INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE IRAPUATO

Prctica #1: Recuento de Placas

Mesfilas Aerobias en Agua para
Consumo Humano

Docente: Dra. Ma. Azucena Mrquez Lcio

Alumnos:
IS10110682Salomn Negrete, Miguel ngel
IS10110683Ramirez Nez, Miguel ngel
IS10110064Martinez Prez, Christian Ivn
IS10110606Ramirez Garca, Mario
IS10110754Sanchez Bermejo, Natalie

INDICE
INDICE DE FIGURAS..............................................................................................IV
INDICE DE TABLAS.................................................................................................IV
1. INTRODUCION...................................................................................................1
2. ANTECEDENTES...............................................................................................4
2.1

Tcnica de recuento en placas....................................................................4

2.1.1

Gelatina nutritiva....................................................................................5

2.1.2

Medio agar.............................................................................................5

2.2

Otros mtodos para el recuento de bacterias.............................................6

2.2.1

Recuento en placa estndar..................................................................6

2.2.2

Recuento heterotrfico en placas.........................................................6

2.2.3

Recuento en placa por siembra en profundidad...................................7

2.2.4

Recuento en placa por siembra en superficie.......................................7

2.3

El agua..........................................................................................................7

2.3.1

Orgenes del agua.................................................................................7

2.3.2

Control del agua.....................................................................................9

2.4

microorganismos indicadores.....................................................................11

2.4

Mesfilos aerobios......................................................................................11

3. OBJETIVO.........................................................................................................13
4. MATERIALES Y REACTIVOS..........................................................................13
5. PROCEDIMIENTO............................................................................................13
6. DIAGRAMAS.....................................................................................................16
7. CLCULOS.......................................................................................................17
8. RESULTADOS..................................................................................................17
8.1 PRESENTACION DE LOS RESULTADOS....................................................19
9. DISCUSIONES..................................................................................................19
10.

CONCLUSIONES..........................................................................................20

11.

CUESTIONARIO............................................................................................21

12. ANEXOS............................................................................................................22
12.1 FICHAS TECNICAS.....................................................................................22
2

Bibliografa...............................................................................................................24

INDICE DE FIGURAS
Figura 1: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -1.........................18
Figura 2: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -2 en placa..........18
Figura 3: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -3 en placa..........19

INDICE DE TABLAS
Tabla 1: materiales y reactivos a utilizar en la prctica...........................................13
Tabla 2: Presentacin de resultados en UFC/mL....................................................19
Tabla 3: ficha reactiva para etanol...........................................................................24

1. INTRODUCION
De todos los tipos de contaminacin ambiental, puede destacarse la
contaminacin del agua. Muchas veces el agua puede ser completamente
transparente, incolora e inodora, pero estar an contaminada, por lo que, es
importante determinar su calidad sanitaria. La potabilidad del agua slo se puede
determinar mediante anlisis qumicos y bacteriolgicos. Los procedimientos
bacteriolgicos de rutina son: Recuento de Bacterias Mesfilas Aerobias,
Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Estreptococos Fecales y Clostridios Sulfito
Reductores.
El agua es un elemento vital para la existencia humana, de su uso adecuado
depende nuestra salud, alimentacin y produccin agrcola. El utilizar agua
contaminada en la preparacin de alimentos u otras actividades nos podra
producir un gran nmero de casos de infeccin.
A nivel mundial alrededor de 1,8 millones de personas mueren cada ao
debido a enfermedades diarreicas (incluido el clera); un 90% de esas personas
son nios menores de cinco aos, principalmente procedentes de pases en
desarrollo. Adems se ha estimado que el 88% de las enfermedades diarreicas
son producto de un abastecimiento de agua insalubre, de un saneamiento y una
higiene deficientes.
El agua es un vehculo importante de agentes patgenos causales de
enfermedades diversas en el humano, dentro de los que destacan bacterias como
el Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica, virus como el de la
hepatitis A y de

Norwalk,

protozoos importantes como Giardia lamblia,

Entamoeba histolytica y Criptosporidium parvum.

El control de la calidad del agua ha sido prioritario principalmente en zonas
Urbanas, para verificar una adecuada potabilizacin del agua, o cuando se
presentan brotes de enfermedades diarreicas en la poblacin consumidora, donde
una vez detectado el problema en el suministro de agua se resuelve a corto plazo
1

mejorando las condiciones de desinfeccin de la misma , esto se cumple con las

especificaciones de la norma oficial Mexicana para agua para consumo humano.
Los recuentos de Mesfilos Aerbicos en placa son tiles para determinar la
potabilidad de un agua, as como tambin la eficiencia de las operaciones para
eliminar microorganismos, como la sedimentacin, filtracin y cloracin. Las
cuentas se deben hacer antes y despus del tratamiento especfico. Los
resultados indicarn la medida en que ha sido reducida la poblacin microbiana.
Lo usual es que el agua de buena calidad, para consumo humano, tenga
cuentas bajas: < 100 UFC por mililitro.
La determinacin del conteo de bacterias mesfilas aerobias en una muestra
de agua se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen
determinado de agua, por incubacin a una temperatura concreta y en un tiempo
determinado, y por recuento posterior de las colonias desarrolladas y con la
aceptacin implcita de que cada colonia es originada por una bacteria de la
muestra inicial, por lo tanto, el nmero de colonias equivaldr al nmero de
bacterias en el volumen sembrado.
La calidad microbiolgica de los alimentos es fundamental porque influye en su
conservacin y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos
presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por
alimentos ETAs.
La deteccin en el laboratorio de los microorganismos patgenos puede ser
muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias.
Adems, es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patgeno pero
puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el
clima o la cantidad de individuos infectados que estn contaminando, a pesar de
que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patgeno aparezca en
cualquier momento. En todo caso, la investigacin de microorganismos patgenos
en alimentos no facilita un enfoque preventivo.

Por esas razones, las normas en materia de alimentos, generalmente

establecen la calidad microbiolgica en trminos de microorganismos indicadores.
stos son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo
inadecuado o contaminacin que incrementan el riesgo de presencia de
microorganismos patgenos en alimentos. Adems de que su deteccin en el
laboratorio es ms sencilla, rpida y/o econmica, los microorganismos
indicadores permiten un enfoque de prevencin de riesgos, puesto que advierten
manejo inadecuado y/o contaminacin.
Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:
-

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso:

o Mesfilos aerobios (o cuenta total).
o Cuenta de hongos y levaduras
o Cuenta de coliformes totales.
Indicadores de contaminacin fecal:
o Coliformes fecales; E. coli, enterococos, Cl. perfringens

La seleccin de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los

riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar o mejorar el
alimento, manteniendo el enfoque preventivo.
Las normas consultadas
NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo
para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa.
En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los
microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por
sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan
una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo
sanitario del producto ha sido el adecuado.
3

Por otra parte el recuento de termoflicos, psicroflicos y psicotrficos es

importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de
almacenamiento.
Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma
importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones.
Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en
una amplia variedad de alimentos.
Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental. Agua para
uso y consumo humano. Lmites permisibles de calidad y tratamientos a que debe
someterse el agua para su potabilizacin.
El abastecimiento de agua para uso y consumo humano con calidad adecuada
es fundamental para prevenir y evitar la transmisin de enfermedades
gastrointestinales y otras, para lo cual se requiere establecer lmites permisibles
en cuanto a sus caractersticas microbiolgicas, fsicas, organolpticas, qumicas y
radiactivas, con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua en los sistemas,
hasta la entrega al consumidor.
Por tales razones la Secretaria de salud, propone la modificacin a la presente
Norma Oficial Mexicana, con la finalidad de establecer un eficaz control sanitario
del agua que se somete a tratamientos de potabilizacin a efecto de hacerla apta
para uso y consumo humano acorde a las necesidades actuales.

2. ANTECEDENTES
2.1

Tcnica de recuento en placas

En los Estados Unidos se han usado mtodos para detectar y enumerar las
bacterias en el agua desde el inicio de la microbiologa sanitaria a principios del
siglo XX. Adems de enumerar las bacterias indicadoras (coliformes totales y
fecales, Escherichia coli), se ha usado un procedimiento del recuento de bacterias

para calcular la densidad general de la poblacin bacteriana en el agua

(Fernndez, 2007)
2.1.1 Gelatina nutritiva.
El Dr. Robert Koch (1876) us la gelatina como el primer agente gelificante
para solidificar el medio lquido usado en el cultivo de las bacterias. Tambin
desarroll el mtodo de estriado, el mtodo de recuento en placas para el
aislamiento de bacterias y el mtodo de sesgado para sembrar cultivos puros. El
uso de la gelatina como agente de solidificacin permiti obtener muestras para el
cultivo en placas, directamente o en alcuotas diluidas, en el medio gelificado, lo
que facilit el crecimiento de colonias individuales y el desarrollo de cultivos puros.
La gelatina se poda obtener fcilmente y a un bajo costo pero presentaba dos
desventajas. En primer lugar, se debe incubar por debajo de 28 C para
mantenerla solidificada; el uso de temperaturas de incubacin inferiores de 28 C
no es adecuado para muchas bacterias. En segundo lugar, muchas bacterias
pueden descomponer la gelatina, lo que hace que se lice e impida la
reproduccin de las colonias. Actualmente, la gelatina nutritiva se usa
principalmente para determinar si una bacteria aislada de un cultivo puro puede
producir gelatinasa y licuar la gelatina como una caracterstica bioqumica
(Fernndez, 2007)
2.1.2

Medio agar.

Fue por sugerencia de Frau Hesse, esposa de un antiguo auxiliar del Dr. Koch,
que el agar se introdujo como un agente gelificante para el medio de cultivo.
En el Oriente el agar, derivado de algunas algas marinas, se us como un
agente gelificante. El agar entra en solucin a 100 C y permanece en estado
lquido a una temperatura aproximada de 40 C. Por lo tanto, una vez gelificado,
permanece en estado slido y se puede incubar a diferentes temperaturas para
cultivar bacterias. Adems, como el agar es un carbohidrato complejo atacado solo
por algunas bacterias, el problema de la licuefaccin no es muy frecuente (Vullo,
2006)

Por lo tanto, el uso del agar como agente de solidificacin en medios de cultivo
selectivo y no selectivo ha permitido obtener mayor flexibilidad y capacidad para
detectar y enumerar bacterias en todo tipo de muestras, incluidas las muestras
clnicas, de alimentos, agua ambiental y potable, suelos, sedimentos y superficies
(cocinas y reas de preparacin de alimentos, superficies de hospitales, etc.)
(Vullo, 2006).
2.2

Otros mtodos para el recuento de bacterias.

2.2.1 Recuento en placa estndar.

En los Estados Unidos, los Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater, desde su primera edicin en 1905 (con el ttulo Standard
Methods of Water Analysis), han incluido un medio para medir la poblacin general
bacteriana en el agua. En el procedimiento de recuento en placas se emplearon
placas de gelatina nutritiva incubadas a 20 C. La segunda edicin de los mtodos
estndar (1912) introdujo el recuento en placas a 37 C, por 24 h con agar
nutritivo, pero tambin consider el recuento en placas a 20 C por 48 con gelatina
nutritiva. La inclusin del recuento en placas a 20 C continu hasta la 12a. edicin
de los mtodos estndar (1965) pero se le excluy en las ediciones de la 13a. a la
15a. (1980). En la 16a. edicin (1985) se volvi a introducir el recuento en placas a
20 C con medio agar y se cambi el nombre de recuento en placa estndar s
(REP) a recuento heterotrfico en placas (RHP) (Casalta, 2010)
El procedimiento actual del recuento en placa estndar (RPE) evolucion de la
metodologa anterior que aplicaba una incubacin a 37 C para el recuento a
temperatura corporal" especificada en los mtodos estndar de la 3a. edicin
(1917), hasta la 8a. edicin (1936), en la 9a. edicin (1946) se especific una
incubacin por 242 h a 35-37 C (Casalta, 2010)
2.2.2

Recuento heterotrfico en placas

Durante los ltimos aos, el inters por medir la densidad bacteriana de las

muestras de agua potable ha dado lugar a algunos cambios en el procedimiento

aceptado. Mientras que en el pasado el recuento de bacterias en placas era
6

conocido como el recuento total en placas o el recuento en placa estndar, la

terminologa cambi en la 16a. edicin (1985) de los mtodos estndar a
recuento heterotrfico en placas (RHP). Al adoptar este nombre, se reconoce
que el procedimiento de recuento de bacterias en placas no puede obtener una
medicin total del recuento de las bacterias y que, mientras se requieran
condiciones estndares, deber haber alguna libertad para elegir las condiciones
estandarizadas de modo que la medicin se adapte a las necesidades de
informacin del usuario (Reasoner, 2000)
2.2.3 Recuento en placa por siembra en profundidad.
Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa
de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la
placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se
incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la
superficie.

Es un

mtodo

generalmente

utilizado

para

el

recuento

de

microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos (Reasoner, 2000)

2.2.4 Recuento en placa por siembra en superficie
Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra
sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las
colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica
para el recuento de bacterias aerobias (Vullo, 2006).
2.3

El agua.

2.3.1 Orgenes del agua.

El agua es un compuesto imprescindible para los organismos que no
podran vivir en un medio en el que faltara. Todos los seres vivos presentan un
elevado contenido en agua, que alcanza el 97% del peso corporal en el caso de
medusas y que en el hombre oscila entre el 65% y el 70%. El agua es un lquido
biolgico por excelencia en el que se desarrollan la mayora de las reacciones y de
los procesos vitales. Geolgicamente constituye el principal agente externo (Gray,
1996).
7

El origen del agua en el sistema solar es probable que se deba a los

procesos de fusin termonucleares. La cantidad total de este lquido en la tierra es
de, aproximadamente, el 0,4% de su volumen total, con un volumen de 8,2X109
Km3. La mayora est qumica y fsicamente contenida en rocas y minerales de la
corteza y el manto. La cantidad de agua libre formando la hidrosfera se estima en
1,4X 109 Km3 representando el 17% de la cantidad total de agua en la tierra,
donde 96% est almacenada en los ocanos (Isaac-Mrquez AP, 2010)
Las disponibilidades en agua constituyen un factor fundamental para el
desarrollo econmico y la salud pblica. Los abastecimientos de agua se
consideran en todos los pases como inversiones bsicas de inters general, en el
sentido de que posibilitan actividades humanas e industriales directamente
productivas que influyen en la tasa de crecimiento econmico (Vullo, 2006)
Siendo el agua un elemento vital para la existencia humana, de su uso adecuado
depende nuestra salud, alimentacin y produccin agrcola. El utilizar agua
contaminada en la preparacin de alimentos u otras actividades podra producir un
gran nmero de casos de infeccin, por ello el agua de consumo para la poblacin
debe ser potable (Flix, 2007)
La abundancia y distribucin del agua, hace que sea la sustancia ms
importante para que el planeta tierra sea nico en el sistema solar ya que es
indispensable para la vida, y es el responsable del rgimen climtico global. Esto
se debe a que tiene unas caractersticas moleculares anmalas y en las
condiciones de presin y temperatura que dominan al planeta, puede presentarse
en los tres estados: slido, lquido y gaseoso (Raya, 2003).
El agua potable es aquella que cumple con los requisitos microbiolgicos,
organolpticos, fsicos, qumicos, y radiactivos que establecen las normas
sanitarias de calidad de agua potable y que se considera apta para el consumo
humano. Si se cumplen estos requisitos, el agua se torna apta para el consumo y
para la elaboracin y procesamiento de alimentos, es decir que puede ser utilizada
sin temor por los efectos nocivos que pueda producir sobre la salud. El uso
8

domiciliario del agua potable es el ltimo eslabn de un proceso conformado por

varias etapas que deben cumplirse con eficacia, porque hacer el agua potable
significa transformarla en agua apta para beber. Y ello implica mucha
responsabilidad. Antes de llegar a las tuberas, el agua pasa por distintas fases
que forman parte del servicio: Captacin, Potabilizacin, Conduccin y Distribucin
(Raya, 2003).
2.3.2 Control del agua.
La contaminacin del agua con excretas ha sido, a travs del tiempo, una
de las principales preocupaciones humanas. Es importante que la disponibilidad y
uso de sistemas de abastecimiento de agua potable sean adecuados, as como
los medios higinicos, los cuales constituyen partes integrales de la atencin
primaria de salud, lo que ayuda a evitar o limitar la propagacin de muchas
enfermedades infecciosas, tanto en los seres humanos como en animales. La
contaminacin del agua tambin, puede ser a travs de la fuente, de su
distribucin o en los depsitos comnmente empleados para almacenarla, puesto
que se ha comprobado que la contaminacin de los botellones destinados para la
distribucin del agua potable a las comunidades es un factor importante en la
transmisin de enfermedades diarreicas; dicha contaminacin se puede producir
cuando no estn bien cubiertos, mal lavados o cuando utensilios o manos
contaminadas entran en contacto con el agua (Vullo, 2006).
El control de la calidad del agua ha sido prioritario principalmente en zonas
urbanas, para verificar una adecuada potabilizacin de la misma, o cuando se
presentan brotes de enfermedades diarreicas en la poblacin consumidora, donde
una vez detectado el problema en el suministro de agua se resuelve a corto plazo
mejorando las condiciones de desinfeccin de la misma (Flores, 1995)
El agua, de calidad cada vez ms pobre, puede transmitir una gran cantidad
de enfermedades peligrosas y hasta mortales, entre ellas las enfermedades
diarreicas agudas (EDA), que constituyen uno de los principales problemas de
salud en la poblacin infantil. Las EDA representan la primera causa de muerte en
nios de 1 a 5 aos de edad, en quienes ocasionan 3,2 millones de defunciones
9

anuales en el mundo. Adems se ha estimado que el 88% de las enfermedades

diarreicas son producto de un abastecimiento de agua insalubre, de un
saneamiento y una higiene deficientes (Flores, 1995)
La contaminacin es un proceso de alteracin o de modificacin ms o
menos importante de los equilibrios fsicos, qumicos o biolgicos del agua que
son responsables de su calidad y la hacen inadecuada para sus numerosos usos y
aplicaciones. Dicha contaminacin puede tener dos orgenes: qumico o
microbiolgico. El agua natural constituye un reservorio de microorganismos
autctonos (Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus) o exgenos (Escherichia coli,
Enterococcus). No debe olvidarse que recibe y arrastra partculas cargadas de
bacterias, de tal modo que en cercanas de las grandes poblaciones incluso el
agua de lluvia es portadora de un elevado nmero de microorganismos (Vullo,
2006)
La diseminacin de los patgenos ambientales causantes de enfermedades a
travs del agua, depende principalmente de su supervivencia en el ambiente, de la
exposicin de los individuos al agua contaminada, del grado de susceptibilidad de
los individuos, de la concentracin de los microorganismos entricos en el
ambiente como consecuencia del nmero de personas y animales infectados en
las comunidades, de la cantidad de agua que cada individuo ingiere y de la dosis
infecciosa del microorganismo (Guzman, 2011)
Otra causa de contaminacin del agua es el exceso de nutrientes como el
caso de fertilizantes vertidos en agua, especialmente los compuestos por fsforo y
sus derivados, los cuales hacen que originen algas en exceso, impidiendo la
entrada de luz solar al lago o laguna, y la muerte de los peces. Tambin
sustancias txicas, como los metales pesados (plomo y cadmio), generan
bioacumulacin, y finalmente los residuos urbanos (aguas negras o aguas
servidas), que contienen excrementos, tambin generan contaminacin (Flix,
2007)

10

En un estudio realizado por la Organizacin Panamericana de la Salud en

1984, se determin que aproximadamente 75% de los sistemas de aguas locales y
municipales en Amrica Latina y el Caribe estaban mal desinfectados o carecan
de sistemas de desinfeccin. Cabe destacar que el monitoreo de la calidad del
agua potable, vinculado a la vigilancia epidemiolgica, pone al alcance de las
autoridades sanitarias informacin sistemtica y rpida sobre la causa de
cualquier brote o epidemia de EDA, permitindoles establecer prioridades y saber
qu medidas tomar en cada caso (Flix, 2007)
2.4

microorganismos indicadores.
Las

bacterias

del

grupo

coliforme,

pertenecientes

la

familia

Enterobacteriaceae, ha sido siempre el principal indicador de calidad de los

distintos tipos de agua; el nmero de coliformes en una muestra, se usa como
criterio de contaminacin y, por lo tanto, de la calidad sanitaria de la misma. Dicho
grupo se caracteriza por estar formado por microorganismos que habitan el tracto
gastrointestinal de los vertebrados. Los coliformes son bastones gramnegativos,
aerobios o anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con formacin de gas
cuando

se

incuban

durante

48

horas

35C.

Incluye

los

gneros

Escherichia,Enterobacter, Klebsiella, entre otros. Debido a que la concentracin de

dichos agentes habitualmente es baja, su deteccin directa en aguas es
complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son
de fcil deteccin y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia
que excede al de los patgenos en ese ambiente (Isaac-Mrquez AP, 2010).
2.4

Mesfilos aerobios.
Otro grupo de indicadores de calidad sanitaria, que se han utilizado en el

anlisis microbiolgico del agua, es el de los aerobios mesfilos, los cuales son
microorganismos hetertrofos, aerobios o anaerobios facultativos, mesfilos o
psicotrficos capaces de crecer en cualquier medio de agar nutritivo. Estas
bacterias se estudian, junto con el ndice de coliformes, con el propsito de
controlar un proceso de tratamiento de agua y para verificar su calidad. El mtodo
se basa en contar el nmero de colonias desarrolladas en una placa de medio de
11

cultivo slido, en el que se ha sembrado un volumen conocido de agua,

transcurrido un tiempo y una temperatura de incubacin determinados (Silva,
2004)
Es conocido a nivel mundial que la calidad de las fuentes de agua
destinadas para el consumo humano ha representado una problemtica
importante para los investigadores. En un estudio del agua realizado en la ciudad
de Campeche, Mxico, se investig la calidad sanitaria de los suministros (pozos)
que abastecen a la poblacin de la ciudad, y se encontraron bacterias mesfilas
aerobias, microorganismos coliformes totales y coliformes fecales; demostrando la
existencia de potentes factores de contaminacin, tanto en los pozos como en su
entorno inmediato. Los resultados indicaron la necesidad de implementar un
programa permanente de monitoreo de la calidad sanitaria del agua que asegure
una vigilancia sistemtica de las fuentes de abastecimiento y distribucin para el
consumo humano (Flores, 1995)
En la primera mitad de siglo XX, los pases industrializados usaron criterios
y normas regionales y nacionales para evaluar la calidad fsico-qumica y
microbiolgica de las ACH. En la segunda mitad, las Naciones Unidas, mediante la
OMS, estableci estndares o normas internacionales para evaluar la calidad del
ACH, las cuales fueron promulgadas en 1958, 1963 y 1971. Sin embargo, estos
estndares se realizaban en pases desarrollados, los cuales contaban con
tecnologas avanzadas que impedan su real aplicacin en pases en desarrollo.
Debido a esta debilidad, la misma OMS estableci en 1984 las primeras "Guas
para la Calidad del Agua Potable"; una dcada despus publicaron la segunda
edicin y en el 2004 la tercera edicin. Estas tres ediciones tienen como objetivo
establecer los fundamentos cientficos, con el propsito de fijar valores guas
fsico-qumicos, microbiolgicos y biolgicos para que cada pas los adapte a sus
condiciones socioeconmicas, culturales, geogrficas y avances tecnolgicos, y
as se concreten normas nacionales para evaluar el ACH (Silva, 2004).

12

3. OBJETIVO
Determinar la presencia de bacterias Mesfilas Aerobias en una muestra de
agua potable por la tcnica de placa vertida.

4. MATERIALES Y REACTIVOS
Cantida

Descripcin

d
1

Muestra de agua potable de un volumen mnimo de 100 mL obtenida

3
9

en recipiente estril y con Tiosulfato de Sodio al 10%.

Tubos de ensayo conteniendo c/u 9 mL de agua de dilucin estril.
Cajas Petri conteniendo c/u de 13 mL de agar cuenta estndar

1
3
1
1
1 caja
1
1
1
1
1
4.875g

estril, mantenindolo a 45-47 C en bao de temperatura constante.

Gradilla.
Pipetas estriles de 1 mL graduadas en dcimas.
Esptula
Mechero Bunsen.
Cerillos.
Incubadora.
Contador de Colonias Quebec.
Charola para pesado
Propipeta de 3, 5, 10mL
Cinta egapack
Agar Cuenta Estndar
Etanol
Benzal
Tabla 1: materiales y reactivos a utilizar en la prctica.

5. PROCEDIMIENTO
En condiciones aspticas:
1. Agitar vigorosamente la muestra de agua, para homogeneizar.
2. Pipetear 1 mL de muestra y verterlo en el primer tubo con 9 mL de agua de
dilucinestril, quedando entonces una dilucin de 10-1.
3. Agitar para homogeneizar y tomar 1 mL de esta dilucin (10-1) y verterlo en el
segundo tubo, quedando una dilucin de 10-2.

13

4. Agitar para homogeneizar y tomar 1 mL de esta dilucin (10-2) y verterlo en el

tercer tubo, quedando una dilucin de 10-3.
5. Utilizando pipeta estril, tomar 1 mL de la dilucin 10-1 y verterlo en la caja Petri
estril marcada con 10-1, distribuyndolo bien en el fondo de la caja Petri vaca.
Efectuar esta misma operacin por triplicado.
6. De la misma manera, tomar 1 mL de la dilucin 10-2 y verterlo en la caja Petri
marcada con 10-2. Efectuar esta misma operacin por triplicado.
7. Hacer lo mismo con el tubo de la dilucin 10-3 y la caja marcada con 10-3.
Efectuar la misma operacin por triplicado. Es recomendable usar una pipeta
estril para cada dilucin.
8. Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja Petri el medio de cultivo
estril en el contenido en el frasco, a una temperatura mxima de 47 C (todava
lquido). Si la temperatura del agar es superior a 47C al vaciarlo a las cajas,
puede producirse la destruccin total parcial de las bacterias sembradas.
9. Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja mediante
movimientos de translacin y rotacin con 6 giros hacia la derecha y 6 giros hacia
la izquierda en una superficie plana aproximadamente durante 1 minuto evitando
que se mojen la tapa y los costados de la caja, de esta manera el agua y el agar
son mezclados ntimamente.
10. Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que solidifique el agar.
11. Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posicin invertida con
objeto de que el agua de condensacin del agar no caiga sobre la superficie del
cultivo.
Las condiciones de incubacin son: 37 C (1 C) durante 24 horas ( 3 h). Ahora
bien, si se desea conocer la flora bacteriana total de la muestra las condiciones
sern: 22 C (2 C), durante 72 horas (4h).

14

12. Transcurrido el tiempo de incubacin contar las colonias que se han

desarrollado en cada una de las placas, usando un cuentacolonias Quebec para
efecto de facilitar la lectura.
NOTA: Si la investigacin de mesfilos se practica a otro tipo de muestra de
agua que no sea potable, se procede a realizar los grados de dilucin necesarios,
dependiendo del origen de la misma, pero solo se trabajar con las ltimas tres
diluciones, procediendo de la misma forma descrita anteriormente pero incubando
durante 48 horas a 37 C (1 C).
Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:
Seleccionar las cajas que contengan entre 25 y 250 colonias y descartar las
otras.
Si son varias las que entran en este intervalo, contar todas y seleccionar las
del grado de dilucin por triplicado que represente menor margen de error
en el recuento y como resultado, tomar el promedio de las tres cajas y
referirlo al volumen real de muestra sembrado para efectos del clculo
correspondiente.
Si no hay ninguna caja con un recuento dentro del intervalo mencionado, se
har de aquella que tenga el valor ms prximo a cualquiera de los dos
extremos. En estos casos los resultados se tomarn como aproximados,
excepto en los casos de siembra de muestra directa donde se efectuar,
tambin el recuento en cajas con menos de 25 colonias.

Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la

incubadora, se pueden conservar las cajas dentro del refrigerador entre 5 y
10 C, durante un perodo mximo de 24 horas.

6. DIAGRAMAS

Pipetear 1 mL de muestra

15

Agitar vigorosamente la
muestra de agua, para
homogeneizar

Verter en el segundo
tubo (dilucin de 10-2).

Agitar para homogeneizar y tomar

1 mL de esta dilucin (10-1)

Agitar para homogeneizar y tomar

1 mL de esta dilucin (10-2)

Verter en el tercer tubo

(dilucin de 10-3).

Antes de que pasen 10

minutos, agregar a cada caja
Petri el medio de cultivo estril.
A temperatura mxima de 47
C, si excede esta temperatura
puede haber destruccin de
bacterias

Verter en el primer tubo con

9 mL de agua de dilucin
estril (dilucin de 10-1)

Utilizando pipeta estril, tomar 1

mL de la dilucin 10-1 y verterlo
en la caja Petri estril marcada
con 10-1.

Utilizando pipeta estril, tomar 1

mL de la dilucin 10-2 y verterlo
en la caja Petri estril marcada
con 10-2.

Utilizando pipeta estril, tomar 1

mL de la dilucin 10-3 y verterlo
en la caja Petri estril marcada
con 10-3.

Homogeneizar cada caja mediante

movimientos de translacin y rotacin
con 6 giros hacia la derecha y 6 giros
hacia la izquierda en una superficie

16

Efectuar
operacin
triplicado

por

Dejar reposar las cajas el

tiempo necesario para que
solidifique el agar

Las condiciones de incubacin

son: 37 C (1 C) durante 24
horas ( 3 h).

Incubar en posicin invertida con

objeto de que el agua de
condensacin del agar no caiga
sobre la superficie del cultivo.

Transcurrido el tiempo de incubacin

contar las colonias que se han
desarrollado en cada una de las placas,
usando un cuentacolonias Quebec.

7. CLCULOS
El Agar Cuenta Estndar requiere para ser preparado en un litro de agua
destilada 32.5g, para lo cual nosotros solo necesitbamos 150mL para el llenado
de 10 cajas Petri as que se hizo lo siguiente:
(150mL)*(32.5g)/1000mL=4.875g de medio Agar cuenta Estndar

8. RESULTADOS
Los resultados obtenidos se elaboran de la siguiente manera: Si la cantidad
de agua sembrada ha sido de 1 mL la expresin del resultado es directa. Si la
cantidad de agua sembrada ha sido de 0.1 mL, el nmero de colonias contadas
habr de dividirse por el volumen de muestra sembrada.
Para la dilucin de 10-1 se obtuvieron los siguientes resultados mostrados
en la figura 1 los cuales dan a conocer las UFC en caja.
17

Figura 1: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -1

Para la dilucin 10-2 se obtuvieron los siguientes resultados mostrados en la

figura 2 los cuales dan a conoces las UFC en caja.

Figura 2: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -2 en placa.

Para la dilucin 10-2 se obtuvieron los siguientes resultados mostrados en la

figura 3 los cuales dan a conoces las UFC caja.

Figura 3: UFC de bacterias mesfilas aerobias en la dilucin 10 -3 en placa.

18

8.1 PRESENTACION DE LOS RESULTADOS

Siguiendo la norma NMX-F-253-1977 las unidades formadoras de colonias
se dividen por su nmero de dilucin para obtener las UFC/mL, as que tenemos:
UFC
87
78
111
99
81
126

FACTOR DE DILUCION
UFC/mL
-1
10
870
10-1
780
-1
10
1110
10-2
9900
-2
10
8100
-3
10
126000
Tabla 2: Presentacin de resultados en UFC/mL

9. DISCUSIONES
Las cajas de Petri se prepararon con el medio de cultivo Agar cuenta
Estndar (Agar-Triptona Extracto de levadura), como lo marca la norma NMX-F253-1977 as como la norma mexicana NOM-092-SSA1-1994, ya que es un medio
general, que aporta los nutrimentos necesarios para el crecimiento bacteriano. Las
cajas fueron inoculadas con la muestra de agua para consumo humano (agua de
sabor horchata de venta en Nevera
y Peletera La Michoacana), y posteriormente incubadas a una temperatura de
37C ya que las bacterias mesfilas aerbicas son aquellas bacterias que se
desarrollan a una temperatura ptima de 35C (2C), de acuerdo con las norma
NOM-092-SSA1-1994.
De acuerdo a los resultados obtenidos, en la dilucin de 10 -1 las tres placas
entran en el intervalo de 25 a 250 colonias de acuerdo a lo sealado con la norma
oficial mexicana NOM-092-SSA1-1994. En lo que respecta en las diluciones de 102

y 10-3 existen placas que no entran dentro del rango indicado. En la dilucin 10 -2

existen solo 2 placas que entran en el rango establecido quedando una placa en
la cual se hace mencin que las unidades formadoras de colonias (UFC) es
incontable ya que excede el lmite mximo que es de 250 UFC. En las placas con
diluciones de 10-3 solo una placa entra en el rango aceptado mientras que las dos
placas restantes quedan fuera, ya que, una placa fue descartada por ser menor a
19

25 UFC y la otra placa es incontable al exceder el lmite de 250 UFC, esto de

acuerdo a la norma oficial mexicana consultada NOM-092-SSA1-1994, la cual nos
hace mencin a que si dentro del recuento de colonias existen placas que
excedan el lmite mximo (250UFC) estas placas sern presentadas con la
leyenda de incontables , mientras que, para las placas que su nmero de
recuento se menor a 25 UFC, dichas placas sern presentadas con la leyenda
descartada >25UFC.
Segn la norma NOM-127-SSA1-1994 marca que el lmite mximo
permisible de Coliformes totales y E. coli es de ausencia total de estos
microorganismos. Estas bacterias se encuentran dentro del grupo de mesfilas
aerobias, pues como ya se mencion, se desarrollan a 37C (2C). Como la
norma marca ausencia de coliformes totales y E. coli para agua embotellada y de
consumo humano, y siendo la muestra agua potable, deja a la expectativa la
posible contaminacin de estos, u otros microorganismos patgenos, causadas
por malas prcticas en la preparacin del agua analizada.

10. CONCLUSIONES
Se realiz la tcnica utilizada para el recuento de bacterias mesfilas
aerobias en placa, presentes en una muestra de agua para consumo humano
(agua de sabor horchata de venta en Nevera y Peletera La Michoacana),
siguiendo los lineamientos de la norma NOM-092-SSA1-1994. Encontrando, por lo
general, un nmero muy superior de UFC/mL de las que se esperaban. Ya que
segn la norma NOM-127-SSA1-1994 el nmero de coliformes totales y del
microorganismo E. coli debe ser ausente en agua potable; siendo estos
microorganismos pertenecientes al grupo de las bacterias mesfilas aerobias. Por
lo tanto, podemos concluir, que la excesiva cantidad de Unidades Formadoras de
Colonias por mililitro resultantes del mtodo para la cuenta de bacterias mesfilas
aerobias en placa, presentes en la muestra de agua potable, indica contaminacin
en dicha agua. Sin saber con exactitud la especie, o especies, de bacterias
presentes en dicha muestra. Se engloban todas aquellas bacterias que crecen
dentro de la temperatura de 35C (2C) y que presentan respiracin aerobia.
20

11. CUESTIONARIO
1. Consultar el significado de Cuenta Viable.
R= Es una tcnica que puede realizarce por cuenta en placa asi usa
principios fundamentales como: dispersin, sedimentacin, distribucin de
alcuotas.
2. Cules son las bacterias mesfilas aerobias?
R= Son aquellos microorganismos con afinidad por la temperatura
moderada de 35-40C
3. En qu otro tipo de muestras, adems de agua, se puede investigar la
presencia de mesfilas aerobias? Dar ejemplos.
R= En alimentos de origen marino y leche
4. De acuerdo a la normatividad mexicana vigente, Cul es el lmite mximo
permisible para bacterias mesfilas aerobias en agua purificada y
embotellada? Dar el nmero de norma.
R= coliformes totales <1.1 NMP/100mL segn la NOM-201-SSA1-202
5. Explicar con un ejemplo la investigacin de otro tipo de microorganismos
utilizando esta misma tcnica.
R= La cuenta viable de microorganismos del suelo realizada con esta
tcnica provee viabilidad microbiana, y es la ms adecuada para medios con
hidrocarburos.

12. ANEXOS
12.1 FICHAS TECNICAS
ALCOHOL ETILICO
Informacin de los componentes
Frmula: CH3CH2OH
Composicin: Etanol: 95.00 alcohlico
21

Grados de NFPA: Salud: 0 Inflamabilidad: 3 Reactividad: 0

Propiedades fsicas y qumicas
Apariencia: Lquido incoloro voltil de olor caracterstico y agradable.
Gravedad Especfica (Agua=1): 0.7893 / 20C
Punto de Ebullicin (C): 78 - 79
Densidad Relativa del Vapor (Aire=1): 1.60
Punto de Fusin (C): -114
Viscosidad (cp.): N.R.
Presin de Vapor (mm Hg): 44.0 / 20C
Solubilidad: Soluble en agua, alcohol metlico, ter, cloroformo, acetona y
benceno.
Informacin toxicolgica
DL50 (oral, ratas) = 7.06 g/kg.
Primeros auxilios
Inhalacin: Trasladar al aire fresco. Si no respira administrar respiracin artificial.
Si respira con dificultad suministrar oxgeno. Mantener la vctima abrigada y en
reposo. Buscar atencin mdica inmediatamente.
Ingestin: Lavar la boca con agua. Inducir al vmito. No administrar emticos,
carbn animal ni leche. Buscar atencin mdica inmediatamente (puede tratarse
de alcohol desnaturalizado).
Piel: Lavar la piel con abundante agua. Retirar la ropa contaminada y lvela con
abundante agua y jabn.
Ojos: Lavar con abundante agua, mnimo durante 15 minutos. Levantar y separar
los prpados para asegurar la remocin del qumico. Si la irritacin persiste
repetir el lavado. Buscar atencin mdica.
Medidas a tomar en caso de vertido accidental
Evacuar o aislar el rea de peligro. Eliminar toda fuente de ignicin. Restringir el
acceso a personas innecesarias y sin la debida proteccin. Ubicarse a favor del
viento. Usar equipo de proteccin personal. Ventilar el rea. No permitir que caiga
en fuentes de agua y alcantarillas. Si el derrame es pequeo dejarlo evaporar,
22

tambin se puede absorber con toallas de papel. Si es grande recolectar el lquido

con equipos que no desprendan chispas para evitar que se encienda.
Controles de exposicin/ proteccin personal
Uso Normal: Guantes largos, monogafas. Si es muy concentrado se puede usar
mscara con filtro para vapores, botas y overol.
Control de Emergencias: Ropa de proteccin total que incluya gafas de
seguridad,

guantes,

respirador

para

vapores.

Si

no

se

conocen

las

concentraciones o son muy altas use equipo de respiracin autnomo (SCBA).

Controles de Ingeniera: Ventilacin local y general, para asegurar que la
concentracin no exceda los lmites de exposicin ocupacional. Debe disponerse
de duchas y estaciones lavaojos.
Identificacin de los peligros
Altas concentraciones del vapor pueden causar somnolencia, tos, irritacin de los
ojos y el tracto respiratorio, dolor de cabeza y sntomas similares a la ingestin.
Inhalacin: Sensacin de quemadura. Acta al principio como estimulante
seguido de depresin, dolor de cabeza, visin borrosa, somnolencia e
inconsciencia. Grandes cantidades afectan el aparato gastrointestinal. Si es
desnaturalizado con metanol, puede causar ceguera.
Ingestin:
Piel: Resequedad.
Ojos: Irritacin, enrojecimiento, dolor, sensacin de quemadura.
A largo plazo produce efectos narcotizantes. Afecta el sistema nervioso central,
irrita la piel (dermatitis) y el tracto respiratorio superior. La ingestin crnica causa
cirrosis en el hgado.
Tabla 3: ficha reactiva para etanol

Bibliografa
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SOLUBILIZADORES. Bogot.

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