FLOWCYTOMETRY
PEMERIKSAAN SEL T CD4 dan CD8
Oleh :
Yulia Dwi Setia
NIM 156070100111002
PENDAHULUAN
a. Dasar Teori
Metode flow cytometry adalah teknik untuk mengukur sel yang memiliki berbagai
karakteristik atau molekul di permukaan maupun di dalam sitoplasma pada suspensi sel.
Metode ini dilakukan dengan cara mengamati bagaimana sel tersebut mengalir di dalam
cairan. Molekul yang menjadi target tersebut biasanya diikat dengan antibodi monoklonal
yang berlabel fluorokrom tertentu. Kemudian sel dilewatkan celah sempit, dan ditembak
sinar. Pada suatu populasi sel yang sejenis, misal pada sel kanker yang diberi perlakuan
suatu senyawa sitotoksik, dapat dilakukan analisis terhadap fase - fase daur sel, sel
apoptosis, serta sel yang mengalami poliploidi.
b. Tujuan kegiatan
1. Memahami prinsip kerja teknik Flowcytometry
2. Mampu melakukan pemeriksaan sel CD4 dan CD8
3. Mampu menentukan jumlah sel yang memiliki CD4 dan CD8 pada sample.
c. Pelaksanaan Kegiatan
Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Biomedik FKUB pada tanggal 28 September
2015 pukul 09.40 12.00
d. Alat dan Bahan :
a)
Tabung sentrifus 1,5 ml
b)
Sentrifuge dingin
c)
Micropipet
d)
Kuvet fcm
e)
Vacutainer EDTA
f)
Swing centrifugated
g)
Ficoll Hipaque
h)
Phospat Buffer Salin
i)
Sample darah
j)
Antibodi sel surface marker
k)
Larutan sel staining buffer
e. Prosedur kerja
a)
Semua bahan yang diperlukan dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan
sampai suhu ruang
b)
c)
Sampel darah dalam vacutainer EDTA yang akan diuji diambil dengan
micropippete dan disalutkan secara perlahan pada dinding tabung sentrifus
sehingga terbentuk 2 lapisan
d)
Mensentrifuse dengan kecepatan 1600 rpm selama 30 menit dalam suhu ruang
e)
Setelah disentrifuse akan terpisah menjadi 5 lapisan, yaitu plasma, sel PBMC,
Ficoll, granulosit dan sel darah merah
Plasma
Sel PBMC
Ficoll
Granulosit
Sel darah merah
f)
g)
Larutan PBMC dicuci dengan PBS hingga 10 mL dan disentrifuse suhu ruang
dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. Pencucian ini dilakukan
sebanyak 2 kali
h)
Pelet yang terbentuk dicuci dengan sel staining buffer (2% Fetal Bovine Serum
(FBS) dalamPBS) 1 kali
i)
j)
Supernatan dibuang dan pelet sel yang terbentuk siap untuk distaining dengan
antibodi surface marker (2,5L FITC CD4 ditambah 2,5L PE CD8 diencerkan
dengan 45L sel staining buffer)
k)
Pelet sel dicampurkan dengan antibodi surface marker yang telah diencerkan
l)
m)
n)
HASIL
a.
Keterangan : Gate (terdapat lingkaran) pada scatter di atas menunjukkan sel limfosit
b. Persentase gate limfosit
Keterangan : yang merupakan sel yang hanya memiliki CD4 tanpa CD8 ditunjukkan
pada persentase kuadran kanan bawah (LR), untuk sel yanghanya memiliki CD8
tanpa CD4 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL). Sedangkan sel yang
memiliki marker CD4 dan CD8 ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR).
PEMBAHASAN
Pada grafik pencar (scatter) sample PBMC, sumbu x menunjukkan ukuran sel,
sedangkan sumbu y menunjukkan kompleksitas dari sel. Pada sumbu x, semakin ke kanan,
maka ukuran sel semakin besar. Sedangkan pada sumbu y, semakin ke atas maka
kompleksitas sel semakin tinggi, yang dapat pula diartikan bahwa semakin ke atas maka
semakin tinggi granularitas sel tersebut.
Berdasarkan ukuran dan tingkat granularitasnya, sel yang paling besar dan memiliki
banyak granul adalah sel makrofag. Sel terbesar dan tingkat granular yang tinggi kedua
adalah monosit, di bawahnya lagi adalah sel limfosit. Untuk ukuran yang lebih kecil lagi dan
tidak bergranul atau kompleksitasnya rendah merupakan sel yang telah mati atau debris
debris. Jadi, populasi yang ditandai (gate) pada grafik pencar (scatter) sample whole blood
menunjukkan populasi sel limfosit. Dari data tersebut dapat diketahui bahwa terdapat
55,61% sel limfosit dari 24367 event yang direkam pada alat flowcytometry. Dari gate
tersebut kita dapat menganalisa banyaknya sel yang memiliki permukaan CD4 dan atau
CD8.
Pada grafik pencar (scatter) pada populasi sel limfosit T, sumbu x menunjukkan
penanda permukaan CD4, sedangkan sumbu y menunjukkan penanda permukaan CD8.
Grafik tersebut dibagi menjadi empat kuadran, yaitu kuadran kiri atas (UL), kanan atas (UR),
Kuadran kiri bawah (LL), dan kuadran kanan bawah (LR). Sel yang memiliki CD4 tanpa CD8
ditunjukkan pada persentase kuadran kanan bawah (LR), untuk sel yang memiliki CD8
tanpa CD4 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL). Sedangkan sel yang
memiliki marker CD4 dan CD8 ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR).
Dari tabel persentase dapat diketahui bahwa sel limfosit T yang hanya memiliki CD4
sebanyak 36,05% dari keseluruhan sel limfosit dan 20,05% dari keseluruhan sel PBMC.
Sedangkan sel limfosit yang hanya memiliki CD8 sebanyak 24,25% dari keseluruhan sel
limfosit dan 13,6% dari keseluruhan sel PBMC. Sel yang memiliki CD4 dan CD8 sebanyak
0,50% dari keseluruhan sel limfosit dan 0,28% dari keseluruhan sel PBMC.
Prinsip kerja pemeriksaan flowcytometry pada praktikum ini adalah mengukur sel
PBMC yang memiliki molekul CD4 dan CD8 di permukaan sel yang telah diikat
dengan antibodi monoklonal yang berlabel fluorokrom tertentu. Kemudian sel
b) Saran
-