Jin 2016 Preparação de Hidrolisados - de Proteína Antioxidante Milho, Purificação e Avaliação de Três Peptídeos Antioxidantes Milho Novos

23/11/2016
Preparaodehidrolisadosdeprotenaantioxidantemilho,purificaoeavaliaodetrspeptdeosantioxidantesmilhonovos
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2016, Food Chemistry
Volume204,01deagostode2016,Pages427436
Mais
Isolamento, purificao e caracterizao

2016, Food Chemistry
Preparaodehidrolisadosdeprotenaantioxidantemilho,
purificaoeavaliaodetrspeptdeosantioxidantesmilho
novos
DuxinJin,XiaolanLiu
,XiQunZheng
,XiaoJieWang,JunfangEle
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http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.02.119
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Preparao e identificao de peptdeos

2016, Journal of Functional Foods
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Destaques
protenademilhocatalisadapelaAlcalase+Flavourzymeapresentoumelhor
atividadeantioxidante.
peptdeosdemilhoforampurificadoseforamidentificadoscomoCSQAPLA,
YPKLAPNEeYPQLLPNE.
CSQAPLAexibiuexcelentescapacidadesdeeliminaoderadicaisepoder
redutor.
Abstrato
Gltendemilhoumcoprodutoprincipaldomilhomoagemmida.Farinhademilho
gltenfoihidrolisadacomAlcalase,Flavourzyme,Alcalase+Flavourzymee
Flavourzyme+Alcalase.Naconcentraodesubstratode10%,hidrolisadodeprotena
demilhocatalisadaporAlcalasetinhaumgraudehidrlisede17,83%,quefoimais
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814616302886
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elevadadoquepeloFlavourzyme(3,65%).OhidrolisadocatalisadapelaAlcalase+
Flavourzymeexibirammelhoresatividadesantioxidantesefoiaindamaispurificado.
Trsnovospptidosantioxidantesforampurificadosporumasriedetcnicas
cromatogrficas.AssequnciasdostrspptidosforamidentificadoscomoCysSer
GlnAlaProLeuAla,TyrProLysLeuAlaProAsnGlueTyrProGlnLeuLeuPro
AsnGlu,respectivamente.Entreostrspeptdeos,CysSerGlnAlaProLeuAlaexibiu
boascapacidadesdepoderredutoreexcelenteeliminadorasderadicaisDPPHradical
aniosuperxidoe,comIC50Osvaloresde0,116e0,39mg/ml,respectivamente.Os
resultadosdonossoestudoindicampotnciaantioxidantedehidrolisadosdeprotena
demilhoeospptidosseparadosapartirdefarinhadegltendemilhoepode
proporcionarumacompreensobsicaparaaaplicaodehidrolisadosdeprotenade
milhocomoantioxidantesnaturais.
abreviaturas
CGM,gltendemilhoCPH,hidrolisadosdeprotenademilhoA+F,Alcalase+
FlavourzymeF+A,FlavourzymeAlcalase+DH,graudehidrliseRPC,
cromatografiadefasereversa
Palavraschave
GltendemilhohidrlisePropriedadeantioxidanteApurificaopeptdeos
1.Introduo
Osradicaislivressogeradosatravsdereaesfisiolgicasnormaisdentrodocorpo(
Sarmadi&Ismail,2010).Aproduoexcessivaderadicaislivrespodecausarefeitos
deletriossobreasmembranas,protenaseADNemhumanos(Yongvanit,Pinlaor,&
Bartsch,2012),quepodeminiciarmaisumasriededoenascrnicas,taiscomoo
envelhecimento,cancro,doenascardiovasculareseoutrasdoenas(Johansenetal.,
2005eMaulikeKumar,2012).Nosltimosanos,oshidrolisadosdeprotenas
antioxidantesoupptidosdeprotenasdeplantaseanimaisforamobtidosparaextinguir
osradicaislivres,inactivarosintermediriosreactivosequelarosmetaisdetransio
proxidativas(Shen,Chahal,Majumder,Ti,eWu,2010),todosdosquaisso
conduzidosporestresseoxidativo.Emvistadosefeitostxicospotenciaisdos
antioxidantessintticostaiscomohydroxylanisolebutilado(BHA),hydroxyltoluene
butilado(BHT)etercbutilhidroquinona(TBHQ),etc.,sobreasadehumana,a
utilizaodestassubstnciasqumicastemestadosoblimitaoestrita(Qian,Jung,
Byun,&Kim,2008).Antioxidantesapartirdefontesvegetaiseanimaisnaturaistm
potenciaisefeitosbenficosdevidoaoseubaixopesomolecular,fcilabsoroeefeitos
colateraispoucoounenhumaocorpohumanoe,portanto,tmatradointeresse
crescente(Sarmadi&Ismail,2010).
Ainvestigaotemsidofocadaemhidrolisadosdeprotenascomoantioxidantes
naturais.Oshidrolisadosdeprotenaspodemserpreparadosportratamentocom
cidos,enzimasefermentao.difcilcontrolarascondiesdehidrlisecidade
protenaeosaminocidoshidrolisadospodemserdecompostosenquanto,a
fermentaoconsideradoasermenoseficientes.Hojeemdia,ahidrliseenzimtica
aformapredominanteparaproduzirhidrolisadosdeprotenasbioactivos,devidossuas
condiesmoderadasenenhumdanoaosaminocidos(Wang&GonzalezdeMeija,
2005).Muitosestudostmrelatadoasatividadesantioxidantesdoshidrolisadosde
origemvegetal,comosoja(Park,Lee,Baek,&Lee,2010),canola(Pan,Jiang,ePan
de2009),folhadealfafa(Xie,Huang,Xu,&Jin,2008),canola(Alashietal.,2014),
farinhadegltendemilho(Lietal.,2010eZhengetal.,2006),bemcomoapartirde
fontesanimais,taiscomoasprotenasdoleitedecabra(deGobba,EspejoCarpio,
Skibsted,eOtte,2014),frango(Onuh,Girgih,Aluko,&Alianide2014),aprotenada
claradoovo(Huang,Majumder,eWu,2010)epeixe(Nalinanon,Benjakul,Kishimura,
eShahidide2011).
Refeiodegltendemilho(CGM)umcoprodutoprincipaldomilhomoagemporvia
hmida,contendocercade6271%(w/w)deprotena.NaChina,estimasequecerca
de215,5megatonsdemilhofoiproduzidonoano20142015(www.igc.int/en/grainsupd
ate/sd.aspx?Crop=Maize),dosquaiscercade20megatonsdeCGMteriasidogerado
considerando15%domilhofoiutilizadoparaaproduodeamido.Protenademilho
estestritamentelimitadosnaaplicaodevidossuascaractersticasdeinsolubilidade
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emgua,quepodemsermelhoradaspormeiodehidrliseenzimtica(Liuetal.,2015
eWangetal.,2014).
Ainvestigaosobreassequnciasdepptidosantioxidantesmilhoindispensvel
paraproporcionarumamelhorcompreensodarelaoestruturaactividade.No
entanto,apenasalgumassequnciasdepptidosantioxidantesmilhotmsido
relatadasanteriormente(TangeZhuang,2014,Tangetal.,2010,Wangetal.,2014,Xu
etal.,2004,Zhengetal.,2006,Zhuangetal.,2013eZhuangetal.,2013).Almdisso,
aidentificaodepptidosantioxidantespodemproporcionarummodelodeestrutura
paraaproduodecompostosfarmacologicamenteactivos.Assim,aobtenodemais
informaessobreaestruturaeaspropriedadesantioxidantesdospptidosdemilho
essencial.
Nopresenteestudo,AlcalaseeFlavourzymeforamusadasparahidrolisarCGMparaa
preparaodoCPH,comactividadeantioxidante.antioxidantespptidosforam
purificadosapartirdeCPHporultrafiltrao,deumasriedecolunasdecromatografia
eforamcaracterizadosporQTOF2.actividadesantioxidantesdospptidos
identificadosdemilhoforamavaliadasearelaoestruturaactividadefoianalisada.
2.Materiaisemtodos
2.1.materiais
CGMfoicompradodeZhongliangenergiabioqumicaCo.,Ltd.(Heilongjiang,China).
ProteaseAlcalase(2,04x105U/ml)eFlavourzyme(1,35x104U/g)foramadquiridos
apartirdeNovoNordiskCo.,Ltd.(Bagsvaerd,Dinamarca).Umpesomolecular6kDa
cortada(MWCO)demembranaultrafiltraofoicompradodeTianjinMotimo
TechnologyCo.(Tianjin,China),Ltd..Meioscromatogrficos,taiscomoQSepharose
FFeSephadexG25foramadquiridosdaGEHealthcare(Pittsburgh,PA,EUA).
ProntosilC18aceEPSeXselectCSH130C18colunasforamadquiridosaUnimicro
(Xangai,China)eWatersTechnologiesCo.,Ltd.(Milford,Massachusetts,EUA),
respectivamente.AglutationareduzidaeDPPHforamadquiridosaSigmaChemicalCo.
(St.Louis,MO,EUA).Todososoutrosprodutosqumicoseramdegrauanaltico.
2.2.AhidrliseenzimticadaCGM
CGMfoiprtratadapormtodosderemoodeextrusoeamido(Zhengetal.,2006).
CGMprtratada(10g)foidissolvidoem100mldeguadestiladaecolocadasnum
agitadormagnticoduranteamisturauniforme.Osseguintesproteasesforamutilizados
nasreaces:Alcalase,Flavourzyme,Alcalase+Flavourzyme(A+M)+eFlavourzyme
Alcalase(M+A).AreacocatalisadaporAlcalasefoilevadaacaboaumatemperatura
de50C,pH7,7,E:Sde2%(v/w)etempodereacode75min.Ascondiesde
reacoparaFlavourzymeforamde53C,pH6,4,E:S5%(w/w)e50min.Paraa
hidrlisecatalisadaporduasproteasessequencialmente,aCGMprtratadofoi
hidrolisadoemprimeirolugarcomumaprotease(AlcalaseouFlavourzyme)em
condiesdereacoadequadas,e,emseguida,ascondiesdereacoforam
ajustadasantesdaadiodasegundaprotease.Apsareaco,ahidrlisefoi
terminadaporebulioa100Cdurante5min.Ograudehidrlise(DH)eoteorde
protenasolveldoCPHforamdeterminadospelomtododepHstatemtodode
Lowry,respectivamente(Jens,1986eLowryetal.,1951).Oshidrolisadosforamento
centrifugadasa4000gdurante15min,osobrenadanteobtidofoirecolhidoparaa
purificaodepptidosantioxidanteseliofilizadaparaaavaliaodaactividade
antioxidante.
2.3.PurificaodepptidosdeCPHantioxidantes
CPHfoifiltradoutilizandoumamembranadeultrafiltraodecortede6kDaMW.O
permeado(<6kDa)foireunidaseaplicadasnumacolunadeQSepharoseFastFlow
(1,6x30cm),quefoianteriormenteequilibradacom20mMdetampoTrisHCl(pH8,5).
Acolunafoilavadacomomesmotampoeospptidosligadosforameluidoscomum
gradientelineardeNaClvariandode0a1Maumataxadefluxode2ml/minaqualfoi
monitorizadaa214nm.Asfracesdospicosforamrecolhidaseasuaactividadede
eliminaoderadicaisDPPHforammedidos.Asfracesactivasforamreunidas,
liofilizadas,edissolveusenovamenteemguadesionizada(2mg/ml).Aamostrafoi
carregadanumacolunadeSephadexG25(1,6x100cm)eeluidacomgua
desionizadaaumataxadefluxode2ml/minemonitorizadaa214nm.Afracoactiva
foiseparadaporcromatografiaemfasereversa(RPC)decoluna,ProntosilC18ace
EPS,utilizandoumgradientelineardeacetonitriloa2%contendo0,065%deTFAa80%
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deacetonitrilocontendo0,05%TFAem60minaumcaudalde1,5ml/min.Asfraces
quemostramumaelevadaactividadedeeliminaoderadicaisDPPHforamainda
purificadosporumacolunadeRPCanalticachamadoXselectCSH130(4,6x150
mm,3,5um)comumcaudalde1ml/mincomumgradientelineardeacetonitriloa2%
contendo0,065%deTFAaacetonitriloa20%contendo0,05%deTFAem35min,20%
deacetonitrilo(0,05%deTFA)at80%deacetonitrilo(0,05%deTFA)em10min,80%
deacetonitrilo(0,05%deTFA)a%deacetonitrilo2(0,065%deTFA)em10min
sequencialmente.Asfracesactivasforamrecolhidas,liofilizadaseenviadoparaa
sequenciao.
2.4.Identificaodepptidosantioxidantesmilho
Paraaidentificaodesequncias,ospptidospurificadosforamsujeitosaum
espectrmetrodemassaQTOF2juntamentecomumafontedeionizaopor
electrospray(ESI)noCentroNacionaldeBiomedicalAnalysis(Pequim,China).
2.5.Sntesedepptidosantioxidantesmilho
Ospptidosantioxidantesmilhoidentificadosforamsintetizadospelomtododefase
slidautilizandoomtododeFMOCemBootechBiocincia&TecnologiaCo.(Xangai,
China),Ltd..OspptidossintetizadosforampurificadosporHPLCnumaVYDACC18de
coluna(4,6x250mm,5um)comumcaudalde1ml/min.Ogradientelinearde80%de
acetonitrilocontendo0,1%decidotrifluoroacticoa10%deacetonitrilocontendo0,1%
decidotrifluoroactico(solventeB)durante20min,emseguida,90%desolventeBa
100%desolventeBdurante5min,emseguida100%desolventeBa100%degua
contendo0,1%decidotrifluoroacticodurante5min.Apurezadospptidos
sintetizadosfoide99%.
2.6.Determinaodasactividadesantioxidante
2.6.1.atividadesequestradoraderadicaisDPPH
AtividadesequestradoraderadicaisDPPHfoimedidadeacordocomomtodode
MemarpoorYazdi,Mahaki,eZareZardini(2013)compequenasmodificaes.CPH
pptidoouantioxidante(0,8ml)foimisturadocom2,4mldemetanole0,8mldeDPPH
(0,15mM)emmetanol.Amisturafoiimediatamentemisturadaeincubadanoescuro
durante30min.Aabsorvnciadasoluoresultantefoimedidaa517nm.Aamostrade
controlocontinha3,2mldemetanole0,8mldeDPPH.GSHecidoascrbicoforam
utilizadoscomocontrolospositivos.ActividadedeeliminaoderadicaisDPPHfoi
calculadocomo[1As/AC]x100%.UmseAcrepresentaaabsorvnciadaamostrae
decontrolo,respectivamente.
2.6.2.Fe2+capacidadequelante
Fe2+actividadequelantefoimedidapelomtododescritoporHeetai.(2012)com
ligeirasmodificaes.CPHpptidoouantioxidante(1ml)foiprmisturadacom0,05ml
deumasoluodesulfatoferroso(2mM),emseguidaadicionouseemisturouse
vigorosamente1,85mldeguadestilada.Emseguida,foiadicionado0,1mldesoluo
ferrozina(5mM),misturadaseincubadastemperaturaambientedurante10min.Aps
aincubao,aabsorvnciadasoluofinalfoideterminadaa562nm.Aguadestilada
foiutilizadocomocontrolo.Acapacidadequelantefoicalculadacomo[1As/AC]x
100%.UmseAcrepresentaaabsorvnciadaamostraedecontrolo,respectivamente.
2.6.3.reduodapotncia
ReduzindoapotnciafoideterminadadeacordocomomtododeHeetal.(2012)com
pequenasmodificaes.CPHpptidoouantioxidante(2ml)foimisturadacom2mlde
tampodefosfato0,2M(pH6,6)e2mlde1%(w/v)deferricianetodepotssio.A
misturafoiincubadanumbanhodeguaa50Cdurante20min.Depois,2mlde10%
(w/v)decidotricloroacticofoiadicionadomisturaecentrifugousea4000g
durante10min.Osobrenadante(2ml)foimisturadacom2mldeguadestiladae0,4ml
de0,1%(w/v)detricloretofrrico.Apsagitaovigorosa,amisturafoicolocadanum
banhodeguaa50Cdurante10min.Aabsorvnciadasoluofoimedidaa700nm.
Umvolumeequivalentedeguadestiladafoiusadacomoobranco.GSHecido
ascrbicoforamutilizadoscomocontrolospositivos.
2.6.4.atividadesequestradoraderadicaishidroxila
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Aactividadedeeliminaoderadicaishidroxilofoimedidadeacordocomomtodode
Zhuangetai.(2013)comalgumasmodificaes.CPHpptidoouantioxidante(2ml)foi
misturadacomcidosaliclico0,5mlde9mm,0,5mldesulfatoferroso9mme6,5mlde
guadestilada,emisturousevigorosamente.Emseguida,0,5mlde8,8mMdeH2O2
foiadicionadasoluoeincubousea37Cdurante30min.Aabsorvnciafoi
determinadaa510nm.Parabranco,2mldeguadestiladafoiadicionadamistura,em
vezdaamostra.Umvolumeequivalentedeguadestiladafoiusadoemvezdesulfato
ferrosocomoum0.GSHfoiutilizadocomocontrolopositivo.Actividadedeeliminao
deradicaishidroxilofoicalculadacomo[1(AsA0)/Ab].100%Umsa
absorvnciadaamostra,A0aabsorvnciadaamostrasemsulfatoferroso,eumb
absorvnciadobranco.
2.6.5.atividadesequestradoraderadicaisnionsuperxido
Atividadesequestradoraderadicaisnionsuperxidofoimedidautilizandoomtodo
pyrogallolautooxidaocomalgumasmodificaes(Xia,Bamdad,Ganzle,&Chen,
2012).Resumidamente,1,6mldeamostrafoimisturadacomumvolumeigualde
tampoTris50mMHCl(pH8,3).Amisturafoiincubadanumbanhodeguaa25C
durante20min,emseguida,0,8mlde1,5mMfoiadicionadocidopiroglico.A
absorvnciadamisturafoimedidaa320nmacada30sdurante5min.Paraplaca,1,6
mldetampoTrisHClfoiutilizadoemvezdaamostra.OcidoascrbicoeaGSHforam
utilizadoscomocontrolospositivos.Atividadesequestradoraderadicaisnion
superxidofoicalculadacomo[1OD s /OD b]100% .OD s eOD b
representaminclinaodalinhadeabsorodeamostraeinclinaodalinhade
absoroparaobranco.
2.7.Analiseestatistica
Todososexperimentosforamrealizadosemtriplicado,etodososresultadosforam
expressoscomoamdiadesviopadroeforamanalisadoscomosoftwareSPSS
19.0.Onewayanlisedevarincia(ANOVA)foiutilizadaparaanalisardadosemltiplos
testesalcancedeDuncanforamconduzidosparadeterminardiferenasentreas
mdias.Diferenassignificativasforamaceitosemp<0,05.
3.Resultados
3.1.AhidrliseenzimticadaCGM
Ograudehidrlise(DH),teordeprotenasolveleactividadesantioxidantesdos
hidrolisadosdeprotenademilho(CPH),preparadopeloAlcalase,Flavourzyme,A+Fe
F+Asinergiaforaminvestigadosnesteestudo(Fig.1eTabela1).Osnossos
resultadosindicamqueaprotelisemaiseficazdaCGMfoiobtidonareacocatalisada
porduasenzimassequencialmente.ComomostradonaFig.1,oDHdeCGM
hidrolisadoporA+Faumentonainicial85minesemanteveestvelparaosrestantes
40min,enquantoDHdaCGMcatalisadaporF+Amanteveumatendnciadeaumento
suaveduranteainicialde50min,masaumentourapidamentedepoisaadiode
Alcalase.Almdisso,oteordeprotenasolveldoCPHpreparadoporA+Ffoiamais
elevadacomumvalorde45,440,24mg/ml(Tabela1).Osresultadosmostraramque
aCGMfoihidrolisadomaisminuciosamenteporA+Fdoqueinvertendoaordemde
hidrlise.Umresultadosemelhantefoitambmobservadaparaaproteadecanola,que
foicatalisadaporAlcalaseeseguidodeFlavourzymecomumvalorDHde18,9%(
Cumby,Zhong,Naczk,&Shahidi,2008).
FIG.1.
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DHdoCPHcatalisadaporA+FeF+Asinergiaduranteahidrlise.
Figuraopes
Tabela1.
Graudehidrlise,teordeprotenasolveleantioxidantedehidrolisadosdeprotenademilhopor
Alcalase,Flavourzymeedoisenzimasinergicamente.A
protease
Tempo
de
reaco
(min)
DH
(%)
Alcalase(A)
75
17,825
0,332
Flavourzyme
(F)
50
F+A
A+F
teorde
protena
solvel
(mg/
ml)
AtividadesantioxidantesB
atividade
sequestradora
deradicais
DPPH(%)
Fe2+
actividade
quelante
(%)
reduo
da
potncia
atividade
sequestradora
deradicais
hidroxila(%)
atividade
sequestradora
deradicais
nion
superxido
(%)
37,76
0,44
46,550,65b
78,80
0,37c
0,432
0,009um
42,320,35b
41,120,83
3,648
0,004
6,96
0,00
29,151,08a
55,60
0,30b
0,464
0,007b
39,200,18a
26,211,54
50+75
12,315
0,007
39,16
0,14
55,640,65c
89,58
0,07d
0,506
0,006c
50,310,35c
44,811,78
75+50
21,028
0,004
45,44
0,24
75,640,22d
25,86
0,30um
0,628
0,002d
63,050,71d
53,770,47
um
UMA OsdadossoexpressoscomomdiaSD(n=3).Osvaloresnamesmacolunaseguidospela
letradiferentesosignificativamentediferentesaP<0,05.
B actividadesantioxidantesforamdeterminadasparaumaconcentraodeamostrade5,0mg/ml.
opesdetabela
AsatividadesantioxidantesdoCPHparalimpezaDPPHradical,radicalhidroxila,radical
superxidoequelanteFe2+forammedidos(Tabela1).TodosCPHhidrolisadopela
Alcalase,Flavourzyme,A+FeF+Asinergiaexibiramactividadesantioxidantescom
umadiferenasignificativa(p<0,05),ecatliseporduasproteasesexpostas
sequencialmentemelhoresactividadesantioxidantesdoqueosdeumaprotease.
VarrimentovaloresdeDPPHradical,hidroxilonionradical,radicalsuperxidoe
reduzindoapotnciadoCPHcatalisadaporA+Fforam75,64%0,22,63,05%0,71,
53,77%0,47e0,6280,002,respectivamente,queforamsignificativamentemaiores
queosdeumaproteaseeF+A.Noentanto,Fe2+capacidadequelantedoCPH
catalisadapora+Fera25,86%0,30,quefoimenordoqueosdeumaproteaseeF+
A.Osresultadospodemserdevidosaaminocidoecomposioconformao
peptdicadoshidrolisados.
3.2.Purificaodepptidosdemilhoantioxidativas
CPHfoifraccionadoemprimeirolugarporumamembranadeultrafiltraode6kDa,e
duasfracesdePM,osquaisforamreferidoscomoCPHI(permeado<6kDa)eCPHII
(retentado>6kDa),foramobtidas.Nohouvepraticamentenenhumadiferenano
DPPHvaloresdeeliminaoderadicaisdeCPH,CPHIeCPHII(dadosno
mostrados).Umavezqueospptidosdebaixopesomolecularpodemserfacilmente
absorvidasemcomparaocompptidosdeelevadopesomolecular(Kouetai.,2013
eSuetsunaetal.,2000),CPHIfoisubmetidoaqualquerpurificaoadicional.
CPHIfoipurificadaporQSepharoseFF,queresultouemtrsfraces(I,IIeIII),deque
afracoIeranoligado,easoutrasduasfracesforamligados(Fig.2(A)).Como
mostradonaFig.2(A),detodasastrsfraces,apenasafracoIIeraactivocomum
valordeeliminaoderadicaisDPPHde56,2%.Assim,afracoIIfoirecolhidoe
liofilizadoparaaprximaetapadepurificao.
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FIG.2.
(A)perfildeeluiodoCPHIemQSepharoseFastFlow(1,6x30cm).Ospptidosligadosforameludos
com20mMdetampoTrisHCl(pH8,5)contendo01MNaClaumataxadefluxode2ml/min.As
fracesdospicosforamrecolhidasde6ml/tubo.(B)perfildeeluiodafracoIIcarregadoem
SephadexG25decoluna(1,6x100cm).Ospptidosforameludoscomguadesionizadaaumataxade
fluxode2ml/min.Asfracesdospicosforamrecolhidasde6ml/tubo.(C)perfildeeluiodafraco
II1carregadoemumProntosilC18colunaAceEPS(10250mm,10um).Ospptidosforameludos
comumgradientelineardeacetonitrilo(280%)durante60minaumcaudalde1,5ml/min.Asfraces
dopicoforamcoletadasem3ml/tubo.(D)perfildeeluiodafraco11carregadasobreumacolunade
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XselectCSH130analtica.Perfil(E)eluiodafraco13carregadasobreumacolunadeXselect
CSH130analtica.
Figuraopes
FracoIIseparadadacolunaaninicafoicarregadonumacolunaSephadexG25para
dessalinizaocolunaeprestimativadopesomoleculardefracesactivas.Duas
fracesdepico(II1eII2)forameludosapartirdacolunadefiltraoemgel,eII1foi
aprincipalfracoactivacomumDPPHvalordeeliminaoderadicaisde42,78%a1
mg/mleumpesomoleculardecercade800Da(Fig.2(B)).Ocomponenteprincipalde
II2foiinferidocomosal(comoerapbrancoapsliofilizao)eexibiubaixaactividade
deeliminaoderadicaisDPPHquandoredissolvidoemguaa1mg/ml.
FracoII1foi,ento,purificadoporRPHPLC.Muitosantioxidantesfraceseludasa
partirdacolunadeRPC(Fig.2(C)),apartirdoqual,fraco11e13,comvaloresde
eliminaoderadicaisDPPHde32.43%e31.66%,respectivamente,foram
seleccionadasparaposteriorpurificaoeliofilizado.
Asfracesactivas,11e13foramaindapurificadosporumXselectanalticoTMcoluna
CSH130.Duasfracesactivas(11IIIe11VI)forameludasdacolunacomactividades
deeliminaoderadicaisDPPHde33.02%e42.59%,respectivamente(Fig.2(D)).
Enquantoisso,umafracoactiva(13V)comumaactividadedeeliminaoderadicais
DPPHde44,19%foieludaapartirdacolunaanaltica(Fig.2(e)).Estastrsfraces
foramrecolhidasparadeterminarassequnciasdeaminocidos.
3.3.identificaodasequncia
Paraidentificarassequnciasdepptidosantioxidantes,foiaplicadaQTOF2acoplado
comESI.Asseqnciasdetrsfraces(11III,11VIe13V)quesesepararamapartir
defraces11e13foramobtidos.Oespectrodemassadetrspptidosso
apresentadosnaFig.3,11IIIfoiidentificadacomoCysSerGlnAlaProLeuAla
(CSQAPLA,denominadopptido1),deformacorrespondente11VIfoiTyrProLys
LeuAlaProAsnGlu(YPKLAPNE,nomeadocomoopptido2)e13VfoiTyrProGln
LeuLeuProAsnGlu(YPQLLPNE,denominadopptido3).Quandoassequncias
foramcomparadascomabasededadosSWISSPROTnoNCBI,CSQAPLAverificou
seserde2632aminocidoslocalizadosemAAA33539.1deGenBank,masnoh
domniosconservadosputativosforamdetectadospormaisdoispptidos.Assim,os
pptidosobtidosnesteestudosonovospptidos.
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FIG.3.
espectrodemassaQTOF2dasfracesactivasdeRPHPLC.(A)11III(B)11VI(C)13V.
Figuraopes
3.4.Avaliaodeactividadesantioxidantesdospptidossintetizados
3.4.1.DPPHcapacidadedeeliminaoderadicais
Ostrspptidossintetizadosapresentaramumarelaodependentedadose(Fig.4
(A)).Pptido1exibiuumaumentodaactividadedeeliminaoderadicaisDPPHdoque
adosoutrosdoispptidos.IC50valoresdeumpptidoeopptido3foram0,116mg/ml
e0,34mg/ml,respectivamente.Noentanto,opptido2mostrouumafracacapacidade
deeliminaoderadicaisDPPH(nomaisdoque25%)aumaconcentraode00,4
mg/ml.OvalordepptidoumaactividadefoiquaseigualdeGSHeocidoascrbico,
quandoasuaconcentraofoiigualousuperiora0,25mg/ml,enquantoqueas
actividadesdeDPPHdeeliminaoderadicaisdepptido2eopptido3erammuito
maisbaixosdoqueadaGSHeascrbicocido.Assim,oPptido1podeser
consideradacomoumbomcaptadorderadicaisDPPH.
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FIG.4.
atividadesantioxidantesdostrspeptdeossintticos.(A)AactividadedeeliminaoderadicaisDPPH
(B)nionsuperxidoatividadesequestradoraderadicais(C)areduodapotncia.AscrbicoeaGSH
foramutilizadoscomocontrolospositivos.
Figuraopes
3.4.2.nionsuperxidocapacidadedeeliminaoderadicais
Superxidoanioactividadedeeliminaoderadicaisdostrspptidossintetizados
nesteestudofoiavaliadaa04mg/ml.ComomostradonaFig.4(B),oaniosuperxido
radicaisactividadesdeeliminaodestastrspptidosforamdependenteda
concentrao.Pptido1apresentaramummaiorvalordeeliminaoderadicaisde
aniessuperxido(IC50valorfoide0,39mg/ml)doqueadosoutrosdoispptidos.
Quandoaconcentraofoiigualoumaiordoque2mg/mL,opptido1mostrouum
aniosuperxidovalordeeliminaoderadicaisequivalenteemcomparaocomo
cidoascrbicoedeGSH.Pptido2eopptido3exibiuumaconcentraomodesto
aumentodependentetendnciaparaeliminaoderadicaissuperxidoanio,que
foram47,45%e49,78%,respectivamente,a3mg/ml.Assim,opptido1podeseruma
boanionsuperxidolimpadorradical.
3.4.3.reduodapotncia
Reduzindopotnciasdostrspptidossintetizadosforammedidosa00,8mg/mleos
resultadossomostradosnaFig.4(C).Todosostrspeptdeosexibidacadavezmaior
tendnciaparaareduodapotncia.Reduzindopoderesdepptido1,pptido2e3
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forampptido0,616,0,1195e0,215,respectivamente,a0,5mg/ml.Podeservistoque
opptido1possuaumbompoderredutor,oqualfoicercademetadedovalordaGSH
em0,050,8mg/ml.Pptido1podeseraplicadocomoumdoadordeelectres.
4.Discusso
CGMapresentafracasolubilidadeemguaporqueasuacomposioimportante
protenazena(65%(w/w))eglutelina(30%(w/w))(DombrinkKurtzman,1993eLiu
etal.,2015).SeasolubilidadeemguadaCGMpoderiasermelhorado,emcerta
medida,CGMpodeterumaamplagamadeaplicaesnasindstriasalimentare
farmacutica.Proteliseenzimticaamplamenteaplicadoparamelhorarassuas
propriedadesfuncionaiseprotenahidrolisadaamplamenteutilizadoparaalimentao
especialefuncionalidade(Moure,Domnguez,&Parajode2005).
CGMcompostadecomponentesproteicosdiversedincluindozena,glutelina,
albuminaseglobulinas,porconseguinte,apreparaoeficazdoshidrolisadosCGM
requerproteasescomespecificidadevasta.AlcalaseumaendopeptidasedeBacillus
licheniformiscomsubtilisinaCarlsbergcomoumimportantecomponenteenzimtico,e
temprefernciaporresduosnocarregadosgrandes(Liuetal.,2015).Flavourzyme,
fermentadoapartirdeAspergillusoryzae,umendoeexopeptidase(Changetal.,
2007eLiuetal.,2015).Nopresenteestudo,AlcalaseeFlavourzymeforamescolhidos
parahidrolisarCGMparaaproduodehidrolisadosdeantioxidantes.Maisextensa
hidrliseatravsdeumacombinaodeA+M,emcomparaocomadeF+A(Fig.1)
revelouqueFlavourzymeefectivamentehidrolisadoospptidosresiduaisresultantesda
acodeAlcalasedesdeFlavourzymepodehidrolisarambosligaesterminaisede
pptidointerno,equeaAlcalasecontinuouaprotelisesobasmesmascondiesde
Flavourzyme.Alcalasemostroumenosdehidrlisesobreospptidosresiduais
resultantesdaacodeFlavourzyme,ouostiocatalticodeAlcalaseemCPHreduzida
apsproteliseporFlavourzyme.Kouetai.(2013)tambmsugeriramqueaeficciade
hidrliseporA+FresultoudaprdigestocomAlcalasequeaumentouonmerode
locaisdeNterminal,facilitando,assim,ahidrlisedealbuminadegropor
Flavourzyme.MelhorefeitodehidrlisedoCPH(Tabela1)tambmresultoudasua
elevadaconcentraodesubstrato.Elevadaconcentraodesubstratosempre
preferidanaindstria,poispodemelhoraraeficinciadoequipamentoereduzirocusto
deproduo.Liuetal.(2015)indicaramqueareacodeCGMaumaconcentraode
13,5%(w/v)tinhaumamelhortaxadetransfernciademassaeainibiodesubstrato
menordoqueade5%(w/v).
Oscompostosantioxidantespodeinibiraoxidaopordiferentesmecanismos,tais
comoaeliminaoderadicaislivreseagentesquelantesdeiesdemetal,etc.Assim,
existemvriasmaneirasdeavaliaractividadesantioxidantedeumcompostoea
utilizaodediversosensaiosprefervelparaconfirmaraactividade(Huang,Ou,&
Prior,2005).Radicalsuperxido,quegeradoinvivodurantearespiraonormaldo
corpohumanoiriaserconvertidosemradicaishidroxilo,napresenadeiesdemetal,
taiscomoFe2+ouCu2+,oquepoderiacausardanooxidativoparacomponentes
celularestaiscomoADNeprotenas(Ele,Girgih,Malomo,Ju,eAlukode2013).Assim,
nopresenteestudo,habilidadesdeCPHparalimpezaradicalhidroxila,radical
superxidoequelanteFe2+foramavaliados.Almdisso,tambmforamdeterminadosa
atividadedeeliminaoderadicaisDPPHepoderredutor.CPHcatalisadaporduas
proteasespossuasequencialmentevaloresmaiselevadosdecapturaderadicaisea
reduodapotnciadoqueporumaproteaseisoladamente(Tabela1).Esteresultado
indicouquemaisaminocidosbioactivoscommaiselectres,doadoresdehidrognioe
gruposespecficosdentropptidosforamexpostasapartirdaprotenainsolvelnativa,
e,entretanto,ospeptdeosdebaixoMWemhidrolisadoscatalisadasporduasproteases
tinhamaumentado.Emcomparao,osresultadosdopresenteestudomostraramuma
atividadedeeliminaoderadicaishidroxilamelhordoquearelatadaporZhuangetal.
(50,761,31%a5mg/ml)eumamaiorcapacidadedeeliminaoderadicaisDPPHde
hidrolisadodeproteadecanola(Cumbyetal.,2008eZhuangetal.,2013).
HidrolisadosdeprotenaoupeptdeoscombaixaMWforamrelatadosparainteragirde
formamaiseficazcomosradicaisqueintervmnoprocessodeoxidaodefracesde
elevadoMW(Chietal.,2015,Heetal.,2013eRanathungaetal.,2005).
Considerandoqueatecnologiadeultrafiltraopossuicaracteresdecustoeficciae
scaleuppronto,umamembrana6kDaMWCOfoiutilizadonopresenteestudopara
recolher<6fracodepptidokDa.
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RPHPLComeiomaiseficazdeviveisepurificarpptidos.Noentanto,aindadifcil
depurificarpptidosactivosapartirdehidrolisadosdeprotenaporRPHPLC
meramenteumavezqueexistemtantoscomponentesdepptidossemelhantesem
divulgadososhidrolisadosporproteases.Nopresenteestudo,oprotocolode
purificaoelaborativa(cromatografiadepermutainica,cromatografiadefiltraoem
gelesequencialmenteRPHPLC)foiaplicadaparapurificarospeptdeosantioxidantes
deCPH,oqualtambmfoiusadonosnossosestudosanteriores(Wangetal.,2014e
Zhengetal.,2006).
Estratgiaderastrearaatividadedepeptdeosbioativosemtodasasetapasde
purificaoextremamenteessencialpararecolherosefluentesativoscompreciso.A
atividadeantioxidantedasfraesdecadaetapadepurificaofoianalisadamedindoa
actividadedeeliminaoderadicaisDPPHnopresenteestudo,devidossuas
caractersticasdealtaprecisoeboareprodutibilidade.ColunadeSPSepharoseFF
tinhamsidoverificadosparaoseuefeitodepurificaodepptidosdemilho
antioxidantesnonossoensaioanterior,oresultadomostrouqueasfraces
antioxidantesnopoderiaserligadonacoluna(dadosnomostrados).Umavezquea
maioriadospptidosemantioxidantesCPHforamcarregadosnegativamente,eles
foramconcentradosepurificadosporQSepharoseFF.Peptdeosbioactivosapartirde
outrasfontes,taiscomopeixesmarinhos,protenadeovobrancopatoeescorpio
protenatambmforampurificadosporcromatografiadepermutaaninica(Renetal.,
2014,Renetal.,2014eSampathKumaretal.,2012).
Sequnciapeptdicadegrandeimportnciaparadecidiraactividadeantioxidantedos
pptidosactivos,porisso,necessrioconhecerascaractersticasespecficasdas
sequnciasdepptidosantioxidantes.Pptido2eopptidopossuatrssequncias
semelhantes,emqueapenastrsresduosdeaminocidos,emKLApptido2(YPKLA
PNE)eQLLemPeptide3(YPQLLPNE),sodiferentes.Podesenotarqueestesdois
pptidospossuemactividadeantioxidanterelativamentefraca,enquantoquea
actividadeantioxidantedopptido3erarelativamentemaiselevadadoqueadopptido
2.UmasequnciarepetitivadopptidoemLL3(YPQLLPNE)podemserresponsveis
pelasuaactividadeantioxidantemaiselevadadoqueadopptido2.tambmfoi
relatadoqueosresduosdeaminocidosdioutrirepetitivasdentrodeumpptidopode
serrelacionadocomasuaactividadeantioxidante(Siow&Gan,2013).Interaco
hidrofbicaentreosresduosdeaminocidoshidrfobospodemaumentaraactividade
antioxidantedospptidos.AAFLnopptido1(CSQAAFL)foiespeculadoque
desempenhamumpapelcrucialnasuaboaactividadeantioxidante(Fig.4).Uma
sequnciasemelhantefoirelatadonoestudodeNgoemquePALAnopeptdeoDPALA
TEPDPMPFseparadadaescaladetilpia,quemostrouumafortecapacidadede
eliminaoderadicaisDPPH(Ngo,Qian,Ryu,Park,&Kim,2010).Umpeptdeo
antioxidante(YYDPL)apartirdeprotenadebatatadocetambmpossuaamesma
sequncia(PL)comorelatadonopresenteestudo(Zhang,Mu,eSun,2014).
Almdisso,apresenadeaminocidosfavorveisempptidoigualmentecrticopara
determinarasuaactividadeantioxidante.Aminocidosaromticos(Tyr,Trp,PheeHis)
podeconverterradicaisparamolculasestveisdoandoeltrons(Rajapakse,Mendis,
Jung,Je,&Kim,2005).Tantoopptido2e3contmumpptidoTyrnoNterminalda
cadeiapeptdica,aqualtemumafunonaactividadeantioxidante.Aminocidos
hidrofbicospodemmelhorarasolubilidadedospptidosemlpidos,oquefacilitaa
interacoentreospptidoseasespciesradicais.Amaioriadosaminocidos
hidrfobosnastrspptidospodesecorrelacionamcomassuasactividades
antioxidantes,umaanlisesemelhantefoitambmencontradaemrelatriosanteriores(
Qianetal.,2008eSuetsunaeChen,2002).Almdisso,ogruposulfidrilodeCysno
pptidopodeactuarcomoumcaptadorderadicais,protegendootecidodostress
oxidativo(HernndezLedesma,Dvalos,Bartolom,&Amigo,2005).Aatividade
antioxidantedopeptdeo1(CSQAPLA)podesercontribudopeloresduoCys.
DPPHumradicalcomumeltronnoemparelhado.Onicoeltroncombinacomo
prtonquandoencontraantioxidantes.Peptide1exibiuumaexcelenteactividadede
eliminaoderadicaisDPPH,echegoumesmaatividadesequestradoraderadicais
DPPHcomoCPHcatalisadaporA+Ffeznaconcentraode0,18mg/ml.IC50valor
depptido1menordoqueosvaloresdePF(3,2mM)eLPF(2,07mM)apartirde
hidrolisadosdezena(TangeZhuang,2014)emisturaezenapptidomilhomisturade
pptidos(1,27mg/mle1,26mg/ml)(Lietal.,2010).Assim,ospptidosdemilhopode
contergrupodoadordeprotesquereagecomosradicaislivres,converteosem
substnciasmaisestveiseterminarreacoemcadeiaderadicais.
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Radicalsuperxidoumradicallivredeletrioquepodecausarsriosdanosaostecidos
humanos.Mediodeeliminaoderadicaissuperxidobaseadonoprincpiodeque
osantioxidantespodemeliminarradicalsuperxidoaniogeradonoprocessode
pirogalholautooxidaoeinibirareacodeautooxidaodopirogalol.Peptide1
possuaumaexcelenteactividadedeeliminaoderadicaisnionsuperxido.No0,42
mg/mlasuaactividadeeliminadoraeraigualaoCPHcatalisadaporA+F.Enquanto
isso,opptido3atingiuamesmaactividadequeumhidrolisado+Ffezseem3,6mg/
ml.Acapacidadedeeliminaodepptido1erasuperiordospptidosdezenade
milhoerelatadosporLietal.(2010).Peptdeosdemilhonesteestudopodeser
melhoresvarredoresderadicaissuperxido.
Osradicaislivrespodemformarsubstnciasestveisporeltronsaceitar,
interrompendoassimasreacesemcadeiaderadicaislivresquepodempararos
danosquecausamaocorpohumano.Poderredutorfoisempreaplicadoparaavaliara
capacidadedosantioxidantesparadoarelectres(Xiaetal.,2012).Pptido1obteveo
mesmovalorpoderredutorqueCPHcatalisadaporA+Faumaconcentraode0,52
mg/ml.KongeXiong(2006)indicouqueofortepoderredutordohidrolisadodezena
podeseratribudoaoaumentodadisponibilidadedeiesdehidrognio(prtonse
eltrons).Assim,umpptidodesteestudo,podeserumamelhordoadordeelectres.
OsresultadosdopresenteestudosugeremqueoCPH,especialmenteopptido1neste
estudopoderiaatuarcomoantioxidante.
5.Concluso
Nopresenteestudo,trsnovospptidosantioxidantesforampurificadosapartirde
hidrolisadosdeprotenademilhoeforamavaliadosquantossuascapacidades
antioxidantesinvitro.Osresultadosactuaisfornecerinformaotilparaoshidrolisados
deprotenasdemilhoantioxidanteepptidosquepoderiamserusadospara
nutracuticosoufarmacuticoscomoumaalternativaparaosantioxidantessintticos.O
ensaiodecluladeospptidoseosseusefeitosantioxidantesemanimaisso
submetidos.
Agradecimentos
EstetrabalhofoifinanciadopelaNationalScienceFoundationNaturaldaChina(No.
31.371.726),HeilongjiangProvincialgrandeprogramadepesquisaTecnologiadaChin
a(2013G0880),QiqiharCidadeTecnologiaProgramadeBureau(GYGG201.208),e
ComissodeEducaodaProvnciadeHeilongjiang,LaboratrioUniversidadeKeyda
transformaodeprodutosagrcolas,China.
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Umanovafronteiraempeptdeosbioativosdesojaquepodemprevenirdoenascrnicas
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Wangetal.,2014 XJWang,XQZheng,NKKopparapu,WSCong,YPDeng,XJSun,XLLiu
Apurificaoeavaliaodeumnovopptidodeantioxidanteapartirdehidrolisadodeprotena
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Ofraccionamentoecaracterizaodepeptdeosderivadosdeantioxidantesglutelinacevada
porhidrliseenzimtica
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aactividadeantioxidantedepptidosisoladosapartirdehidrolisadodeprotenadealfafafolha
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Preparaoecaracterizaoestruturaldeumpptidoantioxidativanovomilho
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OxidativoedanoaoDNAnitrativo:eventoschavenacarcinogneseinduzidapor
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Purificaoeidentificaodepeptdeosantioxidantesapartirdehidrolisadosdeprotenade
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Zhengetal.,2006 XQZheng,LTLi,XLLiu,XJWang,J.Lin,D.Li
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Apurificaoeaidentificaodepptidosantioxidantesapartirdefarinhadegltendemilho
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161006,provnciadeHeilongjiang,PRChina.Tel.:+8604522738341fax:+8604522725454.
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Jin 2016 Preparação de Hidrolisados - de Proteína Antioxidante Milho, Purificação e Avaliação de Três Peptídeos Antioxidantes Milho Novos

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