HQ de las Proteinas

Consideraciones bsicas
Qu son las proteinas?... Estas son macromoleculas ms abundantes que existen en nuestro organismo, presentan una gran cantidad de funciones, y
estas se dan dependiendo de la composicin y estructura de la proteina. Forman el 50 % del peso seco de la clula, y su constitucin esta basada en
estructuras monomricas llamados aminocidos, los cuales se unen covalentemente de forma especfica. Existen 20 aa y cada uno posee una cadena
lateral variable, la cual determina sus propiedades qumicas, y su nombre.
En general son insolubles en solventes orgnicos, pueden ser apolares o polares. Son clasificadas en 5 grupos segn su polaridad a pH 7.0 (pH
biolgico):
a)
b)
c)
d)
e)

Apolares alifticos: Alanina, valina, leucina, isoleucina, glicina, metionina, prolina.

Aromticos: Fenilalanina, tirosina, triptfano. Apolares
Polares sin carga: Serina, treonina, cisteina, prolina, aspargina y glutamina.
Cargados +: Lisina, arginina e histidina.
Cargados -: Aspartato y glutamato

Los aminocidos pueden actuar de distinta forma dependiendo el medio, a esta forma se le llama zwitterion (Ion bipolar). Estos pueden actuar como
cidos (donando protones) o como bsicos (aceptando protones).
Las proteinas pueden identificarse por medio de la HQ dividiendolas en dos grupos

En el caso de las proteinas simples podemos decir que al someterlas a hidrlisis se liberan solo aminocidos; pero en el caso de las conjugadas, al
someterlas a hidrlisis encontraremos aa+sustancias no proticas.
Ya entrando al estudio de las proteinas podemos encontrarlas clasificadas en:
a)
b)
c)
d)
e)

Identificacin de proteinas en general.

Identificacin de proteinas bsicas.
Identificacin considerando su anion o catin a distintos pH.
Mtodos estudio por su contenido en grupos amino.
Mtodos estudio de contenido en tirosina, triptfano, grupos SH y SS.

La identificacin de proteinas es posible realizarlas en tejidos frescos y tejidos incluidos parafina. An as la reactividad de algunos grupos en las
proteinas pueden verse alterados por la fijacin qumica. Los ms utilizados son los fijadores en base alcohlica, como el bouin y carnoy (no se
descarta metacarnoy).

El formaldehdo es aceptable, ya que la mayoria de las cadenas que estan enmascaradas pueden revertirse por efecto prolongado del agua. Es posible
utilizar cido pcrico y cloruro de Hg, excepto cuando queremos demostrar grupos sulfhidrilos. El xido crmico, el dicromato de potasio y el
glutaraldehdo tambien altera irreversiblemente la reactividad de los grupos sulfhidrilos.
Se debe tener en cuenta que si las proteinas tienen sus sitios de union enmascarados, es posible desenmascararlos por medio de reacciones
enzimticas.
Por ejemplo las proteasas, que son las ms utilizadas degradan por va hidroltica molculas proteicas a polipptidos ms sencillos.
Las proteasas mayormente utilizadas son:
-

Pepsina: jugo gstrico pH 1.5 y 2 Hidrlisis Fenilalanina + leucina + cido glutmico

Tripsina: pncreas pH 7 y 8 Hidrlisis arginina + lisina
Pronasa: streptomises griceus parecido a tripsina

Como el estudio proteico es complicado en general, es necesario producir cambios conformacionales en sus estructuras y bloqueos para no generar
reacciones cruzadas. Algunos de estos bloqueos son:
a) Acetilacin: bloqueo amino e hidroxilo con cido actico Media ( 3 hrs-37C- OH) y Completa ( 48 hrs-37C- OH y NH2)
b) Desaminacin: bloqueo amino con nitrito de sodio o nitrito de sodio 1N + cido actico 1N
c) Metilacin: bloqueo grupos carboxlicos y otros grupos cidos con metanol y cido clorhdrico Leve ( 4 hrs-37C- COOH) y Activa ( 4 hrs-60CCOOH y S)
d) Saponificacin: revierte metilacin y acetilacin (KOH 1%+OH absoluto x 30 min a TC ambiente)
e) Sulfonacin: introduccin esteres de sulfato en mucosustancias, permitiendo tincin con colorantes metacromticos ( cido actico
anhidro+cido sulfrico), osea, de hacer estudios de cidos nucleicos ni hablar.
f) Bromacin: bloqueo grupos etilnicos C=C (bromo+tetracloruro de carbono)
g) Dimedona: bloqueo aldehidos (CHO), excepto los formados a partir de la oxidacin por peryodato. De utilizacin para demostracin de
glicgeno, ya que se bloquean sustancias PAS + no glicognicas. Su aplicacin es post oxidacin dimedona 5%+alcohol 100x 3 hrs a 60C.
h) N-etilmaleimida: bloqueo de grupos SH por medio de la reaccin con los grupos tiol, transformandolos a grupos SS.

Mtodos de identificacin de proteinas

HQ proteinas

Reacciones
Generales:
Tien globalmente
proteinas,
identificandolas
como tales

Reacciones de
grupo:
Caracterizan un
corto nmero de
grupos reactivos de
las proteinas

R. para diferenciar
proteinas entre si

Solubilizacin
diferencial
- Existen proteinas
que son insolubles
en ciertos
solventes, por
ejemplo la
Albmina v/s
Globulina (ins. en
agua

Segun su caracter
electropolar
- Punto isoelctrico

Accin de enzimas
proteolticas
-Elastasa pH 10.3
--> Elastina
- Colagenasa pH 6.8
--> colgeno,
gelatina y reticulina
Acidofilia Total:
Colorantes cido a
pH cido
Fast green pH 1.2

Proteinas bsicas:
Colorantes cidos a
un pH bsico
Biebrich scarlet pH
9.5 para histonas.

Ninhidrina de Schiff
Desaminacin oxidativa
media (Grupos amino x
carbonilos) Solo cerca
de grupo metilo y
radical cido.
Determinar grupos
carbonilos por reactivo
de Schiff

Ph regulado:
Determinacin
aparente de una
proteina fijada
Fast Green / Azul de
metileno

Reacciones
especficas:
Identifica grupos
funcionales
especficos de los
aminocidos

Azocopulacin

Diazoica
- Mtodo en el cual
utilizamos las sales de
diazonio las cuales
tienen la capacidad de
reaccionar con grupos
fenoles y aminas
aromticas, dando
lugar a
azocompuestos.

Otras reacciones

Tetrazoica
- Reacciones en las
cuales se utiliza la
Bencidina tetrazoada,
la cual a un pH 9.2 se
une a aa de caracter
cclico, dando como
resultado un
colorante con
intensidad cromtica
baja, luego se agrega
naftol para producir
una 2da copulacin
fuerte y coloreada
dependiendo del
naftol (beta o
disulfrico

Grupo indol
(triptfano)

Grupo guadinino
(arginina)

Reaccin
Azocopulacin
(tirosina-triptofanohistidina)

Grupo carboxilo
(cido asprticocido glutmico)

Grupo sulfhidrilo
(cisteina)

Reaccin
xanpronteica
(compuestos
fenlicos)

grupo amino (lisina)

Grupo fenol
( tirosina)

1) Reaccin Sakaguchi para arginina: es una prueba que se raliza para evidenciar la presencia de arginina por medio del grupo
guanadina. Se utiliza para proteinas en general, ya que casi todas contienen arginina, su coloracin positiva es roja. Los
componentes son Hidroxido de sodio 40%+naftol+hipoclorito de sodio 2%.
2) Reaccin ferrocianuro para cisteina
3) Reaccin de millon para tirosina: era utilizada para la deteccin de tirosina por medio de dos reactivos, Hg+HNO3, esto produce
nitrato de mercurio, el cual interactua con los grupos OH de la tirosina tiendose de color rojo anaranjado.
4) Reaccin DMAB para triptofano: es un mtodo antiguamente realizado para la identificacin de triptofano, esta reaccin era
posible obtenerla por medio de la obtencin de Beta carbolina oxidada por el nitrito sdico.