CIPNA

UNAS
Universidad Nacional Agraria de la Selva
National Agrarian University of the Jungle

Centro de Investigacin de Productos

Naturales de la Amazona

Sntesis de Peroxinitrito (ONOO-)

I.

Principio

El peroxinitrito (ONOO-) es un poderoso oxidante producido de la reaccin entre xido ntrico

(NO) y superxido (O2-). Para su sntesis se han desarrollado varios procedimientos, de los
cuales, el mtodo Quenched-Flow es el ms utilizado. En ello, la reaccin se genera en una
solucin acidifcada de perxido de hidrgeno con nitrito de sodio (Ec.1), seguido por la
estabilizacin del producto, el cido peroxinitroso, con una base fuerte (Ec.2).
H

H2O2 + HNO2 H2O + HOONO (Ec.1)

HOONO + HO- -OONO + H2O (Ec.2)
II.
-

III.
-

IV.

Materiales
Espectrofotmetro UV/VIS.
Cuvetas de cuarzo 1 ml.
Micropipetas (1000 l, 200 l, 100 l).
Pipetas, tips.

Reactivos
Nitrito de sodio (NaNO2).
Perxido de hidrgeno al 30% (H2O2 30%).
Acido clorhdrico (HCl)
Hidrxido de potasio (KOH)
Oxido de manganeso (MnO2)

Procedimiento

1. Preparar las siguientes soluciones stock en agua destilada desionizada y pH adecuado.

Solucin I:
Agregar los siguientes reactivos en un volumen final de 20 mL.
0.6 M NaNO2
0.7 M H2O2 30%
ddH2O
Solucin II:
Preparar 20 mL de solucin como sigue:
0.6 M HCl
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ddH2O
Solucin III:
1.5 M KOH
100 mL
ddH2O
2. Colacar 10 mL de Solucin I en una jeringa de plstico 5x el volumen de la solucin. En
otra jeringa de la misma capacidad agregar Solucin II.
3. De la solucin stock 1.5 KOH, medir 20 mL y llevarlo a un beaker de capacidad 5x del
volumen aadido.
4. Bombear a presin controlada la Solucin I y Solucin II usando una bomba a difusin
constante a 25 mL/min. Ambas soluciones se mezclarn a travs de un Y junction de 2
mm de dimetro. La reaccin mezcla en contacto con la Solucin III (1.5 M KOH) genera
una solucin de color amarillo intenso, el cual indica formacin de peroxinitrito.
5. Una vez sintetizado el peroxinitrito, remover el exceso de H2O2 filtrando la solucin stock
recientemente preparada, a travs de una jeringa de plstico de volumen de 20 mL y papel
filtro (Whatman Qualitative #3) conteniendo 4 g de MnO2.
Se recomienda alicuotar la solucin stock de peroxinitrito en volmenes de 1 mL. Si la
solucin es utilizada para pruebas in vivo filtrar a 0.2 m. Luego almacenar a -20C
durante 1 semana, luego descartar toda solucin despes de la fecha. Mayor tiempo de
almacenamiento se produce una prdida en la concentracin de el peroxinitrito.

Precaucin: Debido a que algunos reactivos son txicos, corrosivos e irritantes se

recomienda el uso de guantes. Todo desperdicio lquido o slido deben ser tratados como
material txico y eliminados en envaces adecuados.

V.

Clculos

Medir la concentracin de la solucin stock de peroxinitrito recien sintetizado, agregando 10

L de solucin stock y 990 L de 1.5 M KOH en una cuveta de cuarzo (rango UV) y
determinar su absorbancia por espectrofotometra a 302 nm
El radical peroxinitrito (ONOO-) tiene su mxima absorcin en el rango ultravioleta a 302 nm
como se observa en el grfico.

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Densidad ptica

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
230

253

302

400

420

Longitud de onda, nm
-

Espectro de absorcin del radical peroxinitrito (ONOO ) entre 250 400 nm

Para obtener la concentracin de ONOO- de la solucin stock a partir de las absorbancias

obtenidas a 302 nm, se tiene la siguiente ecuacin:
= 1670 M-1cm-1

[ONOO-] = (OD302 x 100)/1670

Donde:
[ONOO-]: Concentracin de peroxinitrito en mol/L.
OD: Absorbancia de la muestra a 302 nm.
: Coeficiente de extincin de ONOODebido que la solucin de peroxinitrito es altamente basica (pH >12). En experimentos con
cultivos celulares preparar una solucin de ONOO-, agregando 1 mL de solucin stock con 9
mL de 5 mM KOH.

VI. Refencias
1. Beckman, JS., Chen, J., Ischiropoulos, H., and Crow, JP. Oxidative chemistry of
peroxynitrite. Methods Enzymol. 233:229-240; 1994.
2. Pryor, WA.., and Squadrito, GL. The chemistry of peroxynitrite: A product from the reaction
of nitric oxide with superoxide. Am. J. Physiol. 268:L699-L722; 1995.
3. Sandoval-Chacn, M., Thompson, JH., Zhang, X-J., Liu, X., Mannick, EE., SadowskaKrowicka, H., Charbonnet, RM., Clark, DA., and Miller, MJ. Antiinflammatory actions of
cats claw: the role of NF-B. Aliment. Pharmacol. Ther. 12:1279-1289; 1998.

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