TUGAS ENZIMOLOGI

Isolasi Dan Pemurnian Enzim Dari Asam Laktat

Nama

: Fitriani Rumata

Nim

: 2014-67-009

Prodi

: Teknologi Hasil Perikanan

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS PATTIMURA AMBON
2016-2017

KATA PENGANTAR
Puji syukur kita panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas rahmat, karunia, dan ridhoNya sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah ini yang berjudul Isolasi dan Pemurnia
Enzim dari Bakteri Asam Laktat. Penulis berharap semoga makalah ini bermanfaat bagi ilmu
pengetahuan dan pihak yang membutuhkan. Peniulis menyadari bahwa makalah ini masih belum
lengkap karena reverensi yang masih kurang, untuk itu diharapkan kepada setiap pembaca untuk
memberikan saran dan masukan yang bersifat membangun guna melengkapi makalah ini.

Ambon, 27 Mei 2016

DAFTAR ISI
KATA PENGGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
B. Tujuan
BAB II PEMBAHASAN
A. Metode Isolasi dan Pemurnian Asam Laktat
B. Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil Galatosidase (Lapage et al. modifikasi 1973)

C. Produksi -Galaktosidase (Huang et al. 1993)

D. Pembahasan Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asam Laktat
E. Pembahasan Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil -Galatosidase

F.

Pembahasan Produksi -Galaktosidase

BAB III PENUTUP

A. Kesimpulan
B. Saran
DAFTAR PUSTAKA

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Bakteri asam laktat adalah bakteri yang memproduksi asam laktat, termasuk
golongan bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, sel berbentuk batang atau bulat,
baik tunggal, berpasangan atau berantai, kadang-kadang berbentuk tetrad. Bakteri asam
laktat tidak motil atau sedikit motil, bersifat mikroaerofilik sampai anaerob, bersifat
kemoorganotropik dan kompleks, serta bersifat mesofilik atau menyukai suhu 10-40 C
(Stamer 1980).
Bakteri asam laktat merupakan sebutan umum untuk bakteri yang memfermentasi
gula seperti laktosa atau glukosa untuk menghasilkan sejumlah besar asam laktat. Bakteri
asam laktat mempunyai enzim-enzim -galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono
2004). Laktosa akan masuk ke dalam sel bakteri asam laktat melalui permease, kemudian

-galaktosidase akan memutus ikatan glikosida pada laktosa sehingga akan menghasilkan
glukosa dan galaktosa (Marshall & Tamime 1997).
Bakteri asam laktat mempunyai 4 genus yaitu Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc, dan Pediococcus. Secara fisiologis dan berdasarkan metabolismenya,
bakteri asam laktat dikelompokkan menjadi dua bagian, yaitu homofermentatif dan
heterofermentatif (Surono 2004).
Fermentasi asam laktat beserta mikroorganisme yang digunakan dapat dilihatpada
Tabel 1.
Tabel 1 Pangan yang dapat difermentasi dan
menghasilkan asam laktat
Pangan

Mikroorganisme

Daging

Pediococcus cerevisiae
Lactobacillus plantarum
L. curvatus
L. bulgaricus
Streptococcus thermophilus
S. diacetylactis, S. cremoris
S. lactis, Lactobacilli
L. mesenteroides
L. brevis, L. plantarum
Penicillium cerevisiae

Susu
Susu
Sayur dan
Buah
(Fellows 1992)

B. Tujuan
Mengetahui cara Isolasi dan Pemurnia Eznim dari Bakteri Asam Laktat.

BAB II
PEMBAHASAN
A. Metode Isolasi dan Pemurnian Asam Laktat
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asam Laktat dari Makanan Hasil Fermentasi
(Misgiyarta & Widowati 2002)
Sampel makanan hasil fermentasi sebanyak 1 ml atau 1 gram ditambahkan ke
dalam 9 ml akuades steril (merupakan pengenceran 10 -1). Pengenceran dilakukan
secara berseri hingga pengenceran 10-7. Masing-masing pengenceran diambil 100 l
dan disebar dengan menggunakan batang kaca penyebar pada media MRS agar yang
telah padat pada cawan petri. Selanjutnya diinkubasi selama 48 jam, suhu 37 C.
Koloni-koloni yang terpisah dan berbeda bentuk dimurnikan dengan metode
cawan gores dengan cara 1 ose koloni bakteri digoreskan pada media MRS agar,
setelah itu diinkubasi selama 48 jam, suhu 37 C. Koloni murni yang tumbuh diambil

1 ose kemudian digoreskan secara zig zag ke dalam media MRS agar miring
kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C.
B. Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil Galatosidase (Lapage et al. modifikasi 1973)
Sebanyak 1000 l oNPGal dan 1 ose isolate bakteri asam laktat dimasukkan
ke dalam microtiter plate. Suspensi isolat kemudian diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37 C. Setelah inkubasi selesai, suspensi isolate ditambahkan 2500 l Na2CO 1
M lalu dianalisis menggunakan spektrofotometer UV VIS pada panjang gelombang
420 nm.
C. Produksi -Galaktosidase (Huang et al. 1993)
Sebanyak 2% inokulum bakteri asam laktat dengan kerapatan optik 0.5
diinokulasikan ke dalam 900 ml media MRS yang telah steril, diinkubasi pada suhu
37 C. Sel dipanen pada waktu fermentasi yang menunjukkan fase eksponensial.
Setelah fermentasi selesai, cairan disentrifus dengan kecepatan 10000 g selama 15
menit pada suhu 4 C. Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan buffer
fosfat 0.1 M pH 7. Sebanyak 1 gram pelet yang diperoleh dilarutkan dalam 5 ml
buffer fosfat 0.1 M pH 7 kemudian dilakukan pemecahan sel dengan sonikator selama
5 menit pada suhu 4 C. Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10000
g selama 15 menit pada suhu 4 C. Supernatan yang diperoleh merupakan cairan
enzim -galaktosidase.
D. Pembahasan Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asam Laktat
Isolasi dan Pemurnian Bakteri Asam Laktat
dari Makanan Hasil Fermentasi
Isolat yang diperoleh pada isolasi dari makanan hasil fermentasi meliputi susu
fermentasi, keju, sayuran, dan buah-buahan yang difermentasi. Isolat bakteri dari
suatu bahan yang mengandung campuran mikroba dapat dilakukan isolasi dengan
beberapa metode. Menurut Lay (1994), secara umum terdapat tiga metode untuk
mengisolasi mikroba menjadi biakan murni, yaitu teknik penggoresan agar, agar
tuang, dan agar sebar. Dalam jurnal ini (ISOLASI DAN KARAKTERISASI GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM LAKTAT DARI MAKANAN
FERMENTASI) menggunakan metode agar sebar untuk mengisolasi bakteri.

HASIL

Tahap awal isolasi, sampel makanan hasil fermentasi diencerkan terlebih

dahulu dengan akuades steril selanjutnya ditumbuhkan di dalam media MRS agar,
yang merupakan media selektif untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, dengan cara
disebar. Pengenceran yang dilakukan berkisar dari 10-1 sampai 10-7. Penyebaran
suspensi bakteri yang telah diencerkan pada permukaan media MRS agar dengan alat
penyebar yang terbuat dari gelas. Menurut Lay (1994), keuntungan dari teknik ini
adalah pertumbuhan koloni akan menyebar sehingga memudahkan dalam
pengambilan koloni bakteri.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa semakin besar faktor pengencerannya,

jumlah isolat bakteri yang memiliki koloni tunggal semakin banyak. Hal ini
disebabkan isolate memiliki ruang gerak yang lebih luas pada pengencerannya yang
lebih tinggi.
Setelah dilakukan isolasi bakteri asam laktat 6-7 selanjutnya dilakukan
pemurnian isolat dengan metode cawan gores. Bakteri yang telah murni ini
selanjutnya diamati morfologinya berupa bentuk koloni, bentuk tepian koloni, bentuk
elevasi koloni, dan warna koloni. Gambar 3 menunjukkan morfologi koloni bakteri
asam laktat dari makanan hasil fermentasi. Berdasarkan hasil isolasi diperoleh 13
isolat bakteri asam laktat.

Gambar 3 Morfologi koloni bakteri asam

laktat dari makanan hasil
fermentasi.

E. Pembahasan Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil -Galatosidase

Aktivitas -galaktosidase dapat diketahui dengan menggunakan substrat
laktosa untuk menentukan jumlah glukosa dan galaktosa yang terbentuk. Penentuan
aktivitas -galaktosidase sering dilakukan dengan mengukur jumlah glukosa dan
galaktosa yang terbentuk . Disamping laktosa sebagai substrat dapat juga digunakan
o-nitrofenil-galaktopiranosida (oNPGal). Laju dari reaksi tersebut dapat diikuti
dengan memperkirakan jumlah kromogen o-nitrofenol yang terbentuk (Winarno
1999).
Seleksi bakteri asam laktat penghasil galaktosidase dilakukan dengan cara
menginkubasi isolat-isolat tersebut dengan onitrofenil--D-galaktopiranosida di
dalam microtiter plate selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan Na2CO 1 M sebagai
penghenti reaksi. Jumlah o-nitrofenol (oNP) yang terbentuk dideteksi dengan
spektrofotometer = 420 nm.

F.

Pembahasan Produksi -Galaktosidase

Pemanenan sel dilakukan pada saat fase eksponensial karena pembentukkan
enzim terdapat pada fase tersebut. Oleh sebab itu, perlu dilakukan pengukuran
pertumbuhan isolat-AV-1 dan L. bulgaricus selama 72 jam dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Gambar 5 menunjukkan fase

eksponensial untuk isolate AV-1 setelah diinkubasi selama 3-27 jam sedangkan untuk
L. bulgaricus berada pada 6- 27 jam. Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju
konstan, masa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolik
konstan, dan menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986).
Pemanenan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10000 g
selama 15 menit pada suhu 4 C, untuk mencegah kerusakan enzim. Dengan
demikian, sel yang berbobot molekul lebih besar dari larutan media akan mengendap
karena gaya gravitasi. Sel yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer
fosfat 0.1 M pH 7 agar terbebas dari pengotor yang berasal dari media. Selanjutnya
sel mengalami pemecahan sel dengan metode sonikasi. Metode ini bertujuan untuk
memecah dinding sel dengan frekuensi gelombang suara yang besar. Sel dipecah di
dalam buffer fosfat 0.1 M pH 7 pada suhu 4 C agar enzim tidak rusak. Sel
dipisahkan dari ekstrak enzim dengan sentrifugasi. Menurut Huang et al. (1993),
enzim -galaktosidase pada bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler
sehingga memerlukan pemecahan dinding sel.
Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh nilai aktivitas enzim rata-rata kecil. Hal
ini disebabkan dalam ekstrak enzim kasar tersebut masih banyak terdapat enzim lain
selain enzim -galaktosidase. Selain itu, waktu dan kondisi yang diukur belum
optimum untuk setiap isolate tersebut sehingga perlu dicari kondisi optimum untuk
mengetahui aktivitas tertinggi dari mikroorganisme penghasilnya.

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Isolasi dan pemurnian dari makanan hasil fermentasi meliputi susu fermentasi,
keju, sayuran, dan buah-buahan yang difermentasi menunjukkan morfologi koloni bakteri
asam laktat dari makanan hasil fermentasi. Berdasarkan hasil isolasi diperoleh 13 isolat
bakteri asam laktat.
B. Saran
Dengan adanya pembahasan mengenai Isolasi dan Pemurnian Enzim Bakteri
Asam Laktat di atas maka di haraopkan makalah ini dapat menambah pengetahuan kita
tentang Isollasi dan Pemurnian Enzim Bakreti Asam Laktat.

DAFTAR PUSTAKA
JURNAL ISOLASI DAN KARAKTERISASI -GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM
LAKTAT DARI MAKANAN HASIL FERMENTASI