Bakteri yang ditumbuhkan dalam medium agar akan membentuk suatu penampakan berupa koloni.

Koloni bakteri ini merupakan sekelompok masa sel yang dapat dilihat dengan mata langsung. Satu
koloni bakteri yang berada di dalam cawan petri/dalam medium agar adalah sama dan dianggap
semua sel yang berada dalam satu koloni tersebut adalah keturunan (progeny) satu mikroorganisme
dan karena itu mewakili sebagai biakan murni (Kusnadi, dkk, 2003). Menurut Kusnadi, dkk (2003)
penampakan koloni bakteri dalam media lempeng agar menunjukkan bentuk dan ukuran koloni yang
khas, dapat dilihat dari bentuk keseluruhan penampakan koloni, tepi dan permukaan koloni.
Dalam melakukan pengamatan morfologi koloni harus dengan baik mengamati
sifat-sifat suatu koloni. Yang disebut dengan sifat-sifat suatu koloni ialah sifatsifat yang ada sangkutpautnya dengan bentuk, susunan, permukaan,
pengkilatan, dan sebagainya. Pengamatan sifat-sifat ini dapat dilakukan dengan
pandangan biasa tanpa menggunakan mikroskop. Supaya sifat-sifaat tersebut
tampak jelas, bakteri perlu ditumbuhkan pada medium padat (Dwidjoseputro,
2005).
Dilekukqan pwarnaan negative dn polif
a. Pewarnaan Negatif
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan
prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang
sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi
mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai,
seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah
satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan
lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau
negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan
menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada
permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna.

Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram
diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Ciri-ciri bakteri gram
negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.

Pewarnaan Bakteri

11

4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada
saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, poriPraktikum selanjutnya adalah pewarnaan gram. Dalam mengidentifikasi suatu bakteri tidak hanya
dengan mengamati morfologi bakteri, tetapi juga bisa dengan pemeriksaan mikroskopis seperti
pewarnaan gram. Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk membedakan
bakteri gram positif dan gram negatif. Jika suatu bakteri diwarnai dengan teknik pewarnaan gram
menunjukkan hasil pewarnaan merah maka bakteri tersebut adalah bakteri gram negatif, sedangkan
jika diperoleh bakteri berwarna ungu maka bakteri tersebut adalah gram positif (Kusnadi, 2003).
Pelczar, (2008) menjelaskan, pewarnaan gram didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel
bakteri. Bakteri gram negatif mengandung lipid, lemak, atau substansi seperti lemak dalam

presentase lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri gram prositif. Bukti-bukti percobaan
menyarankan bahwa selama prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol (alkohol) terhadap bakteri
gram negatif menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau
permeabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu Kristal-yodium (UK-Y), yang telah
memasuki dinding sel selama waktu langkah awal dalam proses pewarnaan, dapat dapat diekstraksi.
Karena itu organisme bakteri gram negative kehilangan warna tersebut. Karena kadungan lipidnya
yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan etanol.

Perlakuan dengan melewatkan diatas api dengan perlahan-lahan supaya bakteri itu benar-benar
melekat pada kaca benda, dan dengan demikian tidak akan terhapus apabila sediaan dicuci.
Pencucian dengan alcohol berguna mengilangkan zat warna yang berlebihan. Suatu sediaan perlu
diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan
alcohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika
sediaan itu dicuci dengan air, maka jika zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli
(ungu) tidak tampak, dalam hal ini sediaan bakteri dinamakan dengan bakteri gram negative
Dwidjoseputro (2005). Komposisi dinding sel gram negative: lebih kompleks (terdapat membrane
luar yang melindungi peptidoglikan), struktur membran luar mirip membran sel dalam, membran luar
terdiri dari fosfolipid (lapisan dalam) dan lipopolisakarida (bagian luar), membran sel terdiri atas dua
lapis fosfolipid, da nada lipopolisakarida, porin (kanal).
Hastuti (2012) menyatakan bahwa pewarnaan sel bakteri secara gram merupakan salah satu prosedur
yang penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Karena kemampuannya
membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini disebut
pewarnaan diferensial. Namun, dalam praktikum yang telah dilaksanakan tidak dilakukan identifikasi
untuk menyusun klasifikasi koloni yang di amati, hanya melakukan pengamatan morfologi,
pewarnaan gram, dan pengamatan bakteri pada medium miring.
Berdasarkan hasil analisis data menunjukkan bahwa pewarnaan koloni bakteri 1
dan bakteri 2 adalah berwarna merah. Berarti koloni bakteri1 dan koloni bakteri
2 termasuk dalam bakteri gram negatif. Warna merah tersebut disebabkan
kompleks zat warna kristal violet-yodium yang sebelumnya diberikan larut ketika
pemberian larutan alkohol 90% sehingga saat diberi safranin akan memberi
warna merah pada membran sel bakteri (Lay (1994) dalam Fitri dan Yasmin,
2011).

Pada pengamatan medium cair yang berisi B.subtilis warna larutan kuning jernih
dan hanya dijumpai koloni bakteripada permukaan medium. Hal ini
membuktikan bahwa B.subtilis merupakan bakteri aerob sehingga berada
dipermukaan medium untuk memenuhi kebutuhan oksigennya. Sedangkan pada
kulturE. Colikoloni bakteri tersebar merata sehingga medium terlihat keruh. Hal
ini membuktikan bahwa bakteriE. Colimerupakan salah satu bakteri yang
bersifat fakultatif anaerob, artinya bakteri ini dapat hidup dalam keadaan
anaerob atau aerob,sehingga koloni bakteri ini dapat hidup pada permukaan
medium yang anerob maupun berada di dalam dan di dasar medium yang
bersifat anaerob(Clifton, 1958).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering
ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar
25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di
bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti
kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol
Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya
berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan

dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel
(Scetzer, 2006).
Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif. Bakteri ini
tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino.
Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk
tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan
bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli
hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia
dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan
patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik
uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air,
indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Bascillus sp. merupakan salah satu bakteri berbentuk batang (basil) yang
termasuk Gram positif karena Bascillus sp. dapat menahan zat pewarna ungu
(crystal violet) ketika dicuci dengan zat penghilang warna. Sehingga warna
tetap
ungu ketika ditetesi pewarna safranin. Pada bakteri gram postif akan
terbentuk
persenyawaan kompleks Kristal yodium-violet ribonukleat yang tidak larut
dalam
larutan pemucat alkohol karena sebagian besar dinding sel bakteri gram
positif
terdiri dari peptidoglikan. Penambahan zat pewarna safranin tidak
menyebabkan
perubahan warna pada bakteri Gram positif karena persenyawaan Kristal
violet
yodium tetap terikat pada dinding sel.
Akan tetapi pada pengamatan Bascillus sp terlihat juga bakteri dengan
bentuk berbeda yang merupakan kontaminan. Adanya kontaminan ini
kemungkinan disebabkan pada saat pemindahan isolat ke kaca objek terjadi
kontaminasi karena kurangnya pemanasan jarum ose pada saatpengambilan
biakan sehingga masih ada bakteri lain dari udara yang ikut dalam apusan
atau
telah terkontaminasinya isolat bakteri yang digunakan.

Bacillus subtilis memiliki pigmentasi koloni berwarna putih yang berbentuk koloni (form) tidak
beraturan, bertepi (ireguler), bentuk tepian luar (margin) bergelombang (undulate), ketinggian
pertumbuhan koloni

bakteri (elevasi) ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium (flat). Koloni bakteri jenis ini
datar dan ukurannya relatif besar.
Hasil pengamatan bakteri Escherichia coli kelompok 1 dan 4 sama,yaitu cirri morfologi memiliki
warna koloni kuning berbentuk koloni (form) bulat bertepi (sirkuler), bentuk tepian luar (margin) tepi
rata (entire), ketinggian pertumbuhan koloni bakteri (elevasi) mbonate yaitu Bentuk cembung,
dibagian tengah lebih menonjol dengan ukuran relative sedang. Akan tetapi hasil pengamatan
Escherichia coli kelompok 6 berbedai yaitu dengan form ireguler, margin undulate, dan elevasi
raised.
Pada media plate, diamati 3 jenis bakteri yaitu Escherichia coli, Sarcina lutea,dan pada Escherichia
coli memiliki bentuk morfologi yaitu
pigmentasi kuning, dengan bentuk koloni ireguler yaitu tidak beraturan dan
bertepi, dengan bentuk tepian luar lobate yaitu tepian berlekuk, dengan
ketinggian koloni type raised yaitu ketinggian nyata terlihat, namun rata pada
seluruh permukaan, dengan ukuran koloni yang relative sedang.
b. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan
sederhana
yaitu
pewarnaan
dengan
menggunakan
satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan
ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain
kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi
dengan
pewarnaan-pewarnaan
sederhana
karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan
pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana
ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam
tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai selsel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan
sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel
Dakurni (2014) menjelaskan, beberapa faktor yang berpengaruh terhadap
pertumbuhan mikroba yang didalamnya termasuk bakteri ialah: (1) Konsentrasi
nutrient, makin banyak bahan nutrisi yang diperlukan makin cepat pertumbuhan
mikroba; (2) pH (keasaman dan kebasaan), beberapa mikroba mempunyai sifat

pH yang berbeda-beda untuk menunjang pertumbuhannya; (3) konsentrasi air,

untuk pertumbuhan mikroba memerlukan konsentrasi yang cukup dan sangat
spesifik; (4) bahan alami, bahan alami tertentu bersifat antimikrobia, yaitu sifat
menghambat pertumbuhan mikrobia, misalnya golongan rempah-rempah; (5)
suhu, mikrobia mempunyai sifat spesifi terhadap suhu untuk pertumbuhannya;
dan (6) tekanan osmosis, mempengaruhi kestabilan dari dinding dan membrane
sel mikroba.