiap reaksi amplifikasi di bawah minyak mineral menggunakan pipet.
7. Mencampurkan

campuran

pada

nomor

secara

hati-hati,

melakukan
0

mikrosentrifugasi selama 1 menit, dan menginkubasi pada suhu 37 C selama 5


menit untuk menghancurkan template DNA.
3.6 Transformasi Vektor (Plasmid) Mutan ke Sel Inang (Host)
Protokol dalam melakukan transformasi vektor termutagenesis ke sel inang XL-10 Gold
ultracompetent, yaitu:
1. Menempatkan sel XL-10 Gold ultracompetent dalam es. Untuk tiap reaksi mutagenesis,
aliquot 45 l sel ke tabung yang telah didinginkan sebelumnya.
2. Menambahkan 2 l campuran -ME untuk mempertahankan efisiensi transformasi.
3. Memindahkan 1.5 l DNA yang telah ditambahkan DpnI dari tiap reaksi mutagenesis
dan memisahkan aliquot ultracompetent cell. Catatan: jangan sampai ada minyak di
ujung pipet.
4. Langkah opsional: memverifikasi efisiensi transformasi XL-10 Gold ultracompetent
dengan menambahkan 1 l plasmid kontrol pUC18 ke aliquot lainnya.
5. Mengocok tabung reaksi secara perlahan, kemudian menginkubasinya dalam es
selama 30 menit.
6. Melakukan heat shock dalam tabung yang dicelupkan dalam water bath dengan
temperatur 420C. Yang perlu diperhatikan, durasi heat shock sangat berpengaruh untuk
mendapatkan transforman dengan efisiensi tertinggi. Temperatur jangan sampai
melebihi 420C.
7. Menginkubasinya dalam tabung berisi es selama 2 menit.

69

8. Menambahkan 0.5 mL NZY+broth yang telah dipanaskan dalam water bath pada
temperatur 420C ke masing-masing tabung dan menginkubasinya pada 370C selama 1
jam dengan pengocokan pada kecepatan 225-250 rpm.
9. Menempatkan volum yang sesuai untuk tiap reaksi transformasi pada agar plate
dengan antibiotik sesuai vektor (ampicillin).
10. Menginkubasi plate transformasi pada temperatur 370C selama >16 jam.

Jumlah koloni mutagenesis kontrol yang akan dihasilkan berkisar antara 50 sampai 800
koloni. Lebih dari 55% koloni dari transformasi mutagenesis kontrol seharusnya
mengandung ketiga mutasi dan muncul sebagai koloni biru pada substrat kromogenik
IPTG dan X-gal.
Efisiensi mutagenesis kontrol didefinisikan sebagai:
(%) =

()
100%
()

Transformasi plasmid kontrol pUC18 seharusnya menghasilkan > 100 koloni dengan
>98%-nya memiliki fenotipe biru.
Sedangkan, untuk transformasi plasmid mutan seharusnya menghasilkan 10 sampai
1000 koloni, hal ini bergantung pada jumlah dan kondisi primer serta panjang dan
komposisi basa template DNA yang digunakan.

3.7 Screening dan Seleksi XL-10 Gold Ultracompetent


Screening dan seleksi yang digunakan sama dengan screening dan seleksi pada
proses kloning, yaitu blue-white screening dan seleksi resistensi antibiotik ampicillin.
Indikatornya pun sama; jika E.coli mengandung plasmid yang mengandung gen mutan,
maka akan memberikan warna putih dan tetap hidup pada medium yang diberikan antibiotik
ampicillin.
3.8 Retransformasi Vektor Mutan ke Sel Inang Lain untuk Ekspresi Protein
Prosedur pemurnian plasmid mutan mengikuti prosedur pemurnian plasmid pada
umumnya. Kemudian, plasmid mutan yang telah dimurnikan ditransformasi ke E. coli strain
BL-21 (DE3) dengan menggunakan prosedur transformasi heat shock seperti yang sudah
dibahas dalam tinjauan pustaka. Secara teori, E. coli strain BL-21 (DE3) akan
mengekspresikan protein iso-1-sitokrom c yang lebih besar dibanding sel inang XL-10 Gold
ultracompetent, maka dari itu dilakukan retransformasi.

70

3.9 Uji Ekspresi Protein Iso-1-Cytochrome Mutan


Gen yang telah diubah susunannya dapat dihitung massa protein keseluruhan dengan
menjumlahkan massa keseluruhan asam amino yang terkandung di dalamnya.
Diagram alir yang akan kita kerjakan adalah:
Memisahkan sel
menjadi beberapa
koloni (kemudian
dikultur)

Ambil pada setiap koloni


sebagian sel untuk di
SDS-PAGE)

Ketemu protein dengan


massa 14.1 kDa, ambil
POInya.

Lihat hasil, apakah ada


POI, bandingkan setiap
koloni, yang
mengandung paling
banyak, ambil.

Uji dengan MS dan


analisis sekuens protein

Preparasi untuk menguji


dengan MS

Gambar 20 Diagram Alir Uji Ekspresi Protein


(Sumber: Dokumen Pribadi)

Urutasn asam amino:


MPAPYEKGSE

KKGATLFKTR

CLQCHTVEKG

GPHKVGPNLH

GVFGRKSGLA

EGYSYTDADK

KKGVEWSEQT

MSDYLENPKK

YIPGTKMATG

GLKKPKDRND

LVTYLKKATS

Jumlah asam amino= 110 asam amino


Tabel 8. Massa Asam Amino

Asam Amino

Kode

Wild
Type

Mutant

Massa
satuan

Massa
Wild
Type

Massa
Mutant

Alanine

89,1

534,6

623,7

Arginine

174,2

522,6

522,6

Asparagine

132,1

396,3

396,3

Aspartic Acid

133,1

665,5

665,5

Cysteine

121,2

242,4

363,6

Glutamic acid

147,1

1029,7

1176,8

71

Glutamine

146,1

292,2

146,1

Glycine

13

13

75,1

976,3

976,3

Hisidine

155,2

465,6

465,6

Isoleucine

131,2

131,2

131,2

Leucine

131,2

1049,6

1049,6

Lysine

18

17

146,2

2631,6

2485,4

Methionine

149,2

447,6

447,6

Phenylalanine

165,2

330,4

330,4

Proline

115,1

805,7

805,7

Serine

105,1

630,6

630,6

Threonine

119,1

1071,9

952,8

Tryptophan

204,2

204,2

204,2

Tyrosine

181,2

1087,2

1087,2

Valine

117,1

585,5

585,5

110

110

14100,7

14046,7

TOTAL
(Sumber: Dokumen Pribadi)

Akan terlihat perbedaan massa protein mutan dan non mutant, namunkarena
perbedaan sangat tipis, maka kemungkinann besar tidak akan terlihat pada SDS-PAGE.
Kita harus menggunakan metode lain atau menggabungkannya dengan metode lainnya.
Metode yang paling feasible adalah menggunakan spektrometer massa. Caranya
adalah menggabungkan SDS PAGE dengan mass spectroscopy.
Adapun langkah awal adalah dengan melakukan prosedur-prosedur isolasi protein
dari hos cell. Sel pertama dihancurkan dan disentrifgasi untuk mendapatkan suernatan dan
debris sell. Supernatan diambil karena mengandung protein. Setelah itu kita perlu
melakukan salting out untuk mengambil protein yang terkandung di dalam larutan. Setelah
mendapatkan rotein (kompleks protein), kita gunakan SDS-PAGE untuk memisah-misahkan
semua protein berdasarkan massanya. Massa protein yang ingin kita ambil adalah sebesar
14.1028 kDa. Protein tersebut akan membuat band seperti pada gambar (garis merah).

72

Gambar 21. Hasil SDS-PAGE


(Sumber : biorad.com)

Setelah dari SDS-PAGE, kita dapat mengambil protein yang ada di dalam gel
menggunakan membran beberapa prosedur yang secara umum adalah seperti diagram
dibawah ini:

Excise and
destain gel
bands/spots

Reduce
disulfide
bonds and
alkylate free
cysteines

Enzymatic
digestion

Extract
peptides

Gambar 22 Langkah-langkah mempersiapkan protein yang terdapat pada gel menjadi protein
yang siap untuk dianalisis menggunakan MS
(Sumber: dokumen pribadi)

1. Mengambil bagian gel yang mengandung protein of interest dan menghilangkan stain yang
digunakan pada gel elektrofresis
2. Menghilangkan ikatan disulfida pada protein

73

3. Memotong-motong protein menjadi asam-asam amino


4. Menghilangkan enzim, garan,dan lain-lain sehingga didapatkan protein yang bersih yang
kompatibel untuk diaplikasikan ke dalam MS.

Gambar 23. Mekanisme Mass-Spectrometry


(Sumber : bioalgorithms.com)

Pada prinsipnya, mass spectrometer adalah alat yang akan mensequence asam amino.
Partama yang dilakukan adalah mencampur protein isolasi dengan buffer yang akan
memotong-motong

fragmen

protein

menjadi

peptida-peptida.

Kemudian

setelah

dimasukkan ke dalam alat spektrometer massa, maka akan menghasilkan spektra. Dari
spektra tersebut, kita dapat engetahui apakah so-1-cytochrome c T103C ada di
didalamnya.

Gambar 24. Mensekuens Asam Amino (Sumber : saylor.org)

74

BAB IV
PENUTUP
Kesimpulan
1. Pembuatan protein mutan dimulai dari proses kloning gen iso-1-cytochrome c yeast ke
plasmid pBluescript SK (+), dilanjutkan dengan proses mutasi dengan menggunakan
PCR dengan pBluescript SK (+) mengandung-gen tadi sebagai template. Dalam
melaksanakan proses PCR, terlebih dahulu didesain suatu primer yang mengandung
mutasi yang diinginkan. Untuk menguji keberhasilan mutasi, dilakukan screening dan
seleksi serta uji ekspresi protein mutan.
2. Primer dibuat dengan menggunakan ketentuan umum dari protokol Stratagene
Quikchange Lightning Multi, namun juga menerapkan modifikasi-modifikai tertentu
dalam pembuatan primer.
3. Penggunaan vektor pBluescript didasarkan pada kemampuannya untuk bereplikasi baik
dalam bentuk ssDNA maupun dsDNA, dan juga jenis plasmid tersebut sering digunakan
untuk mutasi site-directed. Sedangkan penggunaan strain XL10 Gold didasarkan pada
spesifikasinya yang memang digunakan untuk mutagenesis dan memiliki efisiensi
transformasi yang tinggi. Penggunaan BL21 didasarkan pada kenyataan bahwa jenis
tersebut baik dalam ekspresi protein.
4. Keberhasilan pembuatan protein mutan dapat dideteksi dengan uji ekspresi protein
mutan dengan SDS-PAGE dilanjutkan dengan MS.
5. Keberhasilan proses transformasi ditentukan dengan screening biru-putih dan seleksi
resistensi antibiotik.

75

DAFTAR PUSTAKA

Agilent Technologies. (2016). Quikchange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit


Instruction

Manual.

[ONLINE]

di:https://www.agilent.com/Library/usermanuals/Public/210518.pdf.

Tersedia
Diakses

pada

November 2016.
College of Mines and Earth Science. (2016). Site-Directed Mutagenesis. [ONLINE] University of
Utah. Tersedia di: http://utminers.utep.edu/rwebb/html/site_directed_mutagenesis1.html.
Diakses pada 6 November 2016.
Dubey, R.C. (2014). Advanced Biotechnology. New Delhi: S. Chand & Company.
Dubey, R.C. (1993). A Textbook of Biotechnology. New Delhi: S. Chand & Company.
Casali, N. dan Preston, A. (2003). Methods in Molecular Biology: Choosing a Cloning Vector; E.
coli Host Strains. New Jersey: Humana Press.
Howe, C. (2007). Gene Cloning and Manipulation, 2nd Edition. New York: Cambridge University
Press.
Kumar, A. dan Garg, N. (2005). Genetic Engineering. New York: Nova Biomedical Books.
Kurnia, A. (2011). Dasar Teknologi DNA Rekombinan. Depok: Universitas Indonesia.
Kurnaz, I.A. (2015). Techniques in Genetic Engineering. New York: CRC Press, Taylor &
Francis Group.
Primrose, S.B., et al. (2001). Principles of Gene Manipulation, 6th Edition. Italy: Blackwell
Science.
Stansfield, W., dkk. (2006). Schaums Easy Outlines: Biologi Molekuler dan Sel. Jakarta:
Erlangga.
Strachan, T. dan Read, A.P. (2004). Human Molecular Genetics 3, 3rd Edition. India: Garland
Science, Taylor & Francis Group.
Stratagene.

(2016).

Competent

Cells.

[ONLINE]

https://www.agilent.com/Library/brochures/5989-8281ENUS.pdf.

Tersedia
Diakses

pada

di:
6

November 2016.
Stratagene. (2016). pBluescript II Phagemid Vector Instruction Manual. [ONLINE] Tersedia di:
https://www.agilent.com/Library/usermanuals/Public/212205.pdf.

Diakses

pada

November 2016.
Swamy, P.M. (2009). Laboratory Manual on Biotechnology. New Delhi: Rastogi Publications.

76

Waran. (2009). Problems with Quikchange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit.
[ONLINE] Tersedia di: http://www.protocol-online.org/biology-forums-2/posts/10371.html.
Diakses pada 6 November 2016.
Warianto,

C.

(2011).

Mutasi.

[ONLINE]

Universitas

Airlangga.

Tersedia

di:

http://skp.unair.ac.id/repository/Guru-Indonesia/Mutasi_ChaidarWarianto_17.pdf. Diakses
pada 30 Oktober 2016.
Woodall, C.A., et al. (2003). E.coli Plasmid Vectors: Methods and Applications. New Jersey:
Humana Press.

77