Bakteri Lokalisasi dan Chorion Menipis antara prematur ketuban pecah dini

Kimberly B. Fortner1, Chad A. Grotegut2, Carla E. Ransom1, Rex C. Bentley3, Liping Feng2,
Lan Lan5, R. Phillips Heine2, Patrick C. Seed4, Amy P. Murtha2 *
1 Divisi Ibu-Fetal Medicine, Departemen Obstetri dan Ginekologi, Vanderbilt University
Medical Center, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, Amerika Serikat, 2 Divisi Ibu-Fetal
Medicine, Departemen Obstetri dan Ginekologi, Duke University Medical Center, Duke
University, Durham, North Carolina, Amerika Serikat, 3 Departemen Patologi, Rumah Sakit
Universitas Duke, Duke University, Durham, North Carolina, Amerika Serikat, 4 Divisi Penyakit
Menular, Departemen Ilmu Kesehatan Anak, Rumah Sakit Universitas Duke dan Departemen
Genetika Molekuler dan Mikrobiologi, Duke University, Durham, North Carolina, Amerika
Serikat, 5 Departemen biostatistik, Rumah Sakit Universitas Duke, Duke University, Durham,
North Carolina, Amerika Serikat
Abstrak
Tujuan: kolonisasi bakteri pada membran janin dan perannya dalam patogenesis pecah ketuban
kurang dipahami. Kerja retrospektif sebelum mengungkapkan lapisan chorion menipis di
prematur ketuban pecah dini (PPROM) mata pelajaran. Tujuan kami adalah untuk prospektif
memeriksa janin korion membran menipis dan berkorelasi dengan kehadiran bakteri dalam
PPROM, prematur, dan mata pelajaran jangkaStudi:.
Desain Sampel membran Pasangan (pecah ketuban dan membran jauh) yang prospektif
dikumpulkan dari: PPROM = 14, persalinan prematur ( PTL = 8), prematur tidak ada tenaga
kerja (PTNL = 8), tenaga kerja jangka (TL = 10), dan jangka ada tenaga kerja (TNL = 8), mata
pelajaran. Bagian diperiksa dengan sitokeratin untuk mengidentifikasi trofoblas lapisan janin dari
chorion menggunakan imunohistokimia. Fluoresensi hibridisasi in situ dilakukan dengan
menggunakan luas jangkauan 16 s ribosom RNA penyelidikan. Gambar dievaluasi, chorion dan
choriodecidua diukur, dan fluoresensi bakteri mencetak. Korion menipis dan kehadiran bakteri
dibandingkan antara dan antara kelompok dengan menggunakan tes t, Model efek campuran
linear, dan model regresi Poisson (SAS Cary, NC)
Hasil:.Dalam semua kelompok, chorion janin lapisan sel lebih tipis di pecah dibandingkan
dengan lokasi jauh (147,2 vs 253,7 m, p, 0.0001). Selanjutnya, chorion menipis adalah terbesar
di antara mata pelajaran PPROM dibandingkan dengan semua kelompok lainnya digabungkan,
terlepas dari situs sampel [PPROM (114,9) vs PTL (246,0) vs PTNL (200,8) vs TL (217,9) vs
TNL (246,5)] . Bakteri jumlah yang tertinggi di antara subyek PPROM dibandingkan dengan
semua kelompok lain terlepas dari situs sampel atau infeksi histologis [PPROM (31) vs PTL (9)
vs PTNL (7) vs TL (7) vs TNL (6)]. Di antara semua mata pelajaran di kedua situs, jumlah
bakteri yang berbanding terbalik dengan korion menipis, bahkan tidak termasuk korioamnionitis
histologis (p, 0,0001 dan p = 0,05)

Kesimpulan:.Chorion janin adalah seragam tipis di situs pecah dibandingkan ke tempat yang
jauh. Dalam chorion janin PPROM, kami menunjukkan penipisan global yang jelas. Meskipun
penyebabnya atau konsekuensi tidak pasti, kehadiran bakteri adalah terbesar dan berbanding
terbalik dengan chorion penipisan antara subyek PPROM
Citation:.Fortner KB, Grotegut CA, Ransom CE, Bentley RC, Feng L, et al. (2014) Bakteri
Lokalisasi dan Chorion Menipis antara prematur ketuban pecah dini. PLoS ONE 9 (1): e83338.
doi: 10.1371 / journal.pone.0083338
Editor: Kang Sun, Fudan University, Cina
Diterima April 1, 2013; Diterima November 3, 2013; Diterbitkan 8 Januari 2014
Copyright: 2014 Fortner et al. Ini adalah sebuah artikel akses terbuka didistribusikan di bawah
persyaratan Lisensi Creative Commons Attribution, yang memungkinkan penggunaan tak
terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan penulis asli dan sumber
dikreditkan
Pendanaan:.Karya ini didanai oleh
hibahdari Charles Hammond Foundation dan M. Krzyzewski Family. Penyandang dana tidak
memiliki peran dalam desain penelitian, pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk
mempublikasikan, atau penyusunan naskahMinat:.
Bersaing Para penulis telah menyatakan bahwa kepentingan bersaing adaE-mail:.
* Amy.murtha@dm.duke. edu
Pendahuluan
Komplikasi kelahiran prematur sangat kompleks, mahal, dan tidak terbatas pada kelahiran. Ibu
dari bayi prematur telah meningkat tingkat: depresi postpartum dan persalinan operatif, dengan
tinggal di rumah sakit lebih lama. Konsekuensi neonatal keduanya langsung, seperti gangguan
pernapasan [1], necrotizing enterocolitis, dan kesulitan makan serta tertunda: tantangan masa
dengan perilaku belajar [2,3], motorik [4] dan tunanetra [5], penyakit paru-paru kronis
[2,3,4,5,6,7] dan tingkat yang lebih tinggi dari infertilitas pada korban dewasa [8]. Hampir
sepertiga dari semua kelahiran terjadi prematur berhubungan dengan prematur ketuban pecah
dini (PPROM) [9]. Kebutuhan untuk peningkatan pemahaman
faktormemulai ketuban pecah prematur ditekankan oleh tingkat stabil kelahiran prematur selama
dekade terakhir [10]. Peningkatan pemahaman PPROM akan menyebabkan rejimen pengobatan
tidak hanya lebih berhasil, tetapi pada akhirnya untuk strategi pencegahan.
Wanita mengaku dengan PPROM dapat mengembangkan infeksi klinis (korioamnionitis), tapi
banyak yang tidak. Meskipun pasien tidak memiliki bukti infeksi klinis, bakteri dapat ditemukan

dalam amnion penanda inflamasi cairan dan serum mereka mungkin meningkat [11]. Perbedaan
antara kehadiran bakteri patologis (infeksi) terhadap keberadaan bakteri simbiosis tidak dipahami
dengan baik. Selanjutnya, korelasi antara keberadaan bakteri dan PPROM tidak jelas. Sangat
mungkin bahwa kemampuan untuk membedakan antara infeksi intra-amnion dan peradangan
intra-amnion
PLOS ONE | www.plosone.org 1 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e83338
bakteri Kehadiran dan Chorion Menipis
mungkin karena kurangnya metodologi cukup sensitif untuk mendeteksi
Peserta organisme yang sulit untuk menumbuhkan atau yang hadir dalam kecil
Sebanyak 48 peserta, dibagi dengan usia kehamilan dan jumlah [12]. Teknik molekuler baru
telah meningkatkan
paparan kerja, dipelajari. Empat belas subyek dengan deteksi PPROM organisme cerewet, seperti
Mycoplasma dan
terdaftar dengan usia kehamilan antara 24 dan 34 minggu Ureaplasma yang mungkin patogen
dalam membran janin
berikut konfirmasi pecah ketuban oleh pemeriksaan fisik, [13,14,15]. Penelitian yang lebih baru
telah mempekerjakan bakteri 16 s
tes nitrazin pH, pooling vagina, dan uji pakis. Mereka sequencing ribosom untuk
mengidentifikasi hidup dan tak hidup bakteri
dibandingkan dengan kohort 16 mata pelajaran prematur antara 24 dan 34 di kelompok
taksonomi yang luas. [16,17,18]. Namun,dampak
minggukehamilan dengan dan tanpa paparan kerja, '' prematur invasi mikroba pada arsitektur
ketuban danintegritas
tenaga kerja'' (PTL) dan '' preterm tidak ada pekerja '' (PTNL). PTL (n = 8) masih belum jelas
dalam patogenesis PPROM dan layak
subjek perempuan mengakui dalam persalinan prematur aktif, dengan studi lebih lanjut.
Pengiriman, terlepas dari rute utama pengiriman, bertemu integritas inklusi Fetal membran
memainkan peran penting dalam pemelikriteria. PTNL (n = 8) mata pelajaran yang disampaikan oleh sesar bagian nance kehamilan
selama kehamilan. Selaput janin

tanpa tenaga kerja untuk indikasi ibu atau janin, seperti yang terutama terdiri dari dua lapisan,
baik yang berasal darijanin
preeklamsiaatau hambatan pertumbuhan janin. PPROM dan jaringan prematur. Amnion adalah
lapisan terdalam terdiri darilapisan tunggal
mata pelajaranjuga dibandingkan dengan 18 kohort jangka (37weeks ke 41 sel epitel kuboid dan
kolagen [19]. Ini memberikan sebagian dari kekuatan tarik sementara dalam kontak langsung
dengan cairan ketuban. korion adalah lapisan luar tebal dengan reticular dan trofoblas sel dan
berada dalam kontak langsung dengan desidua maternal [19]. lapisan sel korion aktif secara
metabolik [20] dan melayani peran protektif dalam pemeliharaan kehamilan melalui pertahanan
terhadap infeksi dan regulasi apoptosis [21]. telah dibuktikan bahwa ketuban utuh dirakit,
amnion dan choriodecidua, lebih kuat dari komponen individu [22]. Juga, bukti terbaru
menunjukkan variasi dalam membran janin, setidaknya pada jangka, dengan '' zona kelemahan ''
melapisi tiang bawah rahim dan leher rahim [23].
minggu) dengan dan tanpa paparan kerja, '' tenaga kerja jangka '' (TL) (n = 10) dan '' jangka ada
pekerja '' ( TNL) (n = 8). Tenaga kerja jangka (TL) kelompok termasuk subjek dengan usia
kehamilan lebih dari 37 minggu, mengakui dalam tenaga kerja, terlepas dari rute utama
pengiriman. Istilah tidak ada tenaga kerja (TNL) kelompok terdiri wanita dengan membran utuh,
tanpa awal persalinan, yang disampaikan melalui sesar berulang di lebih dari 37 minggu.
Usia Gestational didasarkan pada tanggal haid jika hari pertama periode menstruasi terakhir
adalah sesuai dengan ultrasound, atau didasarkan pada USG jika tanggal yang sumbang. Subyek
dikeluarkan untuk malformasi utama kongenital, kehamilan multipel, atau kurangnya spesimen
lengkap dikumpulkan.
Sebelum bekerja di laboratorium kami telah menunjukkan kematian sel preferensial dalam
korion dari membran janin dengan aktivasi dini jalur apoptosis sel ketika infeksi hadir [24,25] .
Dalam mata pelajaran jangka, kematian sel apoptosis lebih besar dengan korioamnionitis
histologis [25]. Selanjutnya, tingkat terbesar korion menipis dan kematian sel apoptosis
ditemukan di antara subyek dengan PPROM mana tingkat korioamnionitis yang tertinggi.
Temuan tak terduga dalam penelitian ini adalah tidak adanya lapisan chorion diidentifikasi di
hampir 37% dari subyek [24]. Secara khusus, dalam membran retrospektif yang dikumpulkan,
lapisan trofoblas lebih tipis antara perempuan dengan PPROM dibandingkan dengan wanita yang
melahirkan prematur tanpa tenaga kerja dan orang-orang melahirkan di jangka [26]. Temuan ini
menyebabkan calon penyelidikan ini membran janin dari subyek PPROM dan kontrol mereka.
Mengingat tingginya tingkat korioamnionitis dan peran diusulkan infeksi dalam etiologi
PPROM, mengevaluasi kedua bakteri kehadiran dan lapisan chorion ketebalan akan memajukan
pemahaman kami patogenesis mengarah ke ruptur membran prematur. Oleh karena itu kami
berusaha untuk mengidentifikasi pola-pola invasi bakteri dalam mata pelajaran PPROM
dibandingkan dengan jenis fenotipe klinis lainnya, dengan tujuan mekanisme pemahaman yang

lebih baik dari pecah ketuban prematur. Hipotesis pusat kami adalah bahwa bakteri menyerang
dan melokalisasi dalam atau berdekatan dengan lapisan korion dari situs pecah ketuban pada
wanita dengan PPROM,
koleksi Tissue
Sebanyak 96 sampel membran dipasangkan dikumpulkan, dua sampel untuk setiap wanita yang
terdaftar. Setelah melahirkan, selaput janin diperiksa untuk situs pecah, dan satu strip dari
membran dikumpulkan dan diberi label, '' situs pecah '', mudah diidentifikasi di PPROM, PTL,
dan mata pelajaran TL. Dalam kasus subyek nonlabored dengan membran utuh, daerah atasnya
serviks diidentifikasi dan membran ditandai. Semua membran non diusahakan yang bertinta
dengan menerapkan pewarna hijau brilian steril ke daerah membran yang melapisi serviks segera
setelah persalinan bayi. Sebuah strip membran kedua dikumpulkan dari daerah yang jauh pecah
situs, '' lokasi jauh '', paling sering segmen membran membarengi plasenta (Gambar S1). Strip
membran digulung, dipotong, formalin tetap, dan parafin tertanam. Blok jaringan dipotong
menjadi 3-5 bagian m dan dipasang pada slide. Dengan demikian, setiap slide berisi empat
digulung bagian membran yang sampel dari masing-masing strip membran. Satu slide dari setiap
situs yang bernoda dengan hematoxylin & Eosin dan diperiksa untuk bukti korioamnionitis
histologis oleh seorang ahli patologi ginekologi tunggal, buta terhadap hasil studi (RCB).
Korioamnionitis histologis didiagnosa menggunakan standar kriteria diagnostik yang diajukan
oleh Redline et al [27].
Dan bahwa kehadiran bakteri ini menyebabkan respon seluler dengan remodeling jaringan
berikutnya, dan penipisan membran.
Immunohistochemistry
Slides dewaxed, rehydrated, dan siap untukpewarnaan
Bahandan Metode
dengan protein pencernaan menggunakan panas, EDTA, dan proteinase K. trofoblas lapisan
dalam lapisan chorion janin diidentifikasi Etika Pernyataan
proyek ini telah disetujui oleh Duke University Institutional Review Board. Perempuan
melahirkan di Duke University Medical Center yang selesai ditulis formulir persetujuan yang
prospektif terdaftar dalam penelitian kohort observasional ini.
Melalui pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal yang ditujukan
terhadap sitokeratin (Cytokeratin MNF-116, Dako Amerika Utara, Inc.). Pewarnaan sitokeratin
memungkinkan pengakuan dari semua sel trofoblas: sel epitel kuboid di amnion dan sel-sel
trofoblas aktif secara metabolik di chorion [20]. Kontrol slide termasuk orang-orang bernoda
tanpa antibodi primer|.

Menggunakan Zeiss Axio Imager di fasilitas inti Duke University Cahaya Mikroskop, 2 slide per
subjek yang melihat (rupture
PLOS ONE Www.plosone.org 2 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e83338
Kehadiran bakteri dan Chorion Menipis
situs dan situs jauh). Setiap slide diadakan bagian dari empat
disebabkan oleh faktor subjek, roll, dan kuadran. Gulungan membran Poisson dengan trofoblas
lapisan patri dari korion dan
regresi model dengan analisis pengukuran berulang diaplikasikan sel kuboid amnion, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar S2. Pada 106
untuk menilai perbedaan kelompok jumlah kehadiran bakteri. pembesaran, gambar diperoleh dari
empat wilayah yang terpisah dari
Interaksi pengaruh kelompok klinis dan situs di model itu setiap roll membran. Dengan 4 gambar
per roll, minimal 16
diuji; perbedaan kelompok dipelajari dan diuji oleh situs jika gambar digital per slide atau 32
gambar digital per subjek yang
efek interaksi yang signifikan. Ketebalan diprediksi chorion ditangkap (4 gambar per satu roll
dari masing-masing kuadran, 4 membran
dan jumlah diperkirakan total bakteri pada setiap gulungan kelompok klinis per slide, dan 2 slide
per subjek). Sebagai contoh, dua sampel
dilaporkan menggunakan cara paling persegi. Perbandingan gambar kuadran membran
digambarkan pada Gambar S3.
Bakteri divisualisasikan dalam amnion dibandingkan dengan chorion dilakukan menggunakan
software ImageJH (NIH), masing-masing gambar ditinjau.
Analisisdeskriptif dengan menggunakan sarana persegi setidaknya dalam rasio. Ketebalan
statistik dari korion janin dan choriodecidua diukur.
Analisis dilakukan dengan SAS perangkat lunak statistik (Cary, khusus, ketebalan lapisan
trofoblas darijanin).
NC chorion diukur; sedangkan, lapisan reticular dari korion janin tidak termasuk diberikan
kurangnya mengidentifikasi penanda antara sampel kami. Akhirat, kita mengacu pada porsi
trofoblas diukur hanya sebagai '' Kedua, choriodecidua menyatu yang diukur, termasuk patri
trofoblas lapisan'chorion.'

PLoS ONE| www.plosone.org 3 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e83338

Hasil
Sebanyak 48 peserta, dibagi dengan usia kehamilan dan paparan kerja, dipelajari. Empat belas
subyek dengan PPROM chorion ditambah desidua patuh. Mengingat membran yang melekat
dibandingkan dengan 16 mata pelajaran prematur dengan dan tanpa variabilitas tenaga kerja,
perubahan pengolahan jaringan, danperwakilan variabel
paparandan delapan belas mata pelajaran jangka dengan dan tanpa bagian tenaga kerja,
khususnya desidua patuh, pengukuran
eksposur.Karakteristik yang relevan dari kelompok ini adalah: korion dan choriodecidua serupa
diperoleh di 4 daerah yang berbeda dari
rata-rata usia kehamilan untuk kelompok PPROM, PTL, dan PTNL karena setiap gambar.
Protokol ini menghasilkan minimal 128 pengukuran
serta untuk kelompok TL dan TNL. Tarif sesar yang KASIH per slide atau 256 per subjek.
Semua pengukuran lebihdi
tinggiantara kelompok PTL dibandingkan dengan kelompok TL. Tingkat dilakukan dua kali, oleh
penyidik sama yang dibutakan dengan
korioamnionitis histologis adalah tertinggi di antara PPROM dan kelompok klinis spesimen.
Kelompok PTL spontan (Tabel 1). Dari subyek PPROM, latency rata-rata dari pecah ketuban
untuk pengiriman adalah 13,1 Fluorescence in situ Hibridisasi (FISH)
FISH digunakan untuk menunjukkan adanya bakteri di antara bagian yang sama dari membran
janin (96 sampel membran dari 48 mata pelajaran) menggunakan metode sebelumnya dijelaskan
oleh Steele et al [14]. Secara singkat, parafin-embedded gulungan ketuban yang dewaxed dan
direhidrasi. Slide diobati denganproteinase
hariK.Interval rata-rata dari selesainya antibiotik latency [28] untuk pengiriman adalah 5,8 hari.
Delapan puluh lima persen dari mata pelajaran yang diterima ampisilin dan azitromisin selama
rata-rata 7 hari untuk PPROM latency; dua mata pelajaran menerima rejimen alternatif yang
diberikan alergi penisilin. Setengah dari subyek PPROM memiliki setidaknya satu episode dari
bercak vagina atau perdarahan. pencernaan untuk menghilangkan protein yang akan melarang
penyelidikan hybrid- isasi. Slide dibilas, tetap dengan 0,4% buffered formalin, dan
Imunohistokimia kemudian hibridisasi dengan berbagai 16 s generik bakteri
antara semua mata pelajaran terdaftar (n = 48), rata-rata chorion ketebalan penyelidikan ribosom
dalam larutan penyangga bermalam di 37uC. Sebuah kustom

diukur pada situs pecah secara signifikan kurang dari itu dipasangkan oligonukleotida probe
diperoleh dari InvitrogenTM (Hidup
lokasi jauh, (147.2 m vs 253,7 m, p, 0.0001). Ketika berarti Technologies, Grand Island, NY)
dengan urutan 59 -Fpengukuran
chorion
dibandingkan
dengan
ACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTATTCCTT yang berkorelasi

kelompok

klinis,

lapisan chorion adalah tertipis di antara subyek PPROM dibandingkan merespon dengan
berbagai 16 ssubunit bakteri.ribosom
kohortprematur dan jangkadengan dan tanpa tenaga kerja di kedua situs Probe ini label dengan
Alexa merah dan digunakan untuk FISH
sampel (Tabel 2). Chorion diukur di kedua pecah dan jauh [13,14]. Slide kontrol negatif
menerima hibridisasipenyangga
situssecara signifikan lebih tipis pada wanita dengan PPROM saat tanpa pemeriksaan. Slide
dibilas, DAPI bernoda untuk non
dibandingkan dengan semua mata pelajaran prematur dan jangka lainnya (Gambar 1).
identifikasi khusus dari inti, dan dipasang dengan VectashieldH
Dampak kerja pada korion penipisan dievaluasi. Tidak ada (Vector Laboratories, Inc).
Perbedaan yang signifikan dalam ketebalan chorion janin diidentifikasi ketika Slides dievaluasi
dalam panjang gelombang UV yang sesuai dengan
membandingkan subyek prematur tanpa pecah ketuban (PTL vs Zeiss Axio Observer 10X
pembesaran. Gambar yang
PTNL). Temuan ini bertahan pada kedua situs sampel. Demikian juga, ditangkap melalui
fotografi digital menggunakan tiga panjang gelombang selama tiga
tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ketebalan chorion janin antara saluran warna: merah
(probe), biru (DAPI), dan hijau autofluores(matapelajaran jangka(TL vs TNL) pada kedua pecah dan tempat yang jauh. cence) (Gambar
S4). Sebuah gambar overlay komposit diperoleh dengan
Tabel 3. menggabungkan saluran tiga dihasilkan dalam inti muncul biru,
Menyadari infeksi dampak tersebut terhadap bakteri seluler muncul merah, dan jaringan latar
belakang autofluorescence

renovasi, kami mengulangi analisis tidak termasuk subyek dengan muncul kuning (merah
ditambah hijau) atau hijau. Apa merah fluoresensi
histologis korioamnionitis. Dalam analisis ini, karena tidak ada perbedaan yang diidentifikasi
pada permukaan geser itu diabaikan sebagai kontaminasi.
Dicatat antara subyek prematur dan jangka dalam hal Images tenaga kerja diambil dari masingmasing kuadran per roll membran, dengan
eksposur, mata pelajaran dikelompokkan sebagai prematur dan Term. Evaluasi rata-rata 4
gulungan per slide, 2 slide per subjek (16 daerah diperiksa
ketebalan korion antara subyek PPROM jika dibandingkan dengan per slide; 32 per pasien).
Gambar de-diidentifikasi dipandang sebagai
prematur dan Term subyek setelah menghapus mereka dengan gambar digital diperbesar
histologis pada komputer fasilitas inti (Gambar S4) dan
korioamnionitis (n = 40) mengungkapkan hasil yang sama. Janin dicetak oleh dua pemeriksa
untuk kuantitas dan lokasi probe
korion secara signifikan lebih tipis antara subyek PPROM sebagai fluoresensi per kuadran
membranhistologis.
dibandingkan dengan subyek prematur dan jangka bahkan tanpa adanya korioamnionitis (Tabel
4; Gambar 1B). Menariknya, analisisstatistik ini
temuanada pada kedua situs pecah dan lokasi jauh. Linear Model efek campuran digunakan
untuk menilai kelompok klinis
Untuk memahami apakah seluruh struktur membran perbedaan pemahaman ketebalan korion
dengan mempertimbangkan acak-efek
pergi perubahan PPROM atau jika perubahan yang diamati secara khusus
Bakteri Kehadiran dan Chorion Menipis
Tabel 1. Pasien Karakteristik klinis.
PPROM PTL PTNL TL TNL
N = 14 N = 8 N = 8 N = 10 N = 8
Umur (tahun mean, (SD)) 29,9 (5,5) 31,3 (6,4) 29,4 (6,0) 25,6 (5,5) 28,9 ( 5.7)
Gestational Umur di Pengiriman (SD) 29,6 (2,6) 30,7 (2,8) 30,8 (3,6) 38,8 (3,4) 39,0 (1,2)

sesar (persen) 55% 62% 100% 37,5% 100%

Berat lahir (mean gram, ( SD)) 1358 (554) 1631 (619) 1456 (702) 3282 (342) 3302 (722)
Chorioamnionitis (persen) 50% 25% 0% 0% 0%
klinis karakteristik ibu dan kelahiran dibandingkan dengan kelompok pendaftaran subjek.
PPROM = prematur, ketuban pecah dini (subyek antara 24 dan 34 minggu setelah konfirmasi
pecah ketuban dengan pemeriksaan fisik). PTL = prematur Tenaga Kerja (subyek antara 24 dan
34 minggu kehamilan dengan paparan kerja). PTNL = prematur, ada Tenaga Kerja (subyek
antara 24 dan 34 minggu kehamilan tanpa paparan kerja). TL = Term Tenaga Kerja (subyek
antara 37 dan 41 minggu dengan paparan kerja). TNL = Term, ada Tenaga Kerja (subyek antara
37 dan 41 minggu tanpa paparan kerja). doi: 10.1371 / journal.pone.0083338.t001
terjadi di lapisan korion, kami menguji kontribusi
antara semua mata pelajaran prematur itu sama, menunjukkan tidak ada dampak dari korion
sebagai proporsi dari total ketebalan choriodecidua. The
proses persalinan atau bagian vagina. Demikian juga, subjek jangka memiliki hasil dari analisis
model efek campuran menunjukkan
jumlah bakteri yang sama di antara mereka dengan dan tanpa tenaga kerja, dan proporsi korion /
choriodecidua dalam mata pelajaran PPROM adalah
juga dikelompokkan. Semua spesimen memiliki bakteri ini, secara signifikan kurang dari
kelompok prematur dan jangka terlepas dari
terlepas dari pecah ketuban atau status tenaga kerja. situs sampel (masing-masing p, 0,02, Tabel
5). Data ini menunjukkan bahwa
kehadiran bakteri tidak bermakna dikaitkan dengan lapisan korion janin adalah bagian dari
membran menunjukkan
pemberian antibiotik atau dengan interval latency perubahan waktu.
Dari pecahnya membran untuk pengiriman. Seperti yang diharapkan, jumlah bakteri rata-rata
secara signifikan lebih tinggi di antara mereka subyek dengan FISH untuk bakteri Localization
korioamnionitis dibandingkan dengan mereka yang tidak di situs kedua Pemeriksa semua mata
pelajaran, bakteri berarti menghitung di pecah
(rupture: 38 vs 23 bakteri, p = 0.025 ; 31 vs 14 bakteri, situs ini lebih tinggi dibandingkan
dengan situs yang jauh (18,3 vs 13,0 bakteri
Distant:..p = 0,002) per kuadran, p = 0,0001)

Mengakui infeksi dampak histologis telah di bakteri bakteri Lebih diidentifikasi antara
PPROMmata
kehadiranpelajaran,kami mengulangi analisis tidak termasuk subyek dengan dibandingkan
dengan semua mata pelajaran lain yang terdaftar. Di kedua situs membran
histologis korioamnionitis (n = 40, setelah menghapus mata pelajaran dengan diperiksa, mata
pelajaran PPROM memiliki lebih besar berarti jumlah bakteri
korioamnionitis) dengan kecenderungan yang sama mencatat. Di antara PPROM dibandingkan
dengan kohort prematur dan jangka mereka (Tabel 6; Gambar 2A).
Mata pelajaran tanpa infeksi histopatologi, di kedua situs pecah dan lebih lanjut, jumlah bakteri
yang diidentifikasi dalam membran janin
lokasi jauh, menghitung bakteri rata-rata per kuadran secara signifikan
Gambar 1 . Chorion Tebal oleh Grup klinis dan Gestational Umur di Membrane Pecahnya Situs
dan Situs Distant. Gambar 1A mewakili ketebalan chorion kuadrat terkecil berarti antara subyek
dengan PPROM dibandingkan dengan kohort prematur dan jangka dengan dan tanpa paparan
kerja di dua lokasi membran yang berbeda. Setiap ketuban manusia sampel di lokasi ruptur, ''
pecah '', dan situs jauh pecah, '' jauh ''. Gambar 1B hanya mencakup mata pelajaran tanpa bukti
korioamnionitis histologis dan menunjukkan mean square terkecil di antara mata pelajaran
PPROM dibandingkan dengan semua mata pelajaran prematur dan jangka lainnya. Jumlah yang
dilaporkan merupakan mean square paling minimal 64 pengukuran per subjek per situs sampel.
Kesalahan bar mewakili kesalahan standar untuk setiap. doi: 10.1371 /
journal.pone.0083338.g001
PLOS ONE | www.plosone.org 4 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e83338
bakteri Kehadiran dan Chorion Menipis
Tabel 2. Sarana Least Square (LS Berarti) dari Chorion Tebal oleh Grup klinis dan Membran
Koleksi Site.
Distant (LS N
Berarti / SE di m) nilai P
PPROM 14 76,1 (21,7), 0,01 * 14 147.5 (29,7), 0,01 *
Persalinan prematur 8 211,0 (28,7) 8 287,5 (39,3)
prematur, ada Buruh 8 140,4 (28,7) 8 275,9 (39,3)
Term Buruh 10 170,7 (28,7) 10 302,3 (39,3)

Term ada Buruh 8 195,2 ( 28,7) 8 293,1 (39,3)

Nilai ditampilkan adalah mean kuadrat terkecil dari ketebalan korion antara semua mata
pelajaran dalam masing-masing lima kelompok klinis dibandingkan dengan kesalahan standar. P
kurang dari 0,01 dengan analisis regresi Poisson. * Perbandingan statistik antara PPROM dan
semua kelompok klinis lain (LS Berarti). PPROM = prematur, ketuban pecah dini (subyek antara
24 dan 34 minggu setelah konfirmasi pecah ketuban dengan pemeriksaan fisik). Prematur Tenaga
Kerja = subyek antara 24 dan 34 minggu kehamilan dengan persalinan prematur spontan.
Prematur, ada Tenaga Kerja = subyek antara 24 dan 34 minggu kehamilan disampaikan prematur
tanpa paparan kerja. Istilah = subyek antara 37 dan 41 minggu dengan tenaga kerja. Istilah, ada
Tenaga Kerja = subyek antara 37 dan 41 minggu tanpa paparan kerja. Pecahnya = sampel
membran dikumpulkan di situs pecah. Jauh = sampel membran yang dikumpulkan dari daerah
yang jauh ke situs pecah, paling sering dekat plasenta. doi: 10.1371 / journal.pone.0083338.t002
Tabel 3. Sarana Least Square (LS Berarti) dari Chorion Tebal oleh Gestational Age dan Membran
Situs Koleksim).
Pecahnya (LS Berarti / SE di m) Distant (LS Berarti / SE di
kerja
PLOS ONE| www.plosone.org 5 Januari 2014 | Volume 9 | Edisi 1 | e83338
Pecahnya (LS Berarti / SE di m) nilai P N
lebih tinggi dibandingkan dengan subyek prematur dan jangka (semua p, 0.0001 di
amnion terhadap bakteri hadir dalam korion diciptakan untuk kedua situs, Gambar 2B).
memahami directionality kehadiran bakteri. The Amnion / An hubungan terbalik antara jumlah
bakteri dan chorion
Chorion (A / C) ratio lebih besar antara subyek PPROM menipis tercatat dalam mata pelajaran
PPROM dengan atau tanpa
dibandingkan dengan kohort prematur dan jangka mereka, menunjukkan lebih korioamnionitis.
Sebagai tujuan eksplorasi, kami mengevaluasi
bakteritelah menembus amnion dalam mata pelajaran PPROM. Korelasi yang sebenarnya antara
korion menipis dan jumlah bakteri. Di antara
jumlah bakteri yang terlihat pada lapisan membran ditunjukkan pada semua mata pelajaran, pada
kedua situs membran sampel, terbalik
Tabel 7. Temuan ini adalah yang paling penting di situs pecah dan di antara hubungan ada antara
kehadiran bakteri dan chorion

mereka dengan korioamnionitis histologis. pengukuran, sehingga dengan meningkatnya bakteri,

menipis chorion janin (Semua mata pelajaran, kedua situs, p, 0.0001; pecah, p = 0,0006;
Diskusi jauh, p = 0,0008). Gambar 3. Temuan ini tetap tidak termasuk infeksi histologis di semua
situs sampel (p = 0,05).
Karena evaluasi kualitatif kehadiran bakteri dalam amnion bervariasi secara signifikan, bakteri
dalam amnion dan korion dari setiap sampel dihitung secara terpisah. Jumlah bakteri individu
serta rasio bakteri hadir dalam
Dalam penelitian ini, dengan memeriksa situs yang tepat dalam membran janin manusia yang
sama, kami menemukan lapisan chorion janin akan berbeda-beda menipis di membran situs
pecah dibandingkan dengan situs yang lebih jauh antara semua subyek menunjukkan bahwa
korion di sekitar lokasi pecah mengalami renovasi yang signifikan throughput keluar kehamilan.
Sebaliknya, dalam pengaturan PPROM, lapisan chorion tipis di semua situs, atau seluruh
membran janin, menunjukkan lebih global, tidak lokal, proses yang terjadi. Anehnya, temuan ini
tetap ada bahkan tanpa adanya histopatologi dikonfirmasi infeksi. Korion tampaknya istimewa
berkurang dalam mata pelajaran PPROM seluruh membran dibandingkan dengan kohort
prematur dan jangka mereka, ada
P
ada
P
menyiratkan bahwa lapisan chorion terutama mengalami perubahan.kerja
Nilaikerja
kerja
nilai
antara perempuan dengan PPROM, kehadiran bakteri lebih besar di
prematur 211,0 (28,7) 140,4 (28,7) 0,08 287,5 (39,3) 275,9 (39,3) 0,83
Term 170,7 (28,7) 195,2 (28,7) 0,55 302,3 (39,3) 293,1 ( 39,3) 0,87
situs pecah dengan lokalisasi pada selaput yang melapisi serviks menunjukkan rute yang menaik
untuk kolonisasi bakteri. Menariknya, tidak ada sampel tanpafluoresensi bakteri
Nilaiditampilkan adalah mean kuadrat terkecil ketebalan korion dengan nilai p

yang menunjukkan bahwa semua sampel ketuban memiliki bakteri ini mencerminkan
perbandingan statistik dari korion antara semua prematur atau jangka
terlepas dari usia kehamilan, persalinan, atau pecah ketuban . subyek bila dibandingkan dengan
paparan kerja. Nilai P tidak signifikan. Perbandingan statistik antara usia kehamilan. PPROM =
prematur, ketuban pecah dini (subyek antara 24 dan 34 minggu setelah konfirmasi pecah ketuban
dengan pemeriksaan fisik)
kehadiran bakteri adalah terbesar di antara mata pelajaran PPROM, sebuah temuan yang
bertahan terlepas dari usia kehamilan, status kerja, atau infeksi. Secara keseluruhan, kehadiran
bakteri ini berbanding terbalik dengan Persalinan Prematur = subyek antara 24 dan 34 minggu
kehamilan dengan
chorion penipisan menunjukkan bahwa korion adalah lapisan yang persalinan prematur spontan.
Prematur, ada Tenaga Kerja = subyek antara 24 dan 34 minggu kehamilan disampaikan prematur
tanpa paparan kerja. Istilah = subyek antara 37 dan 41 minggu dengan tenaga kerja.
Perubahan dan dampak kehadiran bakteri lapisan ini. Bahkan, terlepas dari infeksi, usia
kehamilan, atau status tenaga kerja, sebagai korion menipis keberadaan bakteri meningkat.
Meskipun Term kausal, ada Tenaga Kerja = subyek antara 37 dan 41 minggu tanpa paparan
hubungan antara kehadiran bakteri, korion renovasi, dan tenaga kerja. Pecahnya = sampel
membran dikumpulkan di situs pecah. Jauh = sampel membran yang dikumpulkan dari daerah
yang jauh ke situs pecah, paling sering dekat plasentajelas.;
pecahnyamembrantetap tidak adalah masuk akal bahwa kehadiran bakteri menyebabkan chorion
menipis dan akhirnya PPROM.
Membran pecah telah menjadi
journal.pone.0083338.t003

fokus

dari

banyak

penelitian.

doi:

10.1371

Baru-baru ini, urutan kejadian yang menyebabkan pecahnya membran di

bakteri Kehadiran dan Chorion Menipis
Gambar 2. Rata-rata Jumlah Jumlah Bakteri oleh Grup klinis dan Gestational Umur di
Membrane Pecahnya Situs dan Situs Distant. Figure 2A represents the least square mean number
of bacteria identified among subjects with PPROM as compared to preterm and term cohorts
with and without exposure to labor at ''rupture'' and ''distant'' sites. Figure 2B includes only
subjects without evidence of histologic chorioamnionitis and demonstrates the least square mean
number of bacteria identified among PPROM subjects, compared to all other preterm and term
subjects. Number reported represents nearest whole number of the least square mean bacteria
identified per membrane quadrant, with 16 sites examined per slide per subject. Error bars
represent standard errors for each. doi:10.1371/journal.pone.0083338.g002

Table 4. Least Square Means (LS Mean) of Chorion Thickness by Gestational Age, excluding
Histologic Chorioamnionitis, where all preterm and term subjects have been grouped and
compared to PPROM subjects once all samples with histologic chorioamnionitis have been
excluded.
Rupture (LS Mean/SE in m) P value Distant (LS Mean/SE in m P value
PPROM (n = 10) 98.3 (25.6) #0.01 181.3 (31.8) #0.004
Preterm (n = 12) 191.0 (22.5) 299.7 (27.9)
Term (n = 18) 183.0 (20.2) 297.7 (25.1)
P less than 0.01 at the Rupture site; P less than 0.004 at the Distant site. PPROM= Preterm,
premature rupture of membranes (subjects between 24 and 34 weeks following confirmation of
rupture of membranes by physical exam). Preterm Labor = subjects between 24 and 34 weeks of
gestation with spontaneous preterm labor. Preterm, No Labor = subjects between 24 and 34
weeks of gestation delivered preterm without labor exposure. Term = subjects between 37 and 41
weeks with labor. Term, No Labor = subjects between 37 and 41 weeks without exposure to
labor. Rupture = sample of membrane collected at site of rupture. Distant = sample of membrane
collected from an area distant to rupture site, most commonly near the placenta.
doi:10.1371/journal.pone.0083338.t004
Table 5. Proportion Chorion ( = chorion (m)/choriodecidua (m)) by Clinical Group and
Membrane Location, where ''rupture'' is membrane rupture site and ''distant'' is distal site
sampled.
Group Rupture (Least Square Mean/SE in m) Distant (Least Square Mean/SE in m)
PPROM 0.19 (0.037) 0.27 (0.038)
Preterm 0.34 (0.035) 0.40 (0.035)
Term 0.36 (0.035) 0.42 (0.036)
Value shown represents the proportion of mean chorion thickness as it relates to total mean
choriodecidua thickness with standard errors. Each p,0.0001. PPROM= Preterm, premature
rupture of membranes (subjects between 24 and 34 weeks following confirmation of rupture of
membranes by physical exam). Preterm = subjects between 24 and 34 weeks of gestation with
and without exposure to labor. Term = subjects between 37 and 41 weeks with and without
exposure to labor. Rupture = sample of membrane collected at site of rupture. Distant = sample
of membrane collected from an area distant to rupture site, most commonly near the placenta.
doi:10.1371/journal.pone.0083338.t005
PLOS ONE | www.plosone.org 6 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e83338

Bacterial Presence and Chorion Thinning

Figure 3. Correlation between Chorion Thickness and Bacterial Count Among all Samples by
Membrane Location. Figure 3A is a plot demonstrating the inverse correlation noted between
bacterial presence and chorion measurement at membrane rupture site among all samples
examined. As chorion thins, bacterial counts increase. Figure 3B represents the inverse
correlation between bacterial presence and chorion measurement at all ''distant'' membrane sites
examined. Each dot signifies the correlation value for a single subject.
doi:10.1371/journal.pone.0083338.g003
full term membranes was evaluated mechanically. Rupture
identification of bacteria in all fetal membrane tissues is consistent involves separation of the
chorion from the amnion, fracture of
with the work of others [14], and implies that the bacterial the chorion, and then herniation and
rupture of the amnion [22].
colonization and species present are likely pivotal to understanding Our work suggests PPROM
is unique and has its own pathologic
the pathologic process. proses. The chorion thinning in PPROM described here suggests
Identification of bacteria in preterm subjects without labor or that some process, whether
apoptosis, mechanical stretch, or
histologic infection supports the hypothesis that bacteria may not chemical signaling [29] is at
work globally in the membranes of
be entirely pathogenic and not the lone cause of PPROM. Steel et women with PPROM. Prior
work has demonstrated increased
al used the conserved prokaryotic 16 s ribosomal RNA sequence apoptosis in the fetal chorion of
membrane samples with histologic
labeled with fluorescein to probe fetal membranes using fluores- chorioamnionitis and among
samples with PPROM [24,25] and
cence in situ hybridization (FISH) [14]. Bacteria were found in over [30], suggesting that the
mechanical rupture of term membranes
80% of PPROM patients, but were also present in fetal described by Arikat et al is only part of
the process among women
membranes of preterm deliveries and term deliveries with and with PPROM [22]. We postulate
that the chorion undergoes

without labor. They concluded that bacteria may be present in pathologic thinning (likely due to
increased cellular apoptosis),
fetal membranes, but this alone is not sufficient to cause preterm which weakens the tensile
strength or decreases the physical
labor and delivery[14]. Correspondingly, our data found similar barrier and impedance to
bacteria. Interestingly, the process of
bacterial counts among preterm and full term membranes, with labor does not appear to impart
changes in fetal membranes. The
Table 6. Number of Total Bacteria by Clinical Group and Membrane Location.
N Rupture Site LS mean (SE) P value N Distant Site LS mean (SE) P value
PPROM 14 43 (5) ,0.0001 14 28 (4) ,0.003
Preterm Labor 8 11 (6) 8 8 (5)
Preterm, No Labor 8 8 (6) 8 6 (5)
Term Labor 10 10 (6) 10 7 (5)
Term, No Labor 8 8 (6) 8 5 (5)
Value shown represents the mean number of bacteria visualized at each membrane location
among all subjects within each of the five clinical groups compared with standard errors. At the
rupture site, p,0.0001; At the distant site, p,0.003. PPROM= Preterm, premature rupture of
membranes (subjects between 24 and 34 weeks following confirmation of rupture of membranes
by physical exam). Preterm Labor = subjects between 24 and 34 weeks of gestation with
spontaneous preterm labor. Preterm, No Labor = subjects between 24 and 34 weeks of gestation
delivered preterm without labor exposure. Term = subjects between 37 and 41 weeks with labor.
Term, No Labor = subjects between 37 and 41 weeks without exposure to labor. Rupture =
sample of membrane collected at site of rupture. Distant = sample of membrane collected from
an
area
distant
to
rupture
site,
most
commonly
near
the
placenta.
doi:10.1371/journal.pone.0083338.t006
PLOS ONE | www.plosone.org 7 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e83338
Bacterial Presence and Chorion Thinning
and without labor exposure, again suggesting that regardless of gestational age or presence of
labor, bacteria are present.

Identification of bacteria in term labor subjects is not surprising, but the absence of histologic
chorioamnionitis among these membranes is intriguing. The fact that chorioamnionitis rates are
higher in preterm labor compared to term labor despite nearly the same bacterial count also begs
the question that some degree of tolerance/tissue inhibitors exist in term membranes. Prior
studies have affirmed the finding of bacteria in at least one sample from their preterm labor and
PPROM subjects [31,32]. In 2009, Kim et al evaluated both amniotic fluid and fetal membranes
from patients with intra-amniotic infection using both FISH and PCR [32]. They proposed a
mechanism where discrete regions of the membranes are compromised and allow bacteria to
traverse the membranes resulting in intra-amniotic infection. Little is known regarding discrete
regions of the fetal membrane or of the changes occurring within the membranes in consequence
or defense of bacterial presence, but our data suggests the chorion and its thinning may be the
''battleground''.
Our study is unique in that it examined paired membrane samples from a known site of
collection, obtained uniformly among all samples, from the clinical group of interest with
comparison to well phenotypes with each serving as her own control. Describing bacteria in fetal
membranes regardless of gestational age and correlating bacterial presence to changes in the fetal
chorion within the same tissue sample provides novel information and potentially a unique
perspective on bacterial presence versus pathogenesis in human fetal membranes. Our data
reveals information on localizing bacteria, both in terms of proximity to rupture site, but also in
terms of the fetal membrane layer. Specimen collection done prospectively and with relatively
few investigators provided expeditious, reliable, and uniform tissue samples allowing
interpretation of the localization data. Our dual sample collection method allowed examination
of the variation within a fetal membrane sample. Our work is consistent with the work of others
that have demonstrated a ''zone of weakness'' overlying the cervix among nonlabored, term,
human fetal membranes [33,34,35]. What others noted in membrane strength disparities and
morphologic evaluation over the cervix, we observed visually by functional chorion and
choriodecidua measurements within the membrane, among all gestational ages, with and without
exposure to labor. Furthermore, from our data, among PPROM subjects, properties similar to this
''area of high morphologic change,'' [34], exist throughout the fetal membranes, and not just
overlying the cervix. The correlation with high bacterial presence at membrane rupture site
provides insight into possible mechanisms.
There are several factors that could interfere with our stated aims and conclusions. Bacteria
identified using FISH have not yet been correlated with PCR amplification and sequencing for
species identification. From our data, there remains no clear elucidation of temporal sequence of
events, although our data supports that of Steel, DiGuilo in suggesting that bacteria are present
throughout membranes with our data purporting this bacterial presence exists regardless of route
of delivery. [36,37]. As with any sample collected following vaginal delivery, bacteria detected in
these samples may represent contamination of the tissue during passage through the vagina, and
thus next steps will focus on identification of these bacteria. Identification of the chorion and

bacteria that would be in that chorion may be underestimated due to tissue friability in
processing both during sample collection and slide preparation. Although tissue processing may
impact reproducibility, we chose to overcome this limitation by (1) identifying the trophoblast
cells of human fetal chorion via staining because we were interested in measuring the presence
of only the trophoblast layer and (2) by repeated measurements by
PLOS ONE | www.plosone.org 8 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e83338
Bacterial Presence and Chorion Thinning
the same investigator. Trophoblast cells in the chorion are the
Figure S3 Immunohistochemistry. Viewed at 106 magni- most metabolically active making them
the most germane to study
fication, stained fetal chorion from membrane rupture is shown. [20,38]. Despite subject
variability and tissue processing changes,
Sample images demonstrate membrane ''quadrants'' and how the large sample size and duplicated
measurements allowed us to
chorion thickness compared by Clinical Group: Term, No Labor determine a significant
difference by clinical phenotype. Finally, all
is compared to PPROM. images were measured and scored for fluorescence at least twice
(TIFF) with clinical identification blinded to the reviewer (primary author). Another author
(CER) scored fluorescence in over half of the samples for confirmation. The slides were all
reviewed by the same staff pathologist, providing reliable designation of ''chorioamnionitis'' or
not.
In conclusion, we describe differences within human fetal membranes by proximity to the
rupture site/area overlying the cervix. We detected chorion thinning and bacterial presence in the
rupture site. In PPROM, the chorion is significantly thinned and bacterial presence is
significantly higher regardless of labor exposure, gestational age, or presence of histologic
chorioamnio- nitis compared to other clinical phenotypes. It remains unclear whether chorion
thinning is the cause or consequence of PPROM,
Figure S4 Fluorescent in situ hybridization (FISH) for bacterial DNA. Slides were evaluated
under appropriate UV wavelength with the Zeiss Axio Observer at 10X magnification. Images
were captured via digital photography using three wavelengths for three color channels: blue
(DAPI), red (probe), and green (autofluorescence), and then overlay. A composite overlay image
was obtained by combining the three channels resulting in nuclei appearing blue, bacteria
appearing red, and background tissue autofluorescence appearing yellow (red plus green) or
green. Additional 40X image included demonstrating bacteria around an individual cell nuclei.

(TIFF) but thinned chorion certainly appears to play an important role in membrane integrity.
The goal of this work is to advance the
Acknowledgments understanding of PPROM. Future work should focus on the identification of
specific bacterial species within fetal membranes from all clinical phenotypes. Identification of
specific bacterial species may advance our understanding of the role of bacterial presence and
lead to potential targeted therapeutic interventions.
PLOS ONE | www.plosone.org 9 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e83338 The authors thank
Dr. Rex Bentley for his expertise in histopathology. We thank Dr. Bernard J. Canzoneri for
immunohistochemistry protocol. We thank Drs. Leo Brancazio and Geeta Swamy for assistance
with data analysis and Dr. Haywood Brown for his support. We thank Megan Gill for her
assistance in formatting images. We also thank Ava Feng, Sam Johnson, PhD, and Yasheng Gao,
PhD for their assistance at the Light Supporting Information
Microscopy Core Facility at Duke University. This work was orally presented by Dr. Fortner at
the Society for Maternal-Fetal Medicine 31st Figure S1 Specimen collection. Membrane rupture
and
Annual Meeting in San Francisco, CA, USA. The fluorescence component distant sites were
identified and a strip of membrane was collected.
was presented in poster format by Dr. Fortner at the Society for The membrane strip was rolled,
stabilized, sectioned, and then
Gynecologic Investigation in Miami, FL, USA. formalin fixed and paraffin embedded. (TIFF)
Author Contributions
Figure S2 Immunohistochemistry. Sample slide. Figure
Conceived and designed the experiments: KBF CER LF CAG RPH PCS demonstrates that each
slide contained four representative sections of the rolled membrane. Figure also demonstrates
stained trophoblast layer of the chorion and cuboidal cells of the amnion. Images were obtained
at 106 magnification from four separate areas of each membrane roll.
APM. Performed the experiments: KBF CER LF APM. Analyzed the data: KBF APM LL.
Contributed reagents/materials/analysis tools: CAG PCS RPH LF APM. Wrote the paper: KBF
APM CAG. Reviewed microscope images: KBF CER. Edited the manuscript: CAG CER RPH
LF LL PCS RCB.
(TIFF)
References

1. Hamilton BE, Martin JA, Ventura S (2010) Births: Preliminary Data for 2008. Atlanta,
Georgia: Centers for Disease Control. US Department of Health and Human Services US
Department of Health and Human Services. Vol 58, No 16 p. 2. Saigal S, Hoult LA, Streiner DL,
Stoskopf BL, Rosenbaum PL (2000) School difficulties at adolescence in a regional cohort of
children who were extremely low birth weight. Pediatrics 105: 325331. 3. Saigal S, Stoskopf B,
Streiner D, Boyle M, Pinelli J, et al. (2006) Transition of extremely low-birth-weight infants
from adolescence to young adulthood: comparison with normal birth-weight controls. Jama 295:
667675. 4. Kuban KC, Leviton A (1994) Cerebral palsy. N Engl J Med 330: 188195. 5. Crofts
BJ, King R, Johnson A (1998) The contribution of low birth weight to severe vision loss in a
geographically defined population. Br J Ophthalmol 82: 9 13. 6. Kobaly K, Schluchter M,
Minich N, Friedman H, Taylor HG, et al. (2008) Outcomes of extremely low birth weight (,1 kg)
and extremely low gestational age (,28 weeks) infants with bronchopulmonary dysplasia: effects
of practice changes in 2000 to 2003. Pediatrics 121: 7381. 7. Avchen RN, Scott KG, Mason CA
(2001) Birth weight and school-age
disabilities: a population-based study. Am J Epidemiol 154: 895901. 8. Swamy GK, Ostbye T,
Skjaerven R (2008) Association of preterm birth with long-term survival, reproduction, and nextgeneration preterm birth. JAMA 299: 14291436. 9. Moutquin JM (2003) Classification and
heterogeneity of preterm birth. Bjog 110
Suppl 20: 3033. 10. Martin JA HB, Ventura SJ, Osterman MJK, Mathews TJ (2013) Births:
Final
Data for 2011. Centers for Disease Control and Prevention. 14,15, and 47 p.
11. Murtha AP, Nieves A, Hauser ER, Swamy GK, Yonish BA, et al. (2006) Association of
maternal IL-1 receptor antagonist intron 2 gene polymorphism and preterm birth. Am J Obstet
Gynecol 195: 12491253. 12. Jacobsson B (2005) Intra-amniotic infection and inflammation in
preterm birth is bacteria always the connection? Commentary on the article by Miralles et al. on
page 570. Pediatr Res 57: 473474. 13. Cahill RJ, Tan S, Dougan G, O'Gaora P, Pickard D, et al.
(2005) Universal DNA primers amplify bacterial DNA from human fetal membranes and link
Fusobacterium nucleatum with prolonged preterm membrane rupture. Mol Hum Reprod 11:
761766. 14. Steel JH, Malatos S, Kennea N, Edwards AD, Miles L, et al. (2005) Bacteria and
inflammatory cells in fetal membranes do not always cause preterm labor. Pediatr Res 57: 404
411. 15. Yoon BH, Romero R, Kim M, Kim EC, Kim T, et al. (2000) Clinical implications of
detection of Ureaplasma urealyticum in the amniotic cavity with the polymerase chain reaction.
Am J Obstet Gynecol 183: 11301137. 16. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E,
Dethlefsen L, et al. (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308: 1635
1638. 17. Fredricks DN, Fiedler TL, Marrazzo JM (2005) Molecular identification of
bacteria associated with bacterial vaginosis. N Engl J Med 353: 18991911. 18. Relman DA,
Loutit JS, Schmidt TM, Falkow S, Tompkins LS (1990) The agent of bacillary angiomatosis. An

approach to the identification of uncultured pathogens. N Engl J Med 323: 15731580. 19.
Malak TM, Ockleford CD, Bell SC, Dalgleish R, Bright N, et al. (1993) Confocal
immunofluorescence localization of collagen types I, III, IV, V and VI and their ultrastructural
organization in term human fetal membranes. Placenta 14: 385406.
Bacterial Presence and Chorion Thinning
20. Khong TY, Lane EB, Robertson WB (1986) An immunocytochemical study of
29. Moore RM, Novak JB, Kumar D, Mansour JM, Mercer BM, et al. (2009) fetal cells at the
maternal-placental interface using monoclonal antibodies to
Alpha-lipoic acid inhibits tumor necrosis factor-induced remodeling and keratins, vimentin and
desmin. Cell and tissue research 246: 189195.
weakening of human fetal membranes. Biology of reproduction 80: 781787. 21. Uchide N OK,
Bessho T, Toyoda H (2005) Induction of pro-inflammatory
30. McLaren J, Malak TM, Bell SC (1999) Structural characteristics of term human cytokine
gene expression and apoptosis in human chorion cells of fetal
fetal membranes prior to labour: identification of an area of altered morphology membranes by
influenza virus infection; possible impications for maintenance
overlying the cervix. Human reproduction 14: 237241. and interruption of pregnancy during
infection. Med Sci Monit 11: 716.
31. Jones HE, Harris KA, Azizia M, Bank L, Carpenter B, et al. (2009) Differing 22. Arikat S,
Novince RW, Mercer BM, Kumar D, Fox JM, et al. (2006) Separation
prevalence and diversity of bacterial species in fetal membranes from very of amnion from
choriodecidua is an integral event to the rupture of normal term
preterm and term labor. PLoS One 4: e8205. fetal membranes and constitutes a significant
component of the work required.
32. Kim MJ, Romero R, Gervasi MT, Kim JS, Yoo W, et al. (2009) Widespread American journal
of obstetrics and gynecology 194: 211217.
microbial invasion of the chorioamniotic membranes is a consequence and not a 23. El Khwad
M, Pandey V, Stetzer B, Mercer BM, Kumar D, et al. (2006) Fetal
cause of intra-amniotic infection. Lab Invest 89: 924936. membranes from term vaginal
deliveries have a zone of weakness exhibiting

33. El Khwad M, Stetzer B, Moore RM, Kumar D, Mercer B, et al. (2005) Term characteristics
of apoptosis and remodeling. Journal of the Society for
human fetal membranes have a weak zone overlying the lower uterine pole and Gynecologic
Investigation 13: 191195.
cervix before onset of labor. Biology of reproduction 72: 720726. 24. George RB, Kalich J,
Yonish B, Murtha AP (2008) Apoptosis in the chorion of
34. Malak TM, Bell SC (1994) Structural characteristics of term human fetal fetal membranes in
preterm premature rupture of membranes. Am J Perinatol
membranes: a novel zone of extreme morphological alteration within the 25: 2932.
rupture site. British journal of obstetrics and gynaecology 101: 375386. 25. Murtha AP, Auten
R, Herbert WN (2002) Apoptosis in the chorion laeve of term
35. McParland PC, Taylor DJ, Bell SC (2003) Mapping of zones of altered patients with
histologic chorioamnionitis. Infect Dis Obstet Gynecol 10: 9396.
morphology and chorionic connective tissue cellular phenotype in human fetal 26. Canzoneri BJ
FL, Grotegut CA, Bentley RC, Heine RP, Murtha AP (2013) The
membranes (amniochorion and decidua) overlying the lower uterine pole and Chorion Layer of
Fetal Membranes is Prematurely Destroyed in Women with
cervix before labor at term. American journal of obstetrics and gynecology 189: Preterm
Premature Rupture of the Membranes. Reprod Sci in press.
14811488. 27. Redline RW, Faye-Petersen O, Heller D, Qureshi F, Savell V, et al. (2003)
36. DiGiulio DB, Romero R, Amogan HP, Kusanovic JP, Bik EM, et al. (2008) Amniotic
infection syndrome: nosology and reproducibility of placental reaction
Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm patterns. Pediatr
Dev Pathol 6: 435448.
labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One 3: e3056. 28. Mercer BM,
Miodovnik M, Thurnau GR, Goldenberg RL, Das AF, et al. (1997)
37. Hill AB (1965) The Environment and Disease: Association or Causation? Antibiotic therapy
for reduction of infant morbidity after preterm premature
Proc R Soc Med 58: 295300. rupture of the membranes. A randomized controlled trial. National
Institute of

38. Young A, Thomson AJ, Ledingham M, Jordan F, Greer IA, et al. (2002) Child Health and
Human Development Maternal-Fetal Medicine Units
Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and Network. JAMA:
the journal of the American Medical Association 278: 989
fetal membranes during human parturition at term. Biology of reproduction 66: 995.
445449.
PLOS ONE | www.plosone.org 10 January 2014 | Volume 9 | Issue 1 | e83338
Reproduced with permission of the copyright owner. Reproduksi lanjut dilarang tanpa izin.