Produccin industrial de enzimas

Albn Alba, Ral

Andrades Delgado, lvaro
Argente Del Castillo Rodrguez, Paula
Baer, Anne Catherine
Bjar Martn, Carlos
Blanco Piar, Jess

Bolvar Castro, Laura

Bueno Arribas, Miranda
Cano Adamuz, Nuria
Corts Guerrero, Manuel
Cuevas Delgado, Paula
Fernndez Molina, Cristina

NDICE
A. Introduccin
1. Biocatlisis
2. Fermentacin
3. Ventajas del uso de
microorganismos
B. Enzimas clsicas
1. -amilasas
2. Glucosa isomerasas
3. Proteasas
4. Rennina
5. Lipasas
6. Penicilina acilasas

C. Enzimas novedosas
1. Lacasas
2. Celulasas
D. Bibliografa

A. Introduccin
Biocatlisis: proceso que emplea clulas o enzimas aisladas para obtener productos de inters.
Productos comercialmente
importantes de las fermentaciones
Clulas microbianas
Molculas grandes (enzimas y
polisacridos)
Metabolitos primarios
Metabolitos secundarios
Slida
Fermentaciones
Sumergida

Escalado industrial

Ventajas de la produccin microbiana

Fuente verstil de enzimas
Capacidad de ser modificadas genticamente
Fcil purificacin
Necesidad de poca superficie de cultivo
Rendimiento elevado
Velocidad de crecimiento y produccin de enzimas altos

Proceso econmico

Produccin industrial de enzimas

B. ENZIMAS CLSICAS

B.1. -amilasas
B.2. Glucosa isomerasas
B.3. Proteasas
B.4. Rennina
B.5. Lipasas
B.6. Penicilina acilasas

B.1.1. Amilasas: Aplicacin y situacin actual

Amilasas

Enzimas
Extracelulares
que hidrolizan
enlaces -1,4glicosdicos

Tipos

Aplicaciones
-amilasas

-amilasas

Qumica clnica, mdica y

analtica

Gluco-amilasas
Enzimas

Fuente

Aplicaciones

-amilasa

-amilasas bacterianas
(ej. B. subtilis) fngicas
(ej. A. niger)

Textil, siropes de
almidn, detergente para
lavar, fermentacin

-amilasa

Cepa de Bacillus

Sirope de maltosa,
destilacin de cerveza

A. niger

Manufacturacin de
siropes de dextrosa y
produccin de sirope rico
en fructosa

-amilasa

Sacarificacin del almidn

Industria textil, alimentaria

cervecera y de destilado

B.1.2. Microorganismos empleados para la produccin industrial

Microorganismos
productores

Especies
bacterianas

B. Subtilis

Origen fngico

A. Oryzae

Levaduras

S. cerevisiae

B.1.3. Produccin industrial -amilasa

Llevada a caboSepor
la maquinaria
celular normal de
lleva
a cabo
Lasntesis
produccin
gracias a la
industrial se lleva a
maquinaria celular
cabo de forma
Produccin
industrial:
de forma discontinua discontinua
normal
de sntesis

Baja velocidad crecimiento exponencial, alta en fase de

esporulacin
Baja produccin
Secretada dedurante
manera constitutiva
crecimiento
exponencial

Inductores de bajo peso molecular

Inductores de bajo
molecular
Fermentadorespeso
de 200
y 600 L

Aumenta
drsticamente antes
de la formacin de
esporas

B.1.3. Produccin industrial de -amilasa (SSF y SmF)

Induccin en presencia de almidn
o maltosa
Desechos industriales y agrarios

Fuentes de
carbono

A.oryzae: Condiciones y edad del

micelio.
Posible represin por catabolito:
glucosa, fructosa y xilosa

B.1.3. Produccin industrial de -amilasa (SSF y SmF)

Licor de maz, casena, extracto
de levadura, triptona, nitrato de
amonio, nitrato de potasio y
cloruro de amonio.

Fuentes de
nitrgeno

La peptona es la fuente con la

que se alcanza la mxima
produccin.

B.1.3. Produccin industrial de -amilasa (SSF y SmF)

Temperatura

pH

Iones metlicos

Humedad

Surfactantes

Depende de si el cultivo es mesfilo o termfilo

Bacillus: 37-60 oC
Hongos pH 5
Bacterias pH 6-7

Uso posterior de
la enzima

Permiten buen crecimiento

Humedad inicial: 70-80%

Humedad: tasa de transferencia de oxgeno.
Aumentan permeabilidad celular
Aumentan secrecin de protenas
PEG, Tween 80

Principalmente
inmovilizada
sobre soportes

B.2. Glucosa Isomerasa

B.2.1. APLICACIN DE LA ENZIMA Y SITUACIN ACTUAL

Produccin de jarabe de maz de alto

contenido en fructosa (HFCS)
B.2.2. MICROORGANISMOS PARA LA PRODUCCIN COMERCIAL DE LA
ENZIMA

En su mayora gnero Streptomyces y

Bacillus.
En la mayora de los casos es
intracelular.

B.2.3 Produccin Industrial de Glucosa Isomerasa

Condiciones del medio
Inductor y represor:
- La mayora de los productores requieren de D-xilosa como inductor
SOLUCIN:
Reemplazo por almidn, glucosa, sorbitol o glicerol

INCONVENIENTE:
Es cara

- La glucosa acta como represor en una de las principales cepas productoras de glucosa isomerasa (B.
Coagulans).
Fuente adecuada y barata

Fuente de nitrgeno:
Formas complejas
Peptona, extracto de levadura, o
sales de amonio pueden ser
usadas con Bacillus coagulans.

Lquido de macerado
del maz

Uso limitado: su produccin

depende de la estacin y la
variabilidad entre lotes.

B.2.3 Produccin Industrial de Glucosa Isomerasa

pH y temperatura:
La fuente de nitrgeno afecta al pH.
La mayora de las fermentaciones
productoras de GI son llevadas a cabo
entre un pH 7 y 8.

Temperatura ptima oscila dependiendo

del tipo de microorganismo: desde 30 oC
(Streptomyces) a 60 oC (especies
termfilas de Bacillus).

Requerimiento de iones
Son requeridos para la produccin ptima de la enzima
Depende de la fuente de enzima.
B.2.4. UTILIZACIN POSTERIOR

Enzima inmovilizada

B.3. Proteasas
B.3.1. Introduccin
Hidrolizan protenas rompiendo enlaces peptdicos.
Las ms usadas son las proteasas alcalinas.

Alcalinas

Tipos

Neutras

Enzimas

Fuente

Aplicaciones

Alcalina

Bacillus, Streptomyces y
Aspergillus

Detergentes, industria
lctica, farmacolgica y
del cuero

Neutra

cida

cidas

Bacillus y Aspergillus

Industria alimentaria e
industria del cuero

Aspergillus

Poco utilizadas en la
industria

B.3.2. Microorganismos empleados para la produccin industrial de

proteasas

Enzimas extracelulares.
La bsqueda de las mejores cepas
productores se hace en medios muy
alcalinos.
Mejoras de cepas silvestres:
Mayor estabilidad a pH alcalino y
altas temperaturas.
Resistencias a agentes qumicos.

MICROORGANISMOS
PRODUCTORES

Especies
bacterianas

B. licheniformis y
B. firmus

S. ariseus y S.
rectus

Origen
fngico

A. niger y A.
oryzae

B.3.3. Produccin industrial de proteasas alcalinas

Fermentacin lquida o sumergida. Fermentadores de 40 a 1000 m3.
Periodo de incubacin: en Bacillus ronda entre las 36 y 96 horas.
Se usan en forma soluble.

Fuente de carbono

Fuente de nitrgeno
Temperatura
pH
Iones metlicos
Aireacin y agitacin

Carbohidratos: lactosa, sacarosa, maltosa y fructosa.

cidos orgnicos: cido actico o ctrico.
Fuentes orgnicas. Harina de soja.

Entre 25 y 37C

Entre 7 y 11
Mg2+ y Ca2+ aumentan la produccin.
Proceso aerobio.
Requiere agitacin.

B.3.4. Perspectivas de futuro

Se han obtenido:
Proteasas alcalinas termoestables.
Cepas productoras con residuos
agrcolas.

Mejorar su
estabilidad

A altas temperaturas

A pH alcalino o cido

En presencia de detergentes y otros

agentes qumicos

B.4. Rennina o Quimosina

Enzima endoproteasa asprtica
Elevada actividad coagulante
Baja actividad proteoltica inespecfica
Adecuada para la produccin de queso en la industria lctea

Origen animal: cuajo de ternera

Se encuentra en el cuajo (rennet)
Se produce en el abomaso (cuarto estmago de los rumiantes)

Produccin industrial
El cuajo de ternera cubre el 20-30% de la demanda mundial en la fabricacin de queso.
Alternativas: enzimas coagulantes de la leche de origen vegetal, microbiano u obtenidas por tcnicas de
ADN recombinante.

B.4.2. Microorganismos productores de enzimas coagulantes de la leche

Coagulantes
microbianos

Especificidad de sustrato
Alta relacin actividad coagulante /
Actividad proteoltica (AC/AP)
Suficiente termolabilidad

Quimosina
recombinante

Rhizomucor
miehei

Escherichia
coli K-12

Rhizomucor
pusillus

Kluyveromyces
lactis

Cryphonectria
parastica

Aspergillus
niger var.
awamori

B.4.3. Produccin industrial de quimosina

R. Miehei

Caractersticas de la enzima:
- Metabolito secundario parcialmente asociado al crecimiento
- Inducible (principal inductor: casena)
- Regulada por represin del tipo feed-back (retro-regulacin)

Modelo del proceso de fermentacin:

- Mayor produccin en procesos continuos
- Sistemas de fermentacin en estado slido y sumergido
- Fermentadores mayores que 1 m3

Parmetros ptimos de la fermentacin:

- Medio de cultivo: sustitucin de medios de cultivo sintticos (glucosa, extracto de malta,)
por subproductos industriales (lactosuero, harina de maz,)

- Aireacin: mantenimiento del oxgeno disuelto en condiciones no limitantes

- Agitacin: sensibilidad a la agitacin
- Temperatura: mejores rendimientos de la enzima incubando a 35 oC
- pH: pH inicial entre 4.5-5.5 y mantenimiento constante a valores inferiores a 6.5

B.4.3. Produccin industrial de quimosina

Aspergillus

Tcnica de ADN recombinante:

- Hospedador: Aspergillus niger var. Awamori
- Estrategia de fusin: cDNA de la proquimosina + glaA
- Mutantes resistentes a 2-desoxiglucosa (dgr)

Parmetros ptimos de la fermentacin:

- Alto nivel de produccin en estado slido (salvado de trigo)
- La suplementacin con casena favorece la produccin
- Aireacin: 0.5 vvm
- Agitacin: 600 rpm
- Temperatura: 35 oC
- pH: 5.5

B.4.4. Utilizacin posterior de la enzima

Derivados inmovilizados enzimticos

Comercialmente se expende en
polvo, pastilla o lquido

B.5. Lipasas
B.5.1. Aplicacin y situacin actual
Reacciones de hidrlisis y
transesterificacin

Buen comportamiento,
inters industrial

Elevado precio

Microorganismos
utilizados
industrialmente

Hidrlisis de TG
Sntesis de steres a partir de glicerol y AG de cadena larga
Participacin en procesos de: alcoholisis, acidolisis, aminolisis

Amplio rango de pH y temperaturas

No necesita cofactores

Uso restringido clsicamente

Depende de la aplicacin industrial (diferentes lipasas

producidas por diferentes m.o)
Incluyen bacterias, actinomicetos, hongos y levaduras
Microorganismo ms utilizado: Candida rugosa

B.5. Lipasas
B.5.2. Produccin industrial: factores

La mayora son extracelulares (adicin de cationes favorece su liberacin)

Plegamiento en el espacio periplsmico correcta secrecin y actividad
Induccin: en presencia de lpidos
Fase de crecimiento: final de la fase exponencial de crecimiento
Temperatura y pH: 35-37 C y pH en torno a valores de 6-8
Fuentes de nutrientes
Fuente de carbono: lpidos (sistema en dos fases/uso de surfactantes), azcares
(crecimiento del m.o)
Fuente rica en nitrgeno (produccin de protenas)
Aireacin: m.o aerobios estrictos suministro de oxgeno al biorreactor
Tipo de fermentador: batch/fed-batch/continuo/SSF

B.5. Lipasas
B.5.3. Uso posterior
Depende de su aplicacin
Inmovilizadas (por ejemplo en micro o nanopartculas de agar o slice)
Sin inmovilizar, libres

B.5.4. Perspectivas de futuro

Biocombustibles, cosmticos lubricantes, farmacuticos, en el campo de
la medicina, etc
El coste afecta a su utilizacin
SSF como solucin econmica, o inmovilizacin

B.6. Penicilina acilasas

B.6.1 Aplicacin y situacin actual
Hidrolizan penicilinas liberando 6-APA:
Sntesis
qumica

Penicilina G

c. fenilactico

6-APA

Penicilinas semisintticas
(ej.: ampicilina)

Algunos microorganismos producen 6-APA directamente, pero es caro.

Tipo I (PVAs)
Nativa:

Tipos

Tipo II (PGAs)

Tipo III
(ampicilina
acilasas)

Produccin
industrial

Mutantes de E. coli ATCC

11105 (o 9637)
Recombinante:
PGA de E. coli ATCC 11105 en otra
cepa hospedadora de E. coli.

B.6.2. Produccin industrial: factores

Peculiaridad: enzima periplsmica que sufre procesamiento postraduccional.

Sistema de fermentacin

Represin catablica: efecto

glucosa. Soluciones:

Clsico: discontinuo.
Ahora tambin discontinuo alimentado (sobre todo para
recombinante).
Uso de sustratos que no ejerzan este efecto.
Mutantes insensibles al efecto glucosa.
Enzima recombinante.

Sustratos

Extracto de levaduras (ptimo) o licor de macerado de maz.

A veces se suplementa con triptona o peptona.

Induccin

Enzima nativa: cido fenilactico.

Enzima recombinante: segn sistema de expresin.
Inducir durante trofofase.

B.6.2. Produccin industrial: factores

Temperatura

pH

Aireacin

Calcio

Presin osmtica

24-30oC.
Evitar formacin de cuerpos de inclusin.
7.0-7.5
Mantener aerobiosis.
OD > 15%.
Suplementar.
Involucrado en procesamiento.

360 mOsmol/kg.
Controlar con [NaCl].
Alta liberacin de enzima al medio.

Cuerpo de inclusin en E. coli

B.6. Penicilina acilasas

3. Uso posterior
Clsico: clulas completas (inmovilizadas o no).
Actualmente: enzima inmovilizada en soporte.
Novedoso: enzima inmovilizada por entrecruzamiento de
cristales o agregados.

4. Perspectivas de futuro
Produccin de PGA extracelular.
Recombinante: minimizar cuerpos de inclusin
Co-expresin con chaperonas.
Optimizar la induccin y el inductor.

Expresin en termfilos y en eucariotas.

Cristales de enzima entrecruzados (CLECs)

Produccin industrial de enzimas

C. ENZIMAS NOVEDOSAS

C.1. Lacasas
C.2. Celulasas

C.1. Lacasas
Aplicaciones
Decoloracin de tintes.
Procesado de zumo de fruta y otras bebidas.
Delignificacin, blanqueo de papel.
Tratamiento de aguas residuales.
Biosensores.
Aplicaciones mdicas.

Lacasas bacterianas
Intracelulares y periplasmticas
Escherichia coli y Streptomyces.
Funcin: produccin de melanina, resistencia de la cubierta de la
espora.
Ventajas: A altas T y pH mayor estabilidad y actividad.

Lacasas fngicas
Extracelulares
Basidiomicetos de raz blanca, ascomicetos, deuteromicetos y
levaduras.
Degradacin de lignina, eliminacin de xenobiticos
Ventajas:
Baja especificidad de sustrato
Utilizan oxgeno como aceptor final de electrones.

C.1.3. Produccin industrial de lacasa

Fuente de C: Efecto glucosa

Residuos agrcolas

Fuente de N: Produccin
estimulada por N, peptona,
urea

Temperatura y pH:
pH 4.5-6
T 25C en luz; 30C
oscuridad

Tipo de fermentador
Inductores: Xenobiticos,
cobre

Agitacin: provoca dao en

micelios

Oxgeno: 25%

Sumergido: micelios originan

fluido newtoniano
inmovilizacin
Slido: Mejor. Problema:
transferencia de calor y masa.

C.2.Celulasas

Celulasas

Complejo enzimtico formado por la endogluconasa, la celobiohidrolasa y la glucosidasa

Hidrolizan la celulosa hasta
productos fcilmente
degradables

Aplicaciones

Procesamiento del algodn

Produccin de bioetanol

Reciclaje de papel

C.2.2. Microorganismos para la produccin industrial de celulasas

Trichoderma
reesei
Microorganismos
productores

Hongos

Aspergillus
niger

Baja produccin de
-glucosidasa, se
soluciona
aadindola de otros
microorganismos

C.2.3. Produccin industrial de celulasas

Mejora de
cepas necesaria
debido a:
Produccin de
bioetanol

Llevada a cabo por la maquinaria celular normal de

sntesis
Fermentacin sumergida
Fermentador tipo batch
Produccin de la enzima en idiofase

Baja produccin
de -glucosidasa
por parte de T.
reesei

Secretada de manera constitutiva

C.2.3. Produccin industrial de celulasas

Fuente de carbono
Fuente de nitrgeno

Temperatura
pH
Iones metlicos
Inductor

Glucosa en baja concentracin, celulosa o materiales

lignocelulsicos
Peptona o extracto de levadura. Tambin sulfato de amonio

28-30C

Aproximadamente 4.8
Permite buen crecimiento
(NH4)2SO4,FeSO4 ,MnSO4, KH2PO4
Lactosa

C.2.4. Utilizacin posterior

C.2.5. Perspectivas de futuro
Las celulasas se suelen utilizar inmovilizadas
mediante cross-linking formando CLEAs.
La fermentacin en estado slido est
ganando fuerza los ltimos aos debido a:
T.Reesei tiene ms capacidad de
producir celulasas mediante SSF
La fermentacin en estado slido es ms
barata que la sumergida

D. BIBLIOGRAFA

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