BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Alat
a. Beaker glass 50 ml, 100 ml, 500 ml
b. Batang pengaduk
c. Spatula
d. Pipet tetes
e. Gelas ukur 10 ml, 100 ml
f. Cawan penguap
g. Kertas saring
h. Corong
i. Erlenmeyer
j. Botol penampung
k. Vial
l. Alat maserasi
m. Alat rotavapour
n. Waterbath
o. Chamber
p. Plat KLT
q. Pipa kapiler
r. Plat KLTP
s. Serangkaian alat Kromatografi Cair Vakum
t. Spektrofotometri UV
3.2 Bahan
a. Herba sambiloto
b. Etanol
c. Etil asetat
d. Kloroform
e. n-heksan
f. Silika gel-254
g. Toluene
3.3 Prosedur
1. Penafisan Fitokimia
a. Golongan Alkoid
Serbuk simplisia dibasahkan dengan ammonia, kemudian
ditambahkan kloroform, digerus kuat-kuat. Lapisan kloroform dipipet
kemudian ditambahkan asam klorida 2 N. Campuran dikocok kuat kuatkuat hingga terdapat dua lapisan. Lapisan asam dipipet, kemudian
dibagi menjadi 3 bagian:

Bagian 1 : ditambahkan pereaksi Mayer. Terjadi 2 endapan putih

atau kekeruhan diamati. Adanya endapan putih atau kekeruhan

menunjukan kemungkinan adanya alkaloid.

Bagian 2 : ditambahkan pereaksi Dragendorf. Terjadinya endapan
jingga kuning hingga merah bata menunjukan kemungkinan adanya

alkaloid.
Bagian 3 : digunakan sebagai blanko

b. 3 gram serbuk simplisia ditambahkan dengan 50 ml aquadest, kemudian

dipanaskan di atas penangas air, lalu disaring. Filtrate dibagi menjadi 6
bagian.
Polifenolat : filtrate ditambahkan larutan perekasi FeCl 3. Adanya
senyawa fenolat ditandai dengan adanya warna hijau-biru hitam

hingga hitam.
Tanin
Bagian 1 : diteteskan larutan Gelatin 1%. Adanya senyawa tanin
ditandai dengan terjadinya endapan berwarna putih.
Bagian 2 : diteteskan larutan Steasny. Adanya senyawa tanin

ditandai dengan terjadinya endapan berwarna merah muda

Bagian 3 : sebagai blanko
Kuinon : ditambahkan larutan KOH 5%. Terbentuknya perubahan

warna kuning menunjukan adanya senyawa kuinon.

Saponin : filtrate dikocok dalam tabung reaksi, terbentuknya busa
kemudian didiamkan selama 5 menit, lalu ditambhakan HCl encer,
jika busa tetap ada maka menunjukan adanya senyawa saponin.

c. Monoterpenoid-Seskuiterpenoid dan Steroid-Triterpenoid

Serbuk simplisia digerus dengan eter, saring. Filtrate ditempatkan
dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.
Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid : residu pada cawan penguap
kemudian ditambahkan larutan Vanilin 10% dalam asam sulfat pekat.
Terjadinya warna-warna menunjukan adanya senyawa-senyawa

Monoterpenoid-Seskuiterpenoid.
Steroid-Triterpenoid : residu pada cawan penguap kemudian
ditambahkan pereaksi Liebermann-Bourchard. Terbentuknya warna

ungu menunjukan adanya senyawa triterpenoid, sedangkan warna

hijau-biru menunjukan adanya senyawa steroid.
2. Prosedur Ekstraksi
Maserasi
100 g serbuk simplisia dimasukan ke dalam tabung maserator,
diektraksi dengan etanol sampai serbuk simplisia terendam selama 24
jam, kemudian maserat dipisahkan, diupkan dan dipekatkan dengan alat
Rotavapour hingga diperoleh ekstrak kental untuk analisis lanjutan.
Residu maserasi pertama dapat diremaserasi hingga 3 kali pengulangan.

3. Prosedur Pemisahan
Ekstraksi Cair-Cair
a. 10 g ekstrak kental yang diperoleh dari hasil ekstraksi dilarutkan dalam
100 ml air (jika tidak larut dapat dilakukan pemanasan dan penambahan
etanol).
b. Dimasukan ke dalam corong pisah dan ditambahkan n-heksan dengan
jumlah yang sama banyak dengan jumlah pelarut pertama (1:1).
c. Dikocok sebanyak 5 kali dengan kocokan yang lemah dan sesekali
udara dalam corong pisah dikeluarkan.
d. Didiamkan corong pisah hingga kedua pelarut terpisah sempurna.
e. Pemisahan diulang sampai diperoleh fraksi n-heksan yang hampir tidak
berwarna (minimal 3 kali pengulangan).
f. Fraksi air dan fraksi n-heksan dipisahkan, fraksi n-heksan dikumpulkan,
diuapkan, dan dipekatkan hingga diperoleh fraksi kental n-heksan.
g. Pemisahan fraksi air dilanjutkan dengan ditambahkan fraksi etil asetat
dengan prosedur yang sama dengan pemisahan pada fraksi n-heksan.
h. Hitung persen rendemen masing-masing fraksi (n-heksan, etil asetat,
air)
4. Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Preparasi sampel
a. Siapkan 1 gram ekstrak dala bentuk kering (siliks gel-254)
b. Dimasukan ke dalam mortar
c. Digerus ad homogen dan ditimbang hasil gerusan
Preparasi kolom
a. Ditimbang silika gel dengan perbandingan 1:10 (optimal, sesuaikan
dengan volume maksimal kolom
b. Kolom kromstografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar
diperolrh kerapatan kemasan maksimum
c. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah (kloroform)
dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakum lagi
d. Kolom dihisap sampai kering
e. Dilapisi permukaan atas kolom dengan kertas saring
f. Ditambahkan sampel yang telah disiapkan ke dalam kolom, kemudian
divakum kembali untuk mendapatkan kerapatan maksimal
Prosedur Kromatografi
a. Digunakan sistem eluen gradient.

b. Kolom dielusi dengan eluen yang cocok (kloroform : etil asetat ),

dimulai dengan kepolaran rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahanlahan.
c. Kolom dihisap sampai kering pada setiap volume eluen.
d. Hasil kolom dikumpulkan per sub-fraksinya, diuapakan, dan dianalisis
menggunakan silika gel.
5. Kromatografi Lapis Tipis
Penjenuhan pengembang (fasa gerak)
a. Disiapkan chamber dan pelarut atau campuran pelarut yang digunakan
sebagai fasa gerak.
b. Dimasukan 5 ml pelarut atau campuran pelarut ke dalam chamber.
c. Dibiarkan (dijenuhkan) selama 30 menit
Penotolan sub-fraksi pada plat KLT
a. Sub-fraksi yang akan dipisahkan, dilarutkan ke dalam pelarut yang
sesuai.
b. Ditotolkan berupa bercak pada batas bawah pelat yang telah ditandai
dengan menggunakan pipa kapiler.
c. Dibiarkan pelarut pada bercak menguap
Elusi
a. Pelat KLT dimasukan ke dalam yang telah dijenuhkan.
b. Dibiarkan proses elusi berlangsung sampai batas atas
c. Diangkat pelat setelah proses elusi mencapai atas dan biarkan
mongering.
d. Dihitung Rf bercak pada lapisan secara visual, UV-254 nm, dan
disemprot penampak bercak.
6. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pembuatan Pelat silika gel-254 (fasa diam).
a. Dibersihkan pelat kaca (20x20 cm) dengan aseton dan tempatkan pada
alat Desaga.
b. Dibuat bubur silika gel dengan mencampurkan silika gel 60 sebanyak
20 gram dengan 50 ml aquadest, kocok kuat dalam erlenmeyer
berpenutup (90 detik) hingga homogen.
c. Dituangkan semua bubur silika ke dalam alat, kemudian segeraa
diratakan pada kaca.
d. Didiamkan silika pada suhu ruang selama 24 jam.
e. Sebelum pemakaian, pelat dioven pada suhu 106 0C selama 30-60
menit.

Penjenuhan pengembang (fasa gerak)

a. Disiapkan chamber dan pelarut atau campuran pelarut yang
digunakan sebagai fasa gerak.
b. Dimasukan 20 ml pelarut atau campuran pelarut ke dalam chamber.
c. Dibiarkan selam 60 menit sebagai proses penjenuhan
Penotolan pelat silika gel
a. Dilarutkan sejumlah fraksi dengan pelarut yang cocok.
b. Ditotolkan fraksi secara berderet sehingga membentuk pita sebagai
garis awal pengembang (1-2 cm dari ujung bawah).
c. Ditunggu hingga kering beberapa saat
Elusi
a. Dimasukan pelat ke dalam chamber yang telah jenuh dengan larutan
pengembang.
b. Dibiarkan hingga proses elusi mencapai batas atas pelat.
c. Dikeluarkan pelat dari chamber dan biarkan mongering.
d. Dikerok pita yang terbentuk dan saring hasil kerokan dengan pelarut
yang cocok atau eluen yang digunakan.
e. Diuapkan filtrate.