teknik sterilisasi dan pembuatan media

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan ini adalah:
1. Untuk mengenal beberapa cara sterilisasi
2. Mengetahui macam-macam media dan pembuatannya
3. Memperoleh alat dan media yang steril
1.2 Latar Belakang
Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosa mikrobiologis, sterilisasi
sangat diutamakan baik alat-alat yang siap pakai maupun medianya. Suatu alat atau bahan
dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk
vegetatif maupun spora. Oleh karena itu, bagi seorang pemula di bidang mikrobiologi sangat
perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman, hal ini semua
merupakan dasar-dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi (Volk & Wheeler, 1993).
Secara umum, sterilisasi merupakan suatu proses pemusnahan kehidupan khususnya
mikrobia dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sesuai tujuan percobaan dalam
percobaan ini diharapkan praktikan dapat membuat dan mensterilkan media dan alat yang
akan digunakan. Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua
mikroorganisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang
umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaaan panas, penggunaan bahan kimia, dan
penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut
sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi kering (Achmad, 2007).
Medium ialah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau
didalamnya. Sebelum menumbuhkan mikroorganisme, pertama-tama kita harus dapat
memahami kebutuhan dasarnya lalu mencoba memformulasikan suatu medium yang
memberikan hasil baik. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba dapat
diklasifikasikan berdasarkan pada komposisi (medium sintetis, semi sintetis, dan non
sintetis), konsentrasi (solid medium, semi solid medium, dan broth medium), dan selektivitas
(medium umum, selektif, diferensial, medium uji, dan medium diperkaya) (Waluyo, 2005).
BAB II
DASAR TEORI
Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan
steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya baik yang
mengganggu atau yang merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang
dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, maupun mekanik yang membunuh semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2005).

Ketika anda pertama kali melakukan pemindahan biakan secara aseptik, sesungguhnya
anda sudah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Sterilisasi adalah
proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril. Sterilisasi seringkali
dilakukan dengan pengaplikasian udara panas. Ada dua metode yang sering digunakan, yaitu
Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk sterilisasi karena
menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus kuat dan kelembaban
sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba yang menyebabkan
sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121oC pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15
menit. Alat yang digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort. Panas kering,
biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium. Suhu efektifnya adalah 160oC
selama 2 jam. Alat yang sering digunakan pada umumnya adalah oven
( Hadioetomo, 1993).
Agar biakan murni dapat dibuat, medium harus steril sebelum inokulasi; yaitu kita
harus yakin bahwa tidak ada organismehidup dapat berada dalam medium jika diinokulasi.
Metode yang lazim digunakan untuk mensterilkan media ialah menempatkannya dalam
otoklaf (sebetulnya panci masak bertekanan besar dan dielaborasi). Otoklaf menggunakan
uap bertekanan untuk menaikkan suhu barang yang sedang disterilkan sampai suatu taraf
yang mematikan semua bentuk kehidupan. Untuk sterilisasi rutin, otoklaf biasanya
dioperasikan pada tekanan uap 15 lb/in2. Pada tekanan ini suhu menjadi 121 oC. Waktu yang
diperlukan pada suhu ini adalah 15 sampai 20 menit. Apabila medium berukuran besar
disterilkan, maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang, karena panas memerlukan
waktu untuk menembus bahan tersebut (Volk & Wheeler, 1993).
Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia
tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas
tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan
membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel.
Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan
biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering
(Waluyo, 2005).
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi sistem batch adalah temperatur dan
lama pemanasan. Proses pemusnahan mikroba kontaminan dapat digambarkan sesuai reaksi
kimia orde satu yang memenuhi persamaan kinetika :
................ (1)

Dimana N adalah jumlah sel yang hidup pada waktu t tertentu, t adalah lama sterilisasi
dan Kd adalah konstanta laju kematian spesifik. Dengan memplot nilai

terhadap

t, maka didapat garis lurus dengan kemiringan Kd. pada kematian mikroorganisme secara
sterilisasi juga berlaku persamaan Arhenius yang menunjukkan bahwa temperatur
mempengaruhi konstanta laju kematian spesifik :
........... (2)

Dimana A adalah konstanta Arhenius, Ea adalah energi aktivasi, dan R adalah konstanta
gas dan T adalah temperatur absolut pemanasan. Dari persamaan ini terlihat bahwa laju reaksi
kematian sel akan meningkat jika temperatur sterilisasi meningkat karena peningkatan
temperatur menyebabkan peningkatan Kd. nilai Ea dan Kd didapat dari hubungan pada
persamaan Arhenius tersebut dengan cara mengalurkan ln Kd terhadap 1/T (Achmad, 2007).
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang
berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat
dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba.
Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus
memenuhi syarat-syarat, antara lain : harus mengandung semua zat hara yang mudah
digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH
yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang
dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum
digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik
(Sutedjo, 1991).
Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi
padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agaragar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus
Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai
makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).
Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri
dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal
dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali
dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan
indikator. Komposisi media bakteri dapat dimodifikasi sehingga dapat digolongkan menjadi
media umum, media selektif (bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh) dan media diferensial
(bakteri tumbuh dengan memberikan ciri-ciri tertentu) (Achmad, 2007).
Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai
media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah
disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan

cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara
menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah
mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua media tersebut secara
komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA
(Trypticase Soy Agar) dan lain-lain. Bakteri, dari kata latin bacterium (jamak, bacteria)
adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan
kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa
nukleus (inti sel), Cytoskelen, dan organik lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena
bakteri merupakan prokaryota, untuk membedakan dengan organisme lain yang memiliki sel
yang lebih kompleks, disebut eukaryota. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari
semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air dan sebagai simbiosis
dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil,
biasanya berukuran 0.5 5 m, meskipun akan ada juga jenis yang dapat menjangkau 0.3
mm dalam diameter (Thiomargarita) (Rachdie, 2006).

BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah cawan petri, erlenmeyer, tabung
reaksi, otoklaf, pipet mohr, sudip, neraca analitik, magnetic stirer, hot plate dan rak tabung
reaksi.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah akuades, nutrient agar (NA), potato
destroxe agar (PDA) dan MEA (Malt Extract Agar).

1.
2.
3.
4.
5.
6.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Media NA dan Sterilisasi
1,2 gram nutrien agar (NA) ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
Ditambahkan 50 mL akuades.
Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai
homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet
gelang.
Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan selama 2
jam pada suhu 121oC dan tekanan 15 psi.
3.3.2 Pembuatan Media PDA dan Sterilisasi
1. 1,95 gram potato destroxe agar (PDA)
Erlenmeyer.

ditimbang dan dimasukkan ke dalam

2. Ditambahkan 50 mL akuades.
3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer
sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan
karet gelang.
6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan
selama 2 jam pada suhu 121oC dan tekanan 15 psi.
3.3.3 Pembuatan Media MEA (Malt Extract Agar) dan Sterilisasi
1. 2,4 gram MEA ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.

2. Ditambahkan 50 mL akuades.
3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer
sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat.
4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi.
5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan
karet gelang.
6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan
selama 2 jam pada suhu 121oC dan tekanan 15 psi.

7.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Tabel 4.1.1 Hasil pengamatan pembuatan media

N
O
1

MEDIA
Nutrient Agar (20 gr/L)

KOMPOSISI
Komposisi :
Peptone 5 gr/L
Meat Ekstrak 3 gr/L
Agar 12 gr/L
Warna sesudah sterilisasi: kuning

Potato Destroxe Agar (39 gr/L)

Komposisi :
Potato 4 gr/L
Glucose 20 gr/L
Agar 15 gr/L
Warna sesudah sterilisasi: kuning
bening

Malt Extract Agar (48 gr/L)

Komposisi :
Malt Ekstrak 30 gr/L
Pepton 3 gr/L
Agar 15 gr/L
Warna sesudah sterilisasi: kuning
kemerahan

4.2 Pembahasan
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang
berguna untuk membiakkan mikroba. Media juga merupakan makanan atau campuran dari
beberapa bahan makanan yang disiapkan untuk pertumbuhan mikroorganisme. Media dapat
digunakan untuk isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan
sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium
tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara
yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan
permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak
mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam
keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan
baik.
Beberapa macam contoh media sintetik adalah Nutrient Agar, Potato Destroxe Agar
dan Malt Extract Agar. Media-media ini memiliki fungsi yang berbeda-beda. Nutrient Agar
digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri. Pembuatan media pada percobaan ini dengan
menggunakan NA (Nutrien agar), dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara
melarutkan NA instan sebanyak 1,2 g kedalam erlenmeyer dan menambahkan akuades
sebanyak 50 mL, setelah itu memanaskannya diatas hot plate diikuti oleh pengadukan dengan
menggunakan magnetik stirer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk
menghomogenkan NA dengan akuades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat
pelarutan dari NA dengan akuades. Setelah dipanaskan sampai kira-kira larutan menjadi
bening kekuning-kuningan sebagai tanda larutan telah homogen kemudian larutan yang
terdapat di dalam erlenmeyer dimasukan kedalam autoklav dengan mulut erlenmeyer
disumbat dengan kapas yang dilapisi dengan kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini di
maksudkan agar meminimalkan kontaminasi. Selain itu ada juga yang dimasukkan ke dalam
tabung reaksi sebanyak 4 mL.
Selain NA juga digunakan media PDA (Potato Destroxe Agar) digunakan untuk
menumbuhkan fungi atau jamur. Pembuatan media pada percobaan ini dengan menggunakan
PDA (Potato Destroxe Agar), dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara
melarutkan PDA (Potato Destroxe Agar) instan sebanyak 1,95 g ke dalam erlenmeyer dan
menambahkan akuades sebanyak 50 mL, setelah itu memanaskannya diatas hot plate diikuti
oleh pengadukan dengan menggunakan magnetik stirer, tujuan dari pemanasan dan
pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan PDA (Potato Destroxe Agar) dengan
akuades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari PDA (Potato
Destroxe Agar) dengan akuades. Setelah dipanaskan sampai kira-kira larutan menjadi bening
kekuning-kuningan tetapi lebih bening daripada PDA (Potato Destroxe Agar) sebagai tanda
larutan telah homogen kemudian larutan yang terdapat di dalam erlenmeyer dimasukan
kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas yang dilapisi dengan
kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini di maksudkan agar meminimalkan kontaminasi.
Selain itu ada juga yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL.
Media berikutnya adalah MEA (Malt Extract Agar) digunakan sebagai media
pertumbuhan yeast atau khamir. dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara
melarutkan MEA (Malt Extract Agar) instan sebanyak 2,4 g ke dalam erlenmeyer dan
menambahkan akuades sebanyak 50 mL, setelah itu memanaskannya diatas hot plate diikuti

oleh pengadukan dengan menggunakan magnetik stirer, tujuan dari pemanasan dan
pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan MEA (Malt Extract Agar) dengan akuades,
dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari MEA (Malt Extract Agar)
dengan akuades. Setelah dipanaskan sampai kira-kira larutan menjadi kuning kemerahmerahan sebagai tanda larutan telah homogen kemudian larutan yang terdapat di dalam
erlenmeyer dimasukan kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas
yang dilapisi dengan kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini di maksudkan agar
meminimalkan kontaminasi. Selain itu ada juga yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi
sebanyak 4 mL.
Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf termasuk dalam
teknik sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap dan tekanan, karena uap mempunyai
data tembus yang lebih besar dan mengakibatkan pengumpulan pada protoplasma sel-sel
yang disterilkan. Alat ini lebih sering digunakan dalam teknik pensterilan di kelasnya
khususnya pada percobaan ini. Karena tingkat keefisienan dan sifat alat yang tidak merusak
kandungan dalam media pertumbuhan yang dipakai, yaitu Nutrient Agar, Potato Destroxe
Agar dan Malt Extract Agar.
Autoklaf yang ada di laboratorium terbagi menjadi dua yaitu yang digunakan untuk
sterilisasi alat dan medium yang akan dipakai, serta yang digunakan untuk destruksi atau
sterilisasi kotor. Rongga di dalam otoklaf tidak boleh terlalu penuh diisi dengan benda-benda
yang akan disterilisasikan agar dapat terjadi aliran uap yang cukup baik. Bahan-bahan yang
akan disterilkan di otoklaf dipanaskan hingga 121o C selama 15-20 menit pada tekanan 15
psi. Uap air jenuh memanaskan bahan-bahan tadi sehingga dengan cepat disterilkan dengan
melepaskan panas laten. Dengan kondensasi sejumlah 1600 ml uap pada 100 o C dan tekanan
1 atm, akan terjadi embun sejumlah 1 ml dengan melepaskan 518 kalori. Air yang
mengembun tadi akan menyebabkan keadaaan lembab yang cukup untuk membunuh kuman,
sehingga alat dan medium yang dipakai akan menjadi steril.
Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika)
yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme, dan proses ini sangat
penting bagi pemeriksaaan mikroorganisme. Sterilisasi yang ingin dilakukan pada percobaan
ini adalah percobaan secara fisika, yaitu sterilisasi yang menggunakan panas, dimana panas
yang digunakan adalah bersama-sama uap air yang biasanya disebut sterilisasi panas lembab
atau sterilisasi basah.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari percobaan ini adalah:
1. Teknik sterilisasi dapat dilakukan dengan tekanan uap tinggi menggunakan otoklaf sehingga
alat dan media steril.
2. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna
untuk membiakkan mikroba

3. Komposisi media bahan sangat penting dalam memenuhi kebutuhan nutrisi bakteri demi
mengoptimalkan pertumbuhannya, yang mana tiap-tiap komposisi harus setimbang
jumlahnya.
4. NA (Nutrient Agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri.
5. MEA (Malt Extract Agar) digunakan sebagai media pertumbuhan yeast atau khamir.
6. PDA (Potato Destroxe Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi atau jamur.
7. Sterilisasi dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan.
5.2 Saran
Saran-saran untuk percobaan ini adalah hendaknya praktikan lebih teliti dan berhatihati saat melakukan pembuatan media, sehingga media yang dihasilkan baik dan memenuhi
syarat suatu media.

DAFTAR PUSTAKA
Achmad Dinoto. 2007. Media Agar. Ide Besar Istri Peneliti.
Http://www.nvtech.com
Diakses tanggal 1 November 2010
Hadioetomo, R. S. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia:
Jakarta.
Rachdie. 2006. Mengenal Media Pertumbuhan Mikrobia.
Http://rachdie.blogsome.com/2006/10/18/mengenal-media-pertumbuhan-mikrobial/tracback
Diakses tanggal 1 November 2010
Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta: Jakarta.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima. Erlangga: Jakarta.
Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM Press: Malang.