Anda di halaman 1dari 62

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II

Disusun oleh :
Saraswati Desi Nahari
0621-12-025

PROGRAM STUDI KIMIA


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PAKUAN
BOGOR
2015

PERCOBAAN I
FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KECEPATAN
REAKSI ENZIM

1.1 Tujuan Percobaan


Mengetahui dan membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzim dipengaruhi
oleh berbagai faktor, seperti pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat
dan zat antiseptik.
1.2 Dasar Teori
Enzim merupakan suatu protein dan dihasilkan oleh sel hidup yang
mempunyai fungsi biologis tertentu. Enzim bekerja dalam mengkatalisis reaksi
kimia(biokimia) yang berlangsung di dalam sel makhluk hidup. Salah satu
contom enzim adalah -amylase (dikenal juga sebagai enzim ptyalin) yang
berperan dalam mengkatalisis reaksi pemecahan pati menjadi molekul
penyusunnya yang lebih sederhana. Enzim ini dihasilkansecara alami di mulut
bersam-sama dengan air liur (saliva).
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor-faktor tersebut
menentukan efektifitas kerja suatu enzim. Apabila faktor pendukung tersebut
berada pada kondisi optimum, maka kerja enzim juga akan maksimal.
Beberapa faktor yang mempengaruhi kerja enzim adalah sebagai berikut.
a. Konsentrasi substrat.
Enzim mempunyai spesifitas yang tinggi. Apabila substrat cocok dengan
enzim maka kinerja enzim juga akan optimal.
b. pH (keasaman).
Enzim mempunyai kesukaan pada pH tertentu. Terdapat enzim
yangoptimal kerjanya pada kondisi asam, namun ada juga yang optimal
pada kondisibasa. Namun kebanyakan enzim bekerja optimal pada pH
netral.
c. Konsentrasi enzim.
Konsentrasi enzim berbanding lurus denganefektivitas kerja enzim.
Semakin tinggi konsentrasi maka kerja enzim akansemakin baik dan
cepat.
d. Suhu
2

Seperti halnya dengan pH, semua enzim mempunyai kisaran suhu


optimum untuk kerjanya.
1.3 Alat dan Bahan
1.3.1 Alat
Tabung reaksi dan pipet tetes
Penangas Air
1.3.2 Bahan
Iod 0,05 M
HCl 0,4 %
Asam Laktat 0,1 %
Na2CO3 1 %
Pati 1 %
CaC2O4 1 N
Toluena
CHCl3
Fenol 5 %
Sublimat 1 %
CaCl2 1 N
1.4 Prosedur Kerja
a. Pengaruh pH
1. Dimasukan ke dalam masing masing 4 buah tabung reaksi berturut
turut 2 mL HCl 0,4 %; asma Laktat 0,1 %; 2 mL NaCO 3 1 %. Diukur
pH keempat tabung reaksi.
2. Ditambahkan ke dalam tiap tabung reaksi 2 mL pati 1 % air liur.
3. Dicampur dengan baik dan disimpan didalam penangas air 37 0C
selama 15 menit.
4. Diangkat semua tabung reaksi dan isinya dibagi menjadi 2 bagian.
Satu bagian untuk uji Iod dan satu bagian lagi untuk uji Benedict.
b. Pengaruh Suhu
1. Dimasukan ke dalam masing masing 4 buah tabung reaksi 5 mL
susu segar, kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi yang lain
yang masing masing 1 mL larutan renin 0,5 %. Semuanya ada 4
pasang tabung reaksi.
2. Dimasukan pasangan tabung reaksi pertama ke dalam gelas piala yang
berisi es, tabung reaksi kedua ke dalam penangas air 37 0C, tabung
reaksi ketiga 75 800C dan biarkan pasangan tabung reaksi keempat
pada suhu kamar.

3. Setelah beberapa menit, catatlah suhu sebenarnya untuk tiap pasangan


tabung reaksi.
4. Dituangkan larutan

Renin

kedalam

susu

pasangannya,

dan

dicampurkan dengan baik.


5. Diamati apa yang terjadi setiap 1 2 menit selama 5 menit. Pada
pasangan tabung reaksi yang mana penggumpalan susu terjadi paling
cepat. Amati susu yang belum menggumpal samapi 30 menit sambil
memeriksanya setiap beberapa menit.
1.5 Data Pengamatan
1.5.1

Pengaruh pH
Substrat: Larutan pati 1%
Enzim: -amylase (dari air liur manusia)
Waktu pengamatan: 15 menit.
Suhu inkubasi
No
Larutan
pH
Hasil Uji Iod
.

Hasil Uji Benedict

1.

HCl 0,4 %

1,48

Biru

Warna larutan tidak berubah


(biru)

2.

Asam Laktat
0,1 %

2,98

Tak berwarna

Warna larutan hijau, endapan


merah bata

3.

Air Suling

6,20

Tak berwarna

Warna larutan hijau, endapan


merah bata

4.

Na2CO3 1 %

10,84

Tak berwarna

Warna larutan hijau kebiruan,


tidak terbentuk endapan

1.5.2

Pengaruh Suhu

Substrat: Larutan pati 1%


Enzim: -amylase (dari air liur manusia)
Waktu pengamatan: 1, 2, 3, 4, 5, dan 15 menit.
Suh
Menit
Hasil Uji Iod
Hasil Uji Benedict
u
keEs
Warna Iod
5
Hijau tua, endapan merah bata
terencerkan
10
Warna Iod
Hijau tua, endapan merah bata
terencerkan

15
20
25
30
5
10
Suhu
Ruan
g

15
20
25
30
5
10
15

37 C
20
25
30
7080oC

5
10
15
20
25
30

Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna Iod
terencerkan
Warna biru tua
pekat
Warna biru tua
pekat
Warna biru tua
pekat
Warna biru tua
pekat
Warna biru tua
pekat
Warna biru tua

Hijau tua, larutan merah,


merah bata
Hijau tua, larutan merah,
merah bata
Hijau tua, larutan merah,
merah bata
Hijau tua, larutan merah,
merah bata

end.
end.
end.
end.

Hijau tua
Hijau tua, endapan merah bata
Hijau tua, endapan merah bata
Kuning kehijauan, end. merah
bata
Kuning kehijauan, end. merah
bata
Kuning kehijauan, end. merah
bata
Hijau tua, endapan merah bata
Hijau tua, endapan merah bata
Hijau tua, endapan merah bata
Hijau tua, endapan merah bata
Kuning kehijauan, end. merah
bata
Kuning kehijauan, end. merah
bata
Warna larutan tidak berubah (biru
muda)
Warna larutan tidak berubah (biru
muda)
Warna larutan tidak berubah (biru
muda)
Warna larutan tidak berubah (biru
muda)
Warna larutan tidak berubah (biru
muda)
Warna larutan tidak berubah (biru

pekat

muda)

1.6 Pembahasan
Enzim adalah protein yang mengkatalisa reaksi kimawi spesifik. Enzim
mengikat molekul substrat membentuk komplek enzim-substrat yang bersifat
sementara, yang terurai membentuk enzim bebas dan produknya. Bilamana
konsentrasi substrat S meningkat, aktivitas katalitik konsentrasi enzim E
tertentu akan meningkat mengikuti pola hiperbolik mendekati kecematan
maksimum Vmaks-nya yang khas. Pada saat semua enzim berada dalam bentuk
kompleks ES, dan karenanya, jenuh oleh S. Konsentrasi substrat yang
mencapai setengah Vmaksadalah tetapan Michaelis-Menten KM, yang bersifat
khas bagi masing-masing enzim yang bekerja pada substrat tertentu. Grafik
hubungan antara kecepatan reaksi enzim dengan konsentrasi substrat
ditampilkan pada gambar 1.

Gambar 1 Grafik hubungan antara kecepatan reaksi enzim dan konenstrasi


substrat.
Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan
aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat
gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim
berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan.
Meningkatnya temperatur sistem menyebabkan meningkatnya energi
kinetik sistem sehingga terjadi perubahan pada laju reaksi. Pada saat molekul
bertumbukan, energi kinetic molekul dapat diubah menadi energi potensial
kimia molekul. Jika energi potensial kimia mencapai jumlah yang memadai,
6

energi aktivasi reaksi eksorgenik dapat dicapai dan perubahan kimia akan
terjadi sehingga semakin besar energi kinetik molekul sistem, amakan akan
semakin besar energi potensial kimia yang dihasilkan pada saat dua molekul
bertumbukan. Dalam usaha mengubah substrat menjadi produk, enzim harus
melakukan tumbukan dan mengikat substrat ke sisi katalitik. Meningkatnya
temperature sistem akan meningkatkan jumlah tumbukan antara enzim
dengan substrat per menit sehingga laju reaksi akan meningkat.
Semakin meningkatnya temperatur, energi internal molekul pada sistem
akan meningkat. Energi internal molekul mencakup energi translasi, vibrasi
dan rotasi molekul, energiyang terlibat dalam ikatan kimia molekul serta
energi yang terlibat dalam interaksi anti-ikatan. Beberapa panas tersebut
dapat diubah menjadi energi potensial kimia. Jika peningkatan energi
potemsial kimia cukup besar, maka beberapa ikatan lemah yang menjaga
struktur tiga dimensi protein aktif akan rusak. Hal tersebut akan memicu
denaturasi termal protein sehingga protein menjadi inaktivasi. Panas yang
berlebihan ini menyebabkan laju katalisis enzim menurun karena enzim atau
substrat menjadi terdenaturasi dan bersifat inaktif.
1.7 Simpulan
Segala sesuatu yang mempengaruhi struktur tersier protein akan
mempengaruhi kecepatan reaksi enzim. Akibat pengaruh pH terhadap
kecepatan reaksi suatu enzim ada beberapa macam, tergantung sifat
enzimnya. Pada kebanyakan sistem kecepatan reaksi enzim meningkat
dengan kenaikan suhu dan akhirnya enzim kehilangan semua aktivitas karena
protein menjadi rusak akibat panas. Kecepatan reaksi enzim mula-mula
meningkat dengan bertambahnya konsnetrasi substrat sehingga bila
konsentrasi substrat dinaikkan lebih lanjut akan tercapai kecepatan
maksimum.
1.8 Daftar Pustaka
Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

PERCOBAAN II
PENENTUAN AKTIVITAS -AMILASE

2.1 Tujuan Percobaan


Menganalisis aktifitas amylase yang berasal dari air liur dengan metode
spektrofotometri dengan menggunakan larutan pati sebagai substrat.
2.2 Dasar Teori
Terdapat dua jenis enzim amylase di alam, yaitu -amilase dan amilase. Enzim -amilase ditemukan pada bakteri dan getah atau cairan yang
dikeluarkan oleh hewan dan manusia, seperti air liur, darah, urin dan getah
pankreas, sedangkan -amilase ditemukan pada tanaman tingkat tinggi.
Fungsi -amilase adalah mengkatalisis penguraian hidrolitik ikatan -(1,4)glikosida pada suatu polisakarida.
Dasar dari percobaan ini adalah cairan yang diamati aktifitas enzim amilasenya diinkubasikan bersama dengan subtratnya berupa larutan pati atau
amilum dalam buffer pada penangas air bersuhu 40 C selama 30 menit.
Hasil penguraian pati yang bersifat sebagai reduktor dapat ditetapkan
kadarnya sebagai glukosa secara spektrofotometri.
2.3 Alat dan Bahan
2.3.1 Alat
a.
b.
c.
d.

Tabung reaksi dan pipet tetes


Penangas air
Labu ukur
Spektrofotometer

2.3.2 Bahan

a. Substrat tepung
Ditambahkan 100 mL dapar fosfat pada 1,5 g tepung yang dapat larut
(Soluble Starch) dan dididihkan selama 3 menit. Dinginkan dan
ditambahkan dapar fosfat sampai volumenya menjadi 140 mL.
b. H2SO4 0,67 N
c. Natrium Wolframat
d. Pereaksi Tembaga
9

Dilarutkan 40 g Na2CO3 anhidrat dalam 400 mL air, ditambahkan 7,5


g Asam tartrat. Setelah larut ditambahkan 4,5 g CuSO 4 5H2O,
dicampur dengan baik dan diencerkan sampai 1 L.
e. Pereaksi asam fosfomolibdat
Dicampurkan 70 g Natrium molibdat dan 10 g Natrium Wolframat
dengan 400 mL NaOH 10 % dan 200 mL air. Dinginkan selama 40
menit sampai semua NH3 menguap dan ditambahkan asam fosfat.
f. Standard Glukosa
Dilarutkan 1 % glukosa dijenuhkan dengan asam benzoat dan
disimpan dalam lemari es. Dari larutan ini (1 mL : 10 mg) dapat
dibuat larutan yang lebih encer.

g. Dapar fosfat 0,1 M pH 7,0


Dilarutkan 4,55 KH2PO4 dalam 1 L air.
2.4 Prosedur Kerja

1. Dimasukan 1 mL serum atau 0,5 mL urin dan 0,5 mL NaCl 0,85 % ke


dalam tabung reaksi pertama (kontrol).
2. Dimasukan 7 mL subsrat ke dalam tabung reaksi kedua.
3. Disimpan kedua tabung reaksi daam thermostat 400C.
4. Setelah 5 menit ditambahkan 1 mL serum atau 0,5 mL urin dan 0,5 mL
NaCl 0,85 % kedalam tabung reaksi kedua.
5. Setelah 30 menit ambil kedua tabung reaksi dari thermostat dan
ditambahkan 1,5 mL H2SO4 0,67 N pada tiap tabung. Dicampur dengan
baik dan ditambahkan 0,5 mL Natrium Wolfram 10 %.
6. Ditambahkan 7 mL substrat dalam tabung control dan campur dengan
baik.
7. Sentrifurge dan saring kedua larutan, kemudian ditetapkan kadar Zat
reduki di dalam filtratnya dengan cara Folin Wu untuk glukosa sebagai
berikut :
a. Dipipet masing masing larutan di bawah ini dan dimasukan ke
dalam tabung Folin Wu:
$ Blanko Pereaksi : 2 mL
(Blanko pereaksi = 7 mL Substrat + 0,5 mL Natrium Wolfram 10
% + 1,5 mL H2SO4 0,67 N + 1 mL H2O)
$ Standar Glukosa = 2 mL
(Standar Glukosa = 7 mL Substrat + 0,5 mL Natrium Wolfram +
1,5 mL H2SO4 0,67 N + 1 mL satndar glukosa 2 mg glukosa/mL)

10

$ Larutan yang diperiksa = 2 mL


$ Kontrol
= 2 mL
b. Ditambahkan 2 mL pereaksi tembaga pada tiap tiap tabung reaksi
dan campur dengan baik.
c. Disimpan semua tabung reaksi ke dalam air mendidih selama 6
menit. Ditambahkan 2 mL asam pospomolibdat dan dilanjutkan
pemanasan selama 2 menit.
d. Dimasukan semua tabung ke dalam air dingin dan setelah dingin
ditambahkan air sampai garis sampai garis 25 mL dan dicampur
dengan baik.
e. Dibaca Absorbansi larutan standar, larutan control dan larutan yang
diselidiki terhadap blanko pereaksi pada panjang gelombang 420
nm.
2.4 Data Pengamatan
2.5.1 Konsentrasi standar glukosa
Konsentrasi
(mg/L)

Absorbansi

0,180

0,256

0,388

2.5.2 Absorbansi larutan kontrol


Kontrol 1
Kontrol 2

0,597
0,149

2.5.3 Absorbansi larutan contoh


Contoh 1

0,272

Contoh 2

0,830

2.5.4 Kurva Kalibrasi

11

Kurva Kalibrasi
0.45
0.4
0.35
f(x) = 0.05x + 0.01
R = 0.98
0.3
0.25
Absorbansi 0.2
0.15
0.1
0.05
0
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5

Linear ()

Konsentrasi

Jumlah glukosa (mg/100 mL saliva) dapat dihitung dengan menggunakan

rumus:

AS 2 100
AS ml saliva yang digunakan . Untuk kontrol, AS diubah menjadi

AC.
Unit enzim amilase (u/100 mL saliva) dapat dihitung dengan menggunakan
mengurangi jumlah glukosa kontrol (mg/100 mL kontrol) dikurangi jumlah
glukosa saliva (mg/100 mL kontrol).
Perhitungan Aktifitas -Amilase
Kontrol
konsentrasi
Abs standard
Abs kontrol
(mg/100 ml
kontrol)
0,16
177,78
0,18
0,149
165,56
Average
171,67
Sample
Abs standard
0,18

Abs Sample
0,272
0,83

konsentrasi
(mg/100 ml
contoh)
302,22
922,22

12

Average

612,22

Aktifitas Amilase
Larutan
control

No
1
2
Average

Larutan contoh

177,78
165,56
171,67

Unit Amilase/100 ml

302,22
922,22
612,22

124,44
756,67
440,56

2.6 Pembahasan
Pati terutama terdapat dalam jumlah tinggi pada golongan umbi, seperti
kentang, dan semua biji-bijian, seperti jagung, tetapi kemamupuan
membentuk pati dijumpai pada hampir semua sel tanaman. Pati mengandung
dua jenis polimer glukosa, -amilase dan amilopektin. -amilase terdiri dari
rantai unit-unit D-glukosa yang panjang dan tidak bercabang, digabungkan
oleh ikatan (14). Rantai ini beragam dalam berat molekulnya, dari
beberapa ribu sampai 500.000. Amilopektin juga memiliki berat molekul
yang

tinggi,

tetapi

strukturnya

bercabang.

Ikatan

glikosidik

yang

menggabungkan residu glukosa yang berdekatan di dalam rantai amilopektin


adalah (14), tetapi titik percabangan amilopektin merupakan ikatan
(16).
Glikogen dan pati dihidrolisa di dalam saluran pencernaan oleh enzim
amilase , yang disekresikan ke dalam saluran pencernaan. Cairan air liur dan
pankreas mengandung -amilase, yang menghidrolisis ikatan (14) pada
cabang sebelah luar glikogen dan emilopektin, menghasilkan D-glukosa,
sejumlah kecil maltose, dan suatu inti yang tahan hidrolisis, disebut limit
dekstrin. Dekstrin membentuk dasar dari pasta perekat. Limit dekstrin tidak
dihidrolisis lebih jauh oleh -amilase, yang tidak dapat memecahkan ikatan
(16) pada titik-titik cabang. Untuk menguraikan ikatan ini, diperlukan
suatu enzim pemecah cabang, (16)-glukosidase. Enzim ini dapat
menghidrolisis ikatan cabang, jadi, membuka pengikat cabang berikatan

13

(14) lain terhadap aktivitas -amilase. Serangkaian titik-titik cabang lain


dicapai, yang kembali diuraikan oleh (16)-glukosidase. Aktivitas
gabungan -amilase dan (16)-glukosidase oleh karenanya, dapat
menguraikan gikogen dan amilopektin secara sempurna menjadi glukosa dan
sejumlah kecil maltosa.
2.7 Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa air liur contoh I
memiliki aktivitas -amilase yang jauh lebih tinggi dibandingakan dengan air
liur Contoh II dalam menghidrolisis pati menjadi D-glukosa.
2.8 Daftar Pustaka
Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

14

PERCOBAAN III
ANALISIS KUALITATIF DARAH

3.1 Tujuan Percobaan


Menganalisis sifat hemoglobin dalam darah melalui uji kualitatif.
3.2 Dasar Teori
Warna merah di dalam darah disebabkan adanya pigmen yang disebut
hemoglobin yang merupakan protein terkonjugasi yang merupakan
kombinasi satu buah molekul globin dan empat buah molekul heme.
Hemoglobin mengandung dua rantai a dan dua rantai b serta empat gugus
heme yang masing-masing berikatan dengan rantai polipeptida. Maisngmasing gugus heme dapat mengikat satu molekul oksigen secara reversible.

Gambar 2 Molekul hemoglobin.

Hemoglobin yang bereaksi dengan oksigen akan menyebabkan


terjadinya pergeseran spektrum absorpsi dan perubahan warna darah dari
merah gelap menjadi merah terang sehingga terbentuk oksihemoglobin. Besi
yang terdapat dalam molekul hemoglobin tidak teroksidasi menjadi bentuk
feri dengan adanya oksigen sehingga perlu ditambahkan ferisianiada agar
terbentuk methemoglobin. Methemoglobin tidak dapat lama bereaksi dengan
oksigen maupun karbonmonoksida membentuk karboksihemoglobin. Pada
saat darah dikocok di udara akan terbentuk oksihemoglobin sehingga bila
15

ditambahkan pereaksi Stokes untuk menghilangkan oksigen secara sempurna,


maka dihasilkan hemoglobin.

Gambar 3 Struktur hemoglobin.

3.3 Alat dan Bahan


3.3.1 Alat
a.
b.
c.
d.

Tabung reaksi
Penangas air
Labu ukur
Spektrofotometer

3.3.2 Bahan
a. Darah dan Air suling
b. Pereaksi Stokes
FeSO4 20 g/L dan Asam tartrat 30 g/L, ditambahkan ammonia
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.

sebelum digunakan
K3Fe(CN)6 33%
NH4OH dan NaOH 10 %
H2O2
O Toluidin dalam asam asetat glacial
Benzidin dalam asam asetat glacial
Fenolftalein yang direduksi
Natrium tungstat 10 %
Larutan tembaga alkalis
Dilarutkan 40 g Na2CO3 anhidrat, 7,5 g asam tartrat dan 4,5 g CuSO 4

dalam 400 mL air.


k. Pereaksi asam fosfomolibdat yang mengandung asam molibdat 35 g dan
natrium tungstat 5 g + 200 mL NaOH 10 % Aquadest, dipanaskan 30
menit, didinginkan + 350 mL air asam fosfat.
l. Larutan glukosa standar 0,1 mg/mL dan 0,2 mg/mL.
3.4 Prosedur Kerja

16

1. Oksihemoglobin and Hemoglobin


a. Diencerkan 2 mL darah dengan kira kira 6 mL air dalam tabung
reaksi, diaduk dengan baik dan diperhatikan warna cerah dari
oksihemoglobin.
b. Dituangkan separuh dari larutan ini ke dalam tabung reaksi yang lain
dan simpan sebagai kontrol.
c. Kedalam tabung reaksi ketiga masukan 2 mL pereaksi Stokes dan
ditambahkan amonium hidroksida secukupnya untuk melarutkan
endapan yang segera terbentuk, larutan ini merupakan pereduksi kuat.
d. Ditambahkan beberapa tetes pereaksi ini atau ammonium sulfida ke
dalam larutan oksihemoglobin. Hasilnya adalah hemoglobin yang
mereduksi.
e. Diaduk tabung hemoglobin yang direduksi ini supaya menjadi
oksehemoglobin dengan perantara zat pereduksi itu dan oksigenkan
kembali seperti sebelumnya.
2. Methemoglobin
a. Diulangi percobaan 2.1.4 dengan menggunakan larutan kalium
ferricianida 33 % yang baru dibuat sebagai pengganti aliran gas. Ini
akan mengoksidasikan hemoglobin itu menjadi mhetemoglobin.
Perhatikan warnanya ! Ujilah dengan pereaksi Stokes beramoniak
atau amonium sulfida.
b. Kedalam 3 mL darah tambahan 3 mL air suling dan hangatkan
perlahan lahan, kemudian ditambahkan 6 mL kalium ferrisianida
33 %. Dicampur bolak balik dan perhatikan gelembung
gelembung oksigen yang bebas.
3. Uji Fenolftalein yang direduksi
Kedalam beberapa tetes darah encer didalam tabung reaksi ditambahkan kira
kira 2 mL air, kemudian ditambahkan 2 mL H2O2

3 % dan 2 3

tetes arutan fenolftalein yang direduksi. Warna merah jambu atau


merah yang terbentuk menunjukan reaksi positif.
3.5 Data Pengamatan
1. Oksihemoglobin dan Hemoglobin

17

N
o
1
2

Sampel

Hasil Pengamatan

Darah + air
Darah + air + Stokes

Larutan merah cerah


Larutan merah gelap

2. Methemoglobin
N
o
1
2
3

Sampel

Hasil Pengamatan

Darah + air
Darah + air + K3Fe(CN)6
+ Stokes
Darah + air + K3Fe(CN)6

Larutan merah cerah


Larutan merah gelap Larutan
merah cerah
Larutan merah cerah Larutan
merah gelap Larutan coklat
jernih + gelembung O2

3. Uji Fenolftalein yang direduksi


Darah + air + H2O2 3 % + (PP + bisulfit) : Larutan merah cerah merah
muda
3.6 Pembahasan
Hemoglobin merupakan protein yang ditemukan dalam sel darah merah,
mengadung satu atom besi (Fe) dan berfungsi I sebagai pengangkut utama O2
molekular di dalam darah pada hewan dan manusia. Hemoglobin
mengangkut O2 dari paru-paru dan mengedarkannya ke seluruh jaringan
untuk digunakan oleh sel dan kembali lagi ke paru-paru untuk membawa
lebih banyak oksigen. Keadaan saat hemoglobin membawa O2 disebut
oksihemoglobin

dan

keadaan

tidak

membawa

oksigen

disebut

deoksihemoglobin. Baik deoksi- maupun oksihemoglobin memiliki warna


yang berbeda dan hal inilah yang menyebabkan darah pada pembuluh arteri
(oksihemoglobin) lebih cerah dibandingkan darah dalam pembuluh vena.
Oksigen berikatan dengan atom besi pada grup heme karena oksigen
mempunyai pasangan electron bebas yang dapat berkoordinasi dengan atom
besi.

18

Gambar 4 Pengikatan oksigen oleh atom besi pada heme.


Karena setiap protein hemoglobin memiliki empat buah subunit yang
mana setiapnya memiliki satu unit heme, sehingga satu unit hemoglobin
dapat berikatan dengan empat molekul O2 dengan langkah sebagai berikut.

Reaksi antara hemoglobin dengan O2 ternjadi dalam waktu yang


sangat cepat (hanya 1/10 detik). Saat satu molekul O2 berikatan, bentuk
hemoglobin akan berubah dan akan meyebabkan O2 selanjutnya akan lebih
mudah untuk berikatan. Hemoglobin membawa O2 ke pembuluh kapiler
yang akan melepaskannya untuk digunakan oleh jaringan tubuh. Dalam
pembuluh

daram

kapiler

terdapat

molekul

yang

disebut

2,3-

bisfosfogliserat (BPG) akan masuk ke dalam molekul deoksihemoglobin


untuk mencegah O2 berikatan kembali sehingga O2 yang dilepaskan ke
jaringan alan tetap di jaringan. 2,3-BPG akan berinteraksi dengan
deoksihemoglobin dan mengubah bentuknya sehingga deoksihemoglobin
tidak akan membawa O2 lagi.

Gambar 5 Struktur hemoglobin dengan 2,3-DPG.

19

Molekul hemoglobin yang mengandung atom besi dalam bentuk


ferro dengan muatan +2 dapat teroksidasi menjadi bentuk ferric dengan
muatan +3 yang disebut methemoglobin dan bersifat inaktif dalam proses
transfer oksigen. Karena bentuk ferric tidak dibutuhkan oleh tubuh, maka
enzim

yang

disebut

diaphorase

digunakan

untuk

mereduksikan

methemoglobin menjadi bentuk ferro (Fe2+) hemoglobin yang dapat


membawa O2.

Pengujian Kastle-Mayer digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa


warna yang tampak itu adalah darah. Fenolftailein tereduksi dijaga dalam
suasana basa dengan adanya logam seng (Zn) sehingga menghasilkan
larutan yang tidak berwarna. Oksidasi dengan hemoglobin dan peroksida
menyebabkan perubahan warna menjadi warna merah muda yang
menyala. Adanya warna pink mengindikasikan keberadaan hemoglobin
yang mengkatalisis pemecahan hidrogen peroksida yang ditujukan pada
gambar di bawah ini.

Gambar 6 Oksidasi fenolftailein oleh hemoglobin dan peroksida.


3.7 Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, dapat diketahui beberapa sifat fisik yang
dapat diamati pada hemoglobin jika dikondisikan dengan penambahan
pereaksi tertentu, seperti pengikatan dan pelepasan O 2 (oksi- dan
deoksihemoglobin), oksidasi atom besi (methemoglobin), dan uji keberadaan
darah menggunakan fenolftailein yang tereduksi.

20

3.8 Daftar Pustaka


Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

21

PERCOBAAN IV
PENENTUAN KADAR KALSIUM DALAM SERUM DAN KADAR Fe
DARAH

4.1 Tujuan Percobaan


Menentukan kadar kalsium serum darah titrasi permangnometri serta
kadar Fe darah dengan metode spektrofotometri
4.2 Dasar Teori
Kalsium adalah sebuah elemen kimia dengan simbol Ca dan nomor
atom 20. Mempunyai massa atom 40.078 amu. Kalsium merupakan salah
satu logam alkali tanah, dan merupakan elemen terabaikan kelima
terbanyak di bumi. Kalsium juga merupakan ion terabaikan kelima
terbanyak di air laut dilihat dari segi molaritas dan massanya, setelah
natrium, klorida, magnesium, dan sulfat.
Kalsium adalah mineral yang amat penting bagi manusia, antara lain
bagi metabolisme tubuh, penghubung antar saraf, kerja jantung, dan
pergerakan otot.
Besi dalam molekul hemoglobin di dalam darah dideteksi melalui
pengaruh asam sulfat pekat yang menguraikannya dibantu dengan adanya
kalium persulfat. Protein darah lalu diendapkan dengan asam tungsten dan
larutan kemudian disaring. Warna yang dihasilkan dari kalium tiosianat
dibandingkan dengan larutan standar besi menggunakan cara yang sama.
4.3 Alat dan Bahan
4.3.1 Alat
a. Tabung reaksi dan pipet tetes
b. Penangas Air
c. Labu ukur
d. Spektrofotometer
e. Buret
f. Erlenmeyer
4.3.2 Bahan
a. Serum darah
b. H2SO4 1 N
c. Ammonium Oksalat 4 %
22

Dilarutkan 0,4 g ammonium oksalat dalam 10 mL air


d. Air amoniak
Campur NH4OH pekat dengan 50 mL air
e. Larutan KMnO4 0,0025 N
Dipipet 5 mL KMnO4 0,1 N, kemudian dimasukan labu ukur 200
mL, ditambahkan air sampai batas
f. Larutan KMnO4 0,1 N
Ditimbang 0,316 g KMnO4 dan ditambahkan air hingga volume
g.
h.
i.

j.
k.

10 mL
H2C2O4 0,0025 N
Larutan Standar Fe
H2SO4 (p)
Kalium persulfat
KCNS 3 N

Na-tungstat 10 %
3.4 Prosedur Kerja
a. Penentuan Kadar Ca Serum Darah
1. Dipipet 2 mL serum ke dalam tabung sentrifuge
2. Ditambahkan 2 mL air dan larutan ammonia oksalat 4 % tetes demi
tetes.
3. Dicampurkan isinya dan bolak balik tabung, dibiarkan 30 menit
4. Dikocok dan sintrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 15000
rpm
5. Dituangkan supernatannya dengan hati hati
6. Dibiarkan tabung dalam posisi terbalik selama 5 menit
7. Dikeringkan mulut tabung dengan kertas saring
8. Dicuci endapan dengan 3 mL larutan ammonia 2 %, sentrifuge lagi
selama 7 menit, dituangkan supernatannya dan dibiarkan mengering,
selama 5 menit. Diulangi pencucian sekali lagi.
9. Ditambahkan 2 mL H2SO4 1 N, dikocok sampai endapannya larut,
ditempatkan di atas penangas air mendidih selama 1 menit.
10. Dititrasi dalam keadaan panas dengan larutan KMnO4 0,0025 N
sampai cair, berwarna merah muda. KMnO4 dibakukan dengan 10
mL larutan baku H2C2O4 0,0025 N dipanaskan pada suhu

23

(70 27 )0C (bila perlu tabung diletakan dalam penangas air).


Dititrasi dilakukan dengan buret mikro.
11. Blanko ditetapkan dengan titrasi terhadap 2 mL air dan 2 mL
H2SO4 1 N.
12. Dihitung kadar kalsium serum dalam mg % b/v.
b. Penentuan Kadar Fe dalam Darah
Pembuatan Kurva Kalibrasi
1. Pada labu ukur 25 mL masukkan dengan menggunakan buret
masing-masing 1, 2, 3, 5, 8, 10 dan 15 mL larutan standar Fe
2. Pada masing-masing labu ukur tambahkan 0.4 mL asam sulfat
pekat dan encerkan sampai kira-kira 15 mL dengan air
3. Tambahkan 1 mL K-Persulfat jenuh dan campur
4. Pada labu 0 tambahkan 4 mL KCNS 3 N, encerkan sampai tanda
batas dengan air, tutup dan kocok. Pindahkan pada kuvet, atur
transmitan 100% pada panjang gelombang 520 nm
5. Pada labu 1 tambahkan 4 mL KCNS 3 N, encerkan sampai tanda
batas dengan air, tutup, kocok dan diamkan selama 3 menit
6. Bilas kuvet 2 kali dengan larutan pada labu 1, isi kuvet dan baca
absorbansinya
7. Penambahan KCNS 3 N dilanjutkan pada masing-masing labu
berturut-turut
8. Gambarkan kurva kalibrasi dengan konsentrasi masing-masing
adalah 0.5, 10, 15, 25, 40, 50 dan 75 ng/100m L
Penentuan Kadar Fe dalam Darah
1. Tambahkan 2 mL asam sulfat pekat bebas Fe kedalam 0.5 mL
darah (dalam labu ukur 25 mL), kocok selama 2 menit
2. Tambahkan 2 mL K Persulfat, campur dan dinginkan sampai kira
kira 15 mL dengan air
3. Tambahkan 3 mL Na-Tungstat 10%, campur dan dinginkan
dibawah aliran air

24

4. Encerkan sampai tanda batas, tutup dan kocok lalu simpan kirakira 5 menit
5. Saring dengan kertas saring, filtratnya dipipet sebanyak 10 mL
dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL (Hb)
6. Kedalam labu Hb dan labu kosong (B) dimasukkan 0.4 mL asam
sulfat pekat, encerkan sampai kira-kira 15 mL
7. Tambahkan 1 mL K-Persulfat jenuh, kocok
8. Pada labu B, tambahkan 4 mL KCNS, encerkan sampai tanda batas
9. Pindahkan larutan pada kuvet dan atur transmitan 100% pada
panjang gelombang 520 nm
10. Tambahkan 4 mL KCNS 3 N pada labu Gb, encerkan sampai tanda
batas
11. Bilas kuvet 2 kali, isi dan baca absorbansinya setelah 3 menit
penambahan reagen warna
Hitung kadar Fe dalam darah dengan bantuan kurva titrasipersulfat
jenuh. Selanjutnya labu Hb dan labu B ditambahkan 4 ml larutan kaliaun
tiosianat 3N dan diencerkan dengan air suling hingga mencapai tanda tera.
Diamati nilai absorbansi larutan pada panjang gelombang 520 nm
menggunakan spektrofotometer UV-VIS dan larutan dalam labu B digunakan
sebagai blanko. Dibuat larutan deret standar Fe dengan beberapa ragam
konsentrasi menggunakan cara yang sama.

4.5 Data Pengamatan


Grafik hubungan antara konsentrasi (dalam ppm) standar garam ferri
dengan absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm dapat dilihat pada
grafik 1.
1. Kurva Kalibrasi
ppm standar Fe
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

Absorbansi
0,000
0,033
0,062
0,097
0,116
0,143

25

Kurva Kalibrasi
0.2
0.15
Abs

f(x) = 0.14x + 0
0.1 R = 0.99

0.05
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

ppm std Fe

2. Kadar Fe dalam Darah


Absorbansi sampel darah 5 ml
Absorbansi sampel darah 10 ml

: 0,018 A
: 0,052 A

3. Perhitungan
Y
= aX + b
Keterangan :
Y
= Absorbansi
X
= Konsentrasi
X

=b+Y
a
= 0,018 0,003
0,142
= 0,106 ppm (5 mL)

= 0,052 0,003
0,142
= 0,345 ppm (10 mL)

4.6 Pembahasan
Total besi ditetapkan dengan mengoksidasikan ferro (Fe2+) menjadi
ferric (Fe3+) menggunakan kalium persulfat. Kompleks tiosianat dan Fe3+
akan terbentuk pada suasana asam berdasarkan persamaan reaksi:

26

4.7 Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan, diperoleh konsentrasi
logam besi dalam sampel darah adalah (5 mL) 0,106 ppm dan (10 mL)
0,345 ppm
4.8 Daftar Pustaka
Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

PERCOBAAN V
KINETIKA REAKSI ENZIMATIS

5.1 Tujuan
1. Dapat memahami prinsip kinetika reaksi enzim dan faktor yang
mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim.
2. Menentukan waktu suatu reaksi Enzimatis
3. Menghitung Km dan Vmaks melalui variasi
5.2 Teori Dasar
Protein merupakan polimer asam amino dimana masing masing
unit monomer dihubungkan satu sama lain melalui ikatan peptida. Senyawa
protein mempunyai fungsi yang berbeda beda.
1. Katalis

= Enzim

27

2. Hormon

= Pengatur Aktifitas Sel

3. Struktural

= Membran Sel, jaringan penghubung

4. Kontraksi

= Miosin (suatu protein kontraktif otot)

5. Pelindung

= Antibodi

Enzim dapat digolongkan ke dalam dua kelompok:


1. Enzim sederhana yaitu yang mengikuti kinetika Michaelis Menten.
2. Enzim kompleks atau Allosterik yaitu yang tidak mengikuti kinetika
Michaelis Menten.
E + S

E + S

E.P

E +P

Enzim mengkatalisis hampir semua reaksi-reaksi biologis penting.


Oleh karena itu bagi ahli kesehatan pengetahuan mengenai sifat-sifat kimia
dan fungsi enzim sangat diperlukan apabila akan mempergunakan nya
dalam prosedur diagnosa. Beberapa cabang ilmu kesehatan telah
memperoleh manfaat dari pemakaian analisis enzim ini, seperti pada
penyakit infark miokardial, hepatitis, kanker prostat, penyakit penyumbat
hati. Aktivitas enzim pada beberapa penyakit mungkin tinggi dan pada
beberapa yang lainnya mungkin rendah. Proses uji enzim juga menjadi
semakin penting pada pemeriksaan genetik, karena dapat dipakai untuk
mendeteksi pembawa heterozigot penyakit penyakit keturunan seperti
fenilketonuria. Telah diketahui dengan jelasbahwa enzim jaringan
didistribusikan dengan cara yang terorganisasi baik; sel bukan hanya
meruipakan kantong longgar enzim. Namun hasil dari reaksi enzim dalam
satu komponen jaringan akan mempunyai pengaruh cukup besar pada
proses enzim lain pada komponen yang lainnya dalam jaringan tersebut atau
bahkan pada jaringan yang lainnya sama sekali. Pengetahuan yang lebih
mendalam mengenai distribusi enzim didlaam sel menjadi sangat penting
guna pemahaman mekanisme penyakit beserta terapinya. (Mentgomery,Rex.
1993).
Enzim adalah biokatalis yang diproduksi oleh jaringan hidup dan
dapat meningkatkan laju reaksi yang mungkin terjadi dalam jaringan.
Enzim bekerja dengan urutan yang teratur. Bila reaksi berjalan tanpa adanya
enzim, maka reaksi akan berjalan lambat. Misal CO 2 bereaksi dengan H2O
28

membentuk asam karbonat, sebagian daripadanya pada suatu pH fisiologis


akan terionisasi dan membentuk ion bikarbonat. Disosiasi ini tentunya tidak
tergantung pada katalisis enzim, tapi merupakan sifat struktur asam itu
sendiri.
H2O + CO2 HCO3 H+ + HCO3Penguraian asam karbonat tapa melalui katalisis menjadi H 2O dan
CO2 tidak terjasi seketika. karena laju reaksi ini dalam kenyataanya sangat
lambat, keseimbangan mungkin tidak akan tercapai dalam 1 jam. Jika
diambil contoh air karbonat lalu ditambahkan enzim anhhidrase kabonat,
maka keseimbangan akan tercapai dalam 1 menit. Sel darah merah dalam
tubuh sangat kaya memacu perubahan CO2 menjadi bikarbonat melalui
bentuk perantara asam karbonatyang terdisosiasi. (Mentgomery,Rex. 1993).
Enzim adalah Katalis Biologis yang dapat meningkatkan laju reaksi
sampai lebih dari 106 kali. Dan dua sifat dasarnya yaitu peningkatan laju
reaksi dengan tanpa perubahan pada enzim dan peningkatan laju reaksi
tanpa perubahan keseimbangan (equilibrium) serta penurunan energi
aktivasi.

Laju Reaksi kimia :


Perubahan konsentrasi per unit waktu
(mol l1 s1)
Reaksi katalitik enzimatis:
turnover per unit waktu, katal (kat, mol s1).
International unit U (mol turnover min1;
29

1 U = 16.7 nkat).

Pada enzim faktor-faktor yang mempengaruhi konduksi optimum


enzim ialah pH, Suhu, konsentrasi substrat dan enzim, Inhibitor, Aktivator.
Penambahan substrat dengan konsentrasi tinggi akan meningkatkan kerja
enzim. Karena enzim akan tepat berikatan dengan substrat, dan bila substrat
lebih banyak maka tidak jadi masalah karena bila terjadi tumbukan, akan
terjadi antara substrat dan substrat saat waktu bersamaan. Berbeda hal
dengan penambahan substrat konsentrasi kecil, maka akan terjadi tumbukan
antara substrat lama dan dengan yang baru untuk berikatan dengan enzim.
Sehingga aktivitas enzim akan terganggu. Aktivator pada enzim dapat
berupa koenzim atau kofaktor. Kofaktor ini berupa aktivator anorganik dan
koenzim berupa aktivator organik. Dibawah ini tabel beberapa kofactor
Enzyme.
Cofaktor

Enzim

Coenzyme
Thiamine pyrophosphate
Flavin adenine nucleotide
Nicotinamide adenine dinucleotide
Pyridoxal phosphate
Coenzyme A (CoA)
Biotin
5 -Deoxyadenosyl cobalamin
Tetrahydrofolate
Metal
Zn2+
Zn2+
Mg2+
Mg2+
Ni2+
Mo
Se
Mn2+
K+

OH
O P = O
OH

Fosfatase
H2O
R

Pyruvate dehydrogenase
Monoamine oxidase
Lactate dehydrogenase
Glycogen phosphorylase
Acetyl CoA carboxylase
Pyruvate carboxylase
Methylmalonyl mutase
Thymidylate synthase
Carbonic anhydrase
Carboxypeptidase
EcoRV
Hexokinase
Urease
Nitrate reductase
Glutathione peroxidase
Superoxide dismutase
Propionyl CoA carboxylase

OH

+ HO

OH
P = O
OH

30

R adalah zat organik dimana gugus fosfat terikat kepadanya.


Fosfatase asam bekerja sangat baik pada pH rendah, dalam percobaan
ini pH 5,0 sebagai substrat digunakan substrat buatan yang tidak berwarna
yang akan beubah menjadi warna kuning dengan terlepasnya gugus fosfat.

5.3 Alat dan Bahan


1. Alat
a. Batang pengaduk
b. Corong kaca
c. Kertas saring
d. Pipet tetes
e. Pipet ukur 1 mL; 5 mL; 10 mL
f. Stopwatch
g. Tabung reaksi
h. Water bath 35 0C
2. Bahan
a. Aquadest
b. 4 Nitrofenol
c. Buffer sitrat 100 mM pH 5,0
d. Na2CO3 1,0 M
e. N Nitrofenol Fosfat
f. Enzim Asam Fosfatase
5.4 Prosedur Kerja
1. Tabung t = 0 menit
Larutan dapar posfat dan tripsin dimasukkan kedalam tabung reaksi serta
ditambahkan masing-masing 3 mL larutan TCA 20 %, diaduk perlahan
dan diinkubasi 30 menit pada water bath 35 C. Kemudian ditambahkan
larutan kasein sesuai tabel dan didiamkan 20 mL dalam lemari es. Lalu
disentrifugasi 10 menit dan saring melalui kertas saring untuk diambil
supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson.
2. Tabung t = 20 menit
Diinkubasi 5 menit pada water bath 35 0C masing masing tabung
berpengaduk yang berisi kasein sesuai tabel sambil diaduk. Kemudian
ditambahkan berturut-turut larutan buffer posfat dan larutan tripsin.
Diinkubasikan selama 20 menit pada inkubator 350C dihitung setelah
penambahan tripsin. Dihentikan reaksi dengan penambahan 3 mL TCA
31

20 % kedalam masing-masing tabung dan diaduk sangat kuat. Lalu


Didiamkan selama 20 menit dalam air es untuk menyempurnakan
pengendapan. Dan disentrifugasi selama 10 menit kemudian disaring
untuk diambil supernatannya. Filtrat dilakukan metode anson, yaitu
dicampurkan 2mL TCA-Filtrat dengan 4 mL NaOH 0.5 M kemudian
ditambahkan 1 mL larutan Folin-Ciocalteu ( 1 volume reagen ditambah
1 volume aquadest). Kemudian diamkan 10 menit dan ditetapkan
serapannya 650 nm.
5.5 Data Pengamatan
Tabung

Penambahan Larutan
buffer fosfat, tripsin,
dan TCA 20%

Perlakuan yang dilakukan


Diinkubasi dan diberi
Larutan kasein

Larutan berwarna putih


dan setelah ditambah TCA
menjadi putih bening

Larutan berwarna putih


keruh dan terdapat sedikit
endapan disekeliling tabung

II

Larutan berwarna putih


dan setelah ditambah TCA
menjadi putih bening

Larutan berwarna putih


keruh dan terdapat sedikit
endapan disekeliling tabung

III

Larutan berwarna putih


dan setelah ditambah TCA
menjadi putih bening

Larutan berwarna putih


keruh dan terdapat endapan
disekeliling tabung tetapi
tidak terlalu banyak

IV

Larutan berwarna putih


dan setelah ditambah TCA
menjadi putih bening

Larutan berwarna putih


keruh dan terdapat banyak
endapan disekeliling tabung

Larutan berwarna putih


dan setelah ditambah TCA
menjadi putih bening

Larutan berwarna putih


keruh dan terdapat endapan
disekeliling tabung tetapi
tidak terlalu banyak

Tabung

NaOH 0,5 M

Perlakuan yang dilakukan


Reagen Folin-Ciocalteu + Aquadest

Sentrifugasi dan
disaring
Larutan
menjadi
berwarna putih agak
bening, namun setelah
disaring menjadi sangat
bening
Larutan
menjadi
berwarna putih agak
bening, namun setelah
disaring menjadi sangat
bening
Larutan
menjadi
berwarna putih agak
bening, namun setelah
disaring menjadi sangat
bening
Larutan
menjadi
berwarna putih agak
bening, namun setelah
disaring menjadi sangat
bening
Larutan
menjadi
berwarna putih agak
bening, namun setelah
disaring menjadi sangat
bening

Penentuan Nilai
Absorbansi

32

menggunakan
Spektrofotometer
I

Larutan
berwarna
putih bening

II

Larutan
berwarna
putih bening

III

Larutan
berwarna
putih bening

IV

Larutan
berwarna
putih bening

Larutan
berwarna
putih bening

Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas


berwarna putih bening dan dibagian bawah
berwarna kuning, namun setelah diaduk
larutan menjadi homogen dan berwarna
kuning
Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas
berwarna putih bening dan dibagian bawah
berwarna kuning, namun setelah diaduk
larutan menjadi homogen dan berwarna
kuning
Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas
berwarna putih bening dan dibagian bawah
berwarna kuning, namun setelah diaduk
larutan menjadi homogen dan berwarna
kuning
Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas
berwarna putih bening dan dibagian bawah
berwarna kuning, namun setelah diaduk
larutan menjadi homogen dan berwarna
kuning
Larutan menjadi 2 lapisan, dibagian atas
berwarna putih bening dan dibagian bawah
berwarna kuning, namun setelah diaduk
larutan menjadi homogen dan berwarna
kuning

Penambahan Larutan buffer fosfat dan tripsin

0,050

0,051

0,060

0,069

0,060

Setelah ditambahkan TCA 20%

Setelah Disentrifuge

Ditambah Larutan Kasein

33

Ditambahkan Reagen Folin-Ciocalteu dan Aquadest


5.6 Perhitungan

Perhitungan Absorbansi
AI = At20 At0

AII = At20 At0

= 0,071 0,050

= 0,081 0,051

= 0,021
AIII

= 0,030

= At20 At0

AIV

= At20 At0

= 0,084 0,060

= 0,208 0,069

= 0,024

= 0,139

Perhitungan Kecepatan
t = t20 t0 = 20

VI =

A
t
0,021
20

= 1,05 10-3 mmol/menit

VIII

A
t

0,024
20

= 1,2 10-3 mmol/menit

VII

A
t

0,03
20

= 1,5 10-3 mmol/menit

VIV =

A
t
0,139
20

= 6,95 10-3 mmol/menit

34

Perhitungan Konsentrasi Substrat


aliquot
V total

SI =

0,1
7

2%

SII =

0,02

= 0,2857 10-3 mmol

SIII

aliquot
V total

1
7

0,02

0,5
7

2%

0,02

= 1,4286 10-3 mmol

2%

aliquot
V total

3
7

0,02

SIV

= 2,8571 10-3 mmol

aliquot
V total

2%

= 8,5714 10-3 mmol

Tabel Hasil dan Grafik


Tabel Machelis Menten

V(mmol/menit)
1,05 10-3
1,5 10-3
1,2 10-3
6,95 10-3

[S] (mmol)
0,2857 10-3
1,4286 10-3
2,8571 10-3
8,5714 10-3

Tabel Linewever-Burk
1
V (menit/mmol)
952,3810
666,6667
833,3333
143,8849

1
[S ] (1/mmol)

3500,1750
699,9860
350,0053
116,6671

35

1200
1000

f(x) = 0.15x + 479.61


R = 0.41

800
600

1/V

400
200
0
0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

1/(S)

Gr
afik Lineweaver Burk

y = ax + b, dimana a =

Km
Vmax , b =

1
Vmax

Pada grafik, diketahui y = 0,1452x + 479,61


=

1
Vmax

479,61 =

1
Vmax

Vmax =

1
479,61

36

Vmax = 2,085 10-3 mmol/menit

Km
Vmax

Km
2,085 103

0,1452 =
Km

= 3,0274 10-3

5.7 Pembahasan
Pada praktikum mengenai kinetika reaksi enzim ini pengerjaan dibagi
menjadi 2 bagian waktu, yaitu t = 0 dan t = 20. Perbedaanya yaitu terletak
pada pengerjaan t = 0 pemberian kasein dilakukan terakhir setelah buffer,
tripsin serta TCA (tri karbocxylat acid). Pada t=20 kasein dimasukkan
diawal agar terlihat reaksi awal yang terjadi pada kasein. Maka kasein ini
akan aktif diawal reaksi sampai akhirnya diberikan TCA diakhir.
Mekanisme Reaksi enzimatis yaitu dengan enzim dapat bereaksi
dengan beberapa cara, meski demikian hampir semuanya dengan penurunan
G :
Penurunan Energi Aktivasi dengan pembentukan kondisi yang cocok
untuk stabilisasi keadaan transisi (transition-state). Misal: perubahan
struktrur substrat, terjadi perubahan konformasi

molekul, enzim

mendistorsi menjadi bentuk bentuk transisi, sehingga mengurangi


energi yang diperlukan untuk penyempurnaan reaksi.

Penurunan energi transition-state, tapi tanpa distorsi substrat, dengan


merubah kondisi distribusi muatan yang berlawanan dengan transition
state.

Pembentukan jalur (metabolisme) alternative.

Contoh: bereaksi

temporer dengan substrat membentuk ES kompleks intermediate, yang


tak mungkin berlangsung tanpa enzim.
Penurunan perubahan entropi reaksi (H), dengan mengikat substrat
koreksi orientasi reaksi.

37

Aktivitas enzim ternyata dipengaruhi banyak faktor. Faktor-faktor


tersebut menentukan efektivitas kerja suatu enzim. Apabila faktor
pendukung tersebut berada pada kondisi yang optimum, maka kerja enzim
juga akan maksimal. Beberapa faktor yang mempengaruhi kerja enzim:
a. Substrat Enzim mempunyai spesifitas yang tinggi. Apabila substrat
cocok dengan enzim maka kinerja enzim juga akan optimal.
b. pH (keasaman) Enzim mempunyai kesukaan pada pH tertentu. Ada
enzim yang optimal kerjanya pada kondisi asam, namun ada juga yang
optimal pada kondisi basa. Namun kebanyakan enzim bekerja optimal
pada pH netral.
c. Waktu Waktu kontak/reaksi antara enzim dan substrat menentukan
efektivitas kerja enzim. Semakin lama waktu reaksi maka kerja enzim
juga akan semakin optimum.
d. Konsentrasi / jumlah enzim Konsentrasi enzim berbanding lurus
dengan efektivitas kerja enzim. Semakin tinggi konsentrasi maka kerja
enzim akan semakin baik dan cepat.
e. Suhu Seperti juga pH. Semua enzim mempunyai kisaran suhu optimum
untuk kerjanya.

38

f. Produk Akhir Reaksi enzimatis selalu melibatkan 2 hal, yaitu substrat


dan produk akhir. Dalam beberapa hal produk akhir ternyata dapat
menurunkan produktivitas kerja enzim.
Enzim

tripsin memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang

menyebabkan aktivitas maksimal. Pemberi atau penerima proton yang


penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingkat ionisasi yang
diinginkan. pH optimum enzim tidak perlu sama dengan pH lingkungan
normalnya, dengan pH yang mungkin sedikit berada diatas atau dibawah
pH optimum. Aktivitas katalitik

enzim didalam sel mungkin diatur

sebagian oleh perubahan pada pH medium lingkungan.


Digunakan larutan dapar fosfat yaitu agar enzim tripsin tetap pada
kondisi optimum yaitu bekerja secara maksimal untuk berikatan dengan
substrat. Disini tripsin akan efektif bekerja pada pH 7.7 - 8 sesuai
tempatnya
Tabel beberapa pH optimum pada enzim ( Thenawijaya, Maggy. 1982 )
Enzim
Pepsin
Tripsin
Katalase
Arginase
Fumarase
Ribonukleas

pH optimum
1.5
7.7
7.6
9.7
7.8
7.8

e
tempatnya berada yaitu didalam usus. Aktivitas enzim juga berhubungan
dengan keadaan ionik molekul terutama pada bagian proteinnya, karena
rantai polipeptida mengandung kelompok-kelompok yang bisa mengion
sampai ke satu tingkat yang tergantung pada pH yang ada. Seperti halnya
yang berlaku pada protein umumnya. Enzim memiliki titik isoelektrik
dengan muatan bebas bersihnya adalah nol. pH pada titik isoelektrik,
sebagian patokan, berbeda dengan pH pada waktu aktivitas maksimal. pH
optimal yang diperlihatkan pada tiap enzim berbeda-beda. Kebanyakan
enzim menpunyai pH optimal antara 4-8, namun pada beberapa enzim yang
bekerja baik pada daerah pH yang sempit. Jika enzim diberi pada pH yang

39

ekstrim maka akan terdenaturasi. Kepekan enzim terhadap perubahan suhu


merupakan salah satu sebab mengapa pengaturan pH tubuh dilakukan
dengan sangat cermat. (Mentgomery,Rex. 1993)
TCA(Tri carboxylat acid) yang merupakan agen yang dapat
mempresipitasi enzim agar dapat menghentikan rekasi enzimatik sehingga
enzim menjadi in aktiv dan enzim akan kehilangan fungsi katalitiknya.
Kemudian diinkubasikan pada suhu 350C sesuai suhu tubuh yaitu protein
kasein ditemukan. Lalu pada pengerjaan t=0 setelah proses pencampuran
reagen didiamkan dalam es yaitu agar proses presipitasi menjadi lancar.
Lalu disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pelletnya. filtartnya
diambil untuk di uji dengan metode anson.
Salah satu kontribusi utama Henri-Michaelis-Menten pada kinetika
enzim adalah memandang reaksi enzim sebagai dua tahapan. Pada tahap
pertama, subtrat terikat ke enzim secara reversible, membentuk kompleks
enzim-substrat. Kompleks ini kadang-kadang disebut sebagai kompleks
Michaelis. Enzim kemudian mengatalisasi reaksi kimia dan melepaskan
produk.

Kurva kejenuhan suatu reaksi enzim yang menunjukkan relasi antara konsentrasi
substrat (S) dengan kelajuan (v). Enzim dapat mengatalisasi reaksi dengan
kelajuan mencapai jutaan reaksi per detik. Sebagai contoh, tanpa keberadaan
enzim, reaksi yang dikatalisasi oleh enzim orotidina 5'-fosfat dekarboksilase akan
memerlukan waktu 78 juta tahun untuk mengubah 50% substrat menjadi produk.

40

Namun, apabila enzim tersebut ditambahkan, proses ini hanya memerlukan waktu
25 milidetik.
Laju reaksi bergantung pada kondisi larutan dan konsentrasi substrat.
Kondisi-kondisi yang menyebabkan denaturasi protein seperti temperatur tinggi,
konsentrasi garam yang tinggi, dan nilai pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah
akan menghilangkan aktivitas enzim. Sedangkan peningkatan konsentrasi substrat
cenderung meningkatkan aktivitasnya. Untuk menentukan kelajuan maksimum
suatu

reaksi

enzimatik,

konsentrasi

substrat

ditingkatkan

sampai

laju

pembentukan produk yang terpantau menjadi konstan. Hal ini ditunjukkan oleh
kurva kejenuhan di samping. Kejenuhan terjadi karena seiring dengan
meningkatnya konsentrasi substrat, semakin banyak enzim bebas yang diubah
menjadi kompleks substrate-enzim ES. Pada kelajuan yang maksimum (Vmax),
semua tapak aktif enzim akan berikatan dengan substrat, dan jumlah kompleks ES
adalah sama dengan jumlah total enzim yang ada. Namun, Vmax hanyalah salah
satu konstanta kinetika enzim. Jumlah substrat yang diperlukan untuk mencapai
nilai kelajuan reaksi tertentu jugalah penting.
Tabel mengenai beberapa Km dari enzim
Enzyme

Substrate

Km

Chymotrypsin

Acetyl-l-tryptophanamide

5000

Lysozyme

Hexa-N-acetylglucosamine

D-Galactosidase

Lactose

4000

Threonine deaminase

Threonine

5000

Carbonic anhydrase

CO2

8000

Penicillinase

Benzylpenicillin

Pyruvate carboxylase

Pyruvate

50
400

HCO3 Arginine-tRNA synthetase

1000

ATP

60

Arginine

tRNA

0.4

ATP

300

41

Pendekatan kinetika enzym:


Asumsi I : Hipotesa pseudo-steady-state. Pembentukan ikatan Enzim Substrat
mengalami kejenuhan ( steady state) perubahan [ES] menjadi sangat lambat
(limit 0) dibanding laju pembentukan [P] dan penurunan [S]. Dapat ditulis dalam
persamaan berikut :
d ES
k1 E S k 1 ES k 2 ES
dt
[ES] adalah selisih antara laju pembentukan ES dikurangi laju pengurangan ES
v

d P
k 2 ES
dt

Asumsi II :

Konsentrasi Enzym jumlah [E]0

tidak berubah fungsi waktu

(konstan), ini adalah jumlah ( [E] ) enzym bebas [E] dan enzym terikat substrat
[ES].
Maka ditulis sebagai berikut

[E] = [E]0 - [ES]


k1[E] [S] [ES](k-1+k2) = 0

Substitusi [E] kedalam


persamaan
(2),
k1 [S] ( [E]
[ES] )
0 -didapat
persamaan sbb:

[ES](k-

+k2) = 0

k1 [S] [E]0 = k1 [S] [ES] - [ES]


(k-1+k2)
42

Asumsi kejenuhan (steady state)


Fase transien terjadi ketika konsentrasi ES tidak berubah

d ES
0
dt
d P

dt

k 2 ES

vo

t 0

k 2 E T S
K M S

V0 adalah laju reaksi inisial saat reaksi start

vo

Vmax S
K M S

Dan

Vmax

adalah

laju

reaksi

maksimum

Suatu cara yang baik untuk mengevaluasi Km da Vmax adalah


memplot data kinatik sebagai perbandingan terbalik dari V dan konsentrasi
S. Plot perbandingan ini diajukan oleh hans lineweaver dan dean burk.
Perbandingan terbalik dari persamaan michaelis-menten dapat diambil
sebagai berikut :

1
Km
1
1
=
x
+
v Vmax S Vmax

Resiplokal plot ini mempunyai keuntungan karena tidak perlu


mengukur V pada konsentrasi substrat yang sangat tinggi (sering sulit
untuk didapat secara eksperimental) karena konsentrasi substrat dapat
diramalkan kemungkinan nya dari nilai 1/ S = 0.

43

Kemudian metode anson yaitu adanya penentuan konsentrasi produk


yang dihasilkan dari reaksi tripsin-kasein menggunakan spektrofotometer.
metode ini bertujuan supaya jumlah substrat bisa di ketahui yang di katalisis
oleh enzim. Penambahan NaOH untuk menetralkan filtrate TCA yang
bersifat asam dan di tambahkan juga folin-ciocalteu yang berfungsi
memberikan warna untuk pembacaan absorbansi pada spektrfotometer.
Komposisi Fenol Reagent (Folin Ciocalteu)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Sulfat Lithium, monohidrat


Klorida ACID
Sodium tungstat dihidrat
Fosfor acid
Sodium molibdat
Brom
Air

5.8 Kesimpulan
1. Kerja enzim dipengaruhi konsentrasi substrat, pH dan suhu.
2. Tripsin mempunyai pH optimum 7,7 8.
3. Metode praktikum kinetika enzim dilakukan 3 metode, yaitu metode
michaelis-menten, lineweuver-burk dan metode anson.
4. Nilai absorbansi yang dihasilkan dari t=0 dan t=20 menunjukkan
peningkatan.
5. Warna yang dihasilkan dari produk reaksi enzimatis tripsin-kasein
adalah warna kehijauan.
6. Produk dari reaksi enzim

tripsin-kasein

mempunyai

panjang

gelombang maksimum 650 nm.


7. Grafik lineweuver-burk yang dihasilkan dari praktikum ini tidak linier
atau tidak lurus.
Nilai Vmax = 2,085 10-3 mmol/menit
9. Nilai Km
= 3,0274 10-3
8.

5.9 Daftar Pustaka


Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

44

PERCOBAAN VI
PENETAPAN KADAR PATI DENGAN METODE LUFF SCHOORL
6.1 Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan untuk menetapkan kadar pati pada


sampel yang digunakan dan mempelajari proses penetapan kadar pati
dengan metode Luff Schoorl.
6.2 Dasar Teori

1. Pati
Pati atau amilum adalah karbohidrat kompleks yang tidak larut
dalam air, berwujud bubuk putih, tawar dan tidak berbau. Pati
merupakan bahan utama yang dihasilkan oleh tumbuhan untuk
menyimpan kelebihan glukosa (sebagai produk fotosintesis) dalam
jangka panjang. Hewan dan manusia juga menjadikan pati sebagai
sumber energi yang penting. Pati tersusun dari dua macam karbohidrat,
amilosa dan amilopektin, dalam komposisi yang berbeda-beda. Amilosa
memberikan sifat keras (pera) sedangkan amilopektin menyebabkan sifat
lengket. Amilosa memberikan warna ungu pekat pada tes iodin
sedangkan amilopektin tidak bereaksi (Aulana 2005).

2. Tepung Beras
Tepung beras mengandung pati beras, protein, vitamin, dan lainlain bahan yang terkandung pada butir beras. Orang bisa juga
mendapatkan tepung yang merupakan campuran dua atau lebih pati. Kata
tepung lebih berkaitan dengan komoditas ekonomis. Tepung beras
merupakan bahan pokok yang sangat penting dalam pembuatan kue-kue
Indonesia. Dengan munculnya tepung beras yang halus dan kering
dipasaran, maka tepung beras untuk pembuatan kue-kue sangat mudah
untuk didapat. Kualitas kue yang dibuat dari tepung beras yang baru
ditumbuk lebih baik dibandingkan dengan kue yang dibuat dari tepung

45

beras kering yang banyak dijual dipasaran (Aulana 2005). Berdasarkan


DKBM (2004), kadar pati dalam tepung beras sebesar 80 gram.

3. Gula Pereduksi
Gula pereduksi yaitu monosakarida dan disakarida kecuali sukrosa
dapat ditunjukkan dengan pereaksi Fehling atau Benedict menghasilkan
endapan merah bata (Cu2O). Selain pereaksi Benedict dan Fehling, gula
pereduksi juga bereaksi positif dengan pereaksi Tollens (Apriyanto
1989). Penentuan gula pereduksi selama ini dilakukan dengan metode
pengukuran konvensional seperti metode osmometri, polarimetri, dan
refraktrometri maupun berdasarkan reaksi gugus fungsional dari
senyawa sakarida tersebut (seperti metode Luff-Schoorl, Seliwanoff,
Nelson-Somogyi dan lain-lain).
Hasil analisisnya adalah kadar gula pereduksi total dan tidak dapat
menentukan gula pereduksi secara individual. Untuk menganalisis kadar
masing-masing dari gula pereduksi penyusun madu dapat dilakukan
dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCTK). Metode ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat
digunakan pada senyawa dengan bobot molekul besar dan dapat dipakai
untuk senyawa yang tidak tahan panas (Swantara 1995).
4. Penetapan Kadar Pati Luff Schorrl
Metode Luff adalah uji kimia kualitatif yang bertujuan menguji
adanya gugus aldehid (-CHO). Komponen utama reagent Luff adalah
CuO. Uji ini dilakukan dengan menambahkan reagen luff pada sampel,
kemudian dipanaskan. Reaksi positif pada uji Luff ditandai dengan
adanya endapan merah.
46

Reaksi yang terjadi adalah:

Pada reaksi tersebut terjadi reduksi CuO menjadi Cu 2O. Cu2O ini
kemudian membentuk endapan merah bata. Salah satu manfaat praktis
uji luff adalah mengetahui adanya gula pereduksi atau aldosa (contohnya
sukrosa), yang memiliki gugus aldehid (Anonim 2009). Pada metode
Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu Penentuan Cu tereduksi
dengan I2 dan Menggunakan prosedur Lae-Eynon
Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff
menjadi Cu2O. Kelebihan CuO akan direduksikan dengan KI berlebih,
sehingga dilepaskan I2. I2 yang dibebaskan tersebut dititrasi dengan
larutan Na2S2O3. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan
adalah Iodometri karena kita akan menganalisa I2 yang bebas untuk
dijadikan dasar penetapan kadar. Dimana proses iodometri adalah proses
titrasi terhadap iodium (I2) bebas dalam larutan.
Apabila terdapat zat oksidator kuat (misal H 2SO4) dalam
larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam penambahan ion iodida
berlebih

akan

membuat

zat

oksidator

tersebut

tereduksi

dan

membebaskan I2 yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya


oksidator (Hartati dan Titik 2003). I2 bebas ini selanjutnya akan dititrasi
dengan larutan standar Na2S2O3 sehinga I2 akan membentuk kompleks
iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu
titrasi membutuhkan indikator amilum, maka penambahan amilum harus
sebelum titik ekuivalen (TBKKP 2008).

5. Fungsi Pereaksi

47

Hasil titasi ditambahkan dengan akuades dan larutan Luff


kemudian dipanaskan. Pemanasan ini dilakukan dengan tujuan untuk
mempercepat reaksi reduksi dari monosakariada pada gula terhadap CuO
menjadi CuO2 dan dalam pemanasan ditambahkan batu didih hal ini
dimaksudkan untuk meratakan pemanasan. Pemanasan cukup lakukan
pendinginan dengan es (TBKKP 2008).
Larutan ditambahkan larutan KI 10 % sebanyak 10 ml untuk
mereduksi kelebihan CuO sehingga I2 terlepas dan juga dilakukan
penambahan H2SO4 25 % sebanyak 25 mL yang bertujuan untuk
mengasamkan larutan karena pada suasana basa, tio sebagai larutan
standar akan tereduksi secara parsial menjadi sulfat makanya perlu
dilakukan pengasaman tersebut. Warna akan menjadi coklat keruh dari
awalnya berwarna biru karena larutan luff.
Dititrasi dengan larutan standar tio sampai terjadi perubahan
warna menjadi kuning, hal ini menandakan larutan tersebut mendekati
titik ekuivalen. Sesuai dengan metode maka di tambahkan indikator
amilum sebanyak 3 tetes dan titrasi sampai terjadi perubahan warna
larutan yang berubah menjadi putih susu. Dan pada blanko dilakukan
juga hal yang sama, hanya saja tidak menggunakan sampel. Dari analisa
yang diperoleh dan di konversikan ke persamaam luff maka di peroleh
kadar pati (TBKKP 2008).
6. Kelebihan dan Kekurangan Metode Luff Schoorl
Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar
karbohidrat yang berukuran sedang. Metode Luff Schoorl merupakan
metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat
kesalahan sebesar 10 %. Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan
yang terutama disebabkan oleh komposisi yang konstan. Hal ini
diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil
pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang
berbeda.
6.3 Alat dan Bahan
48

a. Alat
1. Erlenmeyer 500 mL
2. Kondensor
3. Pemanas listrik
4. Labu ukur 500 mL
5. Kertas saring
6. Piala gelas
7. Magnetic stirer
8. Buret
b. Bahan
1. HCl 3 %
2.

NaOH 4 N

3. CH3COOH
4. H2O
5. Pereaksi Luff
6. KI 30 %
7. H2SO4 4 N
8. Larutan tiosulfat
9. Indikator kanji
10. Sampel.
6.4 Prosedur Percobaan
Penetapan kadar pati dengan metode Luff Schoorl dapat dilakukan
dengan langkah-langkah sebagai berikut.
Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dimasukkan ke dalam labu
erlenmeyer 500 mL

Ditambahkan 200 mL HCl 3%

Dipanaskan selama 3 jam kemudian diangkat dan didinginkan

Dipindahkan ke dalam gelas piala dan ditambahkan NaOH hingga larutan


bersifat netral
49

Ditambahkan 1 mL CH3COOH dan diaduk

X
X
Dimasukkan ke dalam labu ukur 500 mL dan diencerkan denan H2O
hingga tanda tera

Larutan disaring dengan kertas saring

as

Diambil 5 mL filtrat dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer

Ditambahkan 25 mL pereaksi Luff dan 15 mL H2O

Dipanaskan dengan kondensor selama 10 menit atau sampai terbentuk


endapan merah bata

Setelah didinginkan ditambahkan dengan 10 mL KI 30% dan 25 mL


H2SO4 4 N

Dititrasi dengan larutan tiosulfat dan ditambahkan indikator kanji saat


dilakukan titrasi

Bagan 1 prosedur percobaan penetapan kadar pati dengan metode Luff Schoorl
6.5 Data Pengamatan
Bobot Sampel = 1. 5,0200 g (J)

50

2. 5,0025 g (A)
3. 5.0012 g (G)
1. Standarisasi Na2S2O3 0,1 N
Bobot KIO3
: 0,04 gram = 40 mg
Bst KIO3
: 35,67
Volume penitar
: 14,90 mL
2. Analisa kadar pati
Volume sampel (J) : 10 mL
Volume blanko (Vb) : 9,40 mL
Volume sampel (Vs) : 8,30 mL
Volume sampel (A) : 10 mL
Volume blanko (Vb) : 9,40 mL
Volume sampel (Vs) : 5,30 mL
Volume sampel (G) : 10 mL
Volume blanko (Vb) : 10,20 mL
Volume sampel (Vs) : 6,30 mL
NTio

40 mg
531 X 14.9 mL

= 0.08 N
Z mL = (b-a) x N Tio / 0,1
% Pati =

mg glukosa fp 0,95
100
%
berat contoh

Keterangan :
b

= Volume tiosulfat yang dipakai saat menitrasi blanko

= Volume tiosulfat yang dipakai saat menitrasi sampel

N Tio = Normalitas Tiosulfat


fp

= Faktor Pengenceran

N Tio = 0,08 N
mg glukosa dilihat di tabel sakar-Luff Schoorl
1. Z mL

= 9.4 mL 8.3 mL X 0.08/0.1N


= 0.88 mL
= 2.4 + (0.12 X 2.4)
= 2.7 (J)

2.

Z mL

= 9.4 mL 5.3 mL X 0.08/0.1 N


51

= 3.28 mL
= 7.2 + (0.28 X 2.5)
= 7.9 (A)
3. Z mL

=10.20 mL 6.30 mL X 0.08/0.1N


= 3.12
= 7,2 + (0.12 X 2.5)
= 7,5 (G)

1. % Pati

= 2,7 mg X 10 X 0,95 X 100 %


5200 mg
= 0,49 % (J)

2. % Pati

= 7,9 mg X 10 X 0,95 X 100%


5002,5 mg
= 1,5 % (A)

3. % Pati

= 7,5 mg X 10 X 0,95 X 100%


5001,2 mg
= 1.42 % (G)

6.6 Pembahasan
Pati atau amilum adalah karbohidrat kompleks yang tidak larut dalam
air, berwujud bubuk putih, tawar dan tidak berbau. Pati merupakan bahan
utama yang dihasilkan oleh tumbuhan untuk menyimpan kelebihan glukosa
(sebagai produk fotosintesis) dalam jangka panjang. Hewan dan manusia
juga menjadikan pati sebagai sumber energi yang penting. Pati tersusun dari
dua macam karbohidrat, amilosa dan amilopektin, dalam komposisi yang
berbeda-beda. Amilosa

memberikan

sifat

keras

(pera)

sedangkan

amilopektin menyebabkan sifat lengket. Amilosa memberikan warna ungu


pekat pada tes iodin sedangkan amilopektin tidak bereaksi. Penjelasan
untuk gejala ini belum pernah bisa tuntas dijelaskan (Aulana 2005).

52

Pati terdapat pada bahan pangan yang kaya akan sumber


karbohidrat. Dalam percobaan kali ini, dilakukan penetapan kadar pati
dengan menggunakan sampel yang berasal dari tepung-tepungan. Tepung
yang digunakan antara lain tepung sagu, tepung beras, tepung maizena,
tepung terigu, tepung tapioka, dan tepung hunkwe. Penetapan kadar pati
pada berbagai jenis tepung ini dilakukan dengan menggunakan metode Luff
Schoorl.
Dasar penetapan ini adalah hidrolisis pati menjadi gula-gula
pereduksi yang kemudian ditetapkan secara Luff schoorl. Gula-gula
pereduksi seperti glukosa dan maltose dapat mereduksi Cu2+ menjadi Cu+.
Kemudian Cu2+ yang tidak tereduksi (sisa) dapat dititer secara iodometri.
Jumlah Cu2+ asli ditentukan dalam suatu percobaan blanko dan dari
perbedaannya dapat ditentukan jumlah gula dari larutan yang dianalisis.
Metode Luff school digunakan untuk menetapkan kadar pati karena
metode Luff Schoorl baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat
yang berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa
metode Luff Schoorl merupakan metode terbaik untuk mengukur kadar
karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar 10 % (TBKKP 2008).
Metode Luff adalah uji kimia kualitatif yang bertujuan menguji
adanya gugus aldehid (-CHO). Komponen utama reagent Luff adalah CuO.
Uji ini dilakukan dengan menambahkan reagen luff pada sampel, kemudian
dipanaskan. Reaksi positif pada uji Luff ditandai dengan adanya endapan
merah.
Reaksi yang terjadi adalah:

Bagan 2 Reaksi antara aldehida dengan reagen Luff

53

Pada reaksi tersebut terjadi reduksi CuO menjadi Cu2O. Cu2O ini
kemudian membentuk endapan merah bata. Salah satu manfaat praktis uji
luff adalah mengetahui adanya gula pereduksi atau aldosa (contohnya
sukrosa), yang memiliki gugus aldehid (Anonim 2009).
Dalam metode Luff Schoorl, monosakarida akan mereduksikan CuO
dalam larutan Luff menjadi Cu2O. Kelebihan CuO akan direduksikan
dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I2. Pada dasarnya prinsip metode
analisa yang digunakan adalah Iodometri karena kita akan menganalisa I2
yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar. Dimana proses
iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I 2) bebas dalam larutan.
Apabila terdapat zat oksidator kuat (misal H2SO4) dalam larutannya yang
bersifat netral atau sedikit asam penambahan ion iodida berlebih akan
membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan membebaskan I 2 yang setara
jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator (Hartati dan Titik 2003). I2
bebas ini selanjutnya akan dititar dengan larutan standar natrium tiosulfat
sehinga I2 akan membentuk kompleks iod-amilum yang tidak larut dalam
air. Oleh karena itu, dalam suatu titrasi membutuhkan indikator amilum
sehingga penambahannya harus sebelum titik ekuivalen (TBKKP 2008).
Dalam penetapan kadar pati ini, dilakukan juga pengukuran blanko
dengan cara yang sama. Namun penentuan blanko tidak menggunakan
sampel, hanya menggunakan larutan Luff dan air destilasi. Penetapan
blanko ini bertujuan untuk dijadikan sebagai perbandingan dalam penentuan
jumlah gula dalam larutan yang dianalisis.
Penetapan kadar pati dengan menggunakan metode Luff Schoorl
memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Metode Luff Schoorl ini baik
digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang berukuran sedang.
Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl
merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan
tingkat kesalahan sebesar 10 %. Pada metode Luff Schoorl terdapat dua
cara pengukuran yaitu dengan penentuan Cu tereduksi dengan I2 dan

54

menggunakan prosedur Lae-Eynon (Anonim 2001). Metode Luff Schoorl


mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi yang
konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan
bahwa hasil pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen
yang berbeda.
Penentuan kadar pati dalam bahan pangan penting untuk mengetahui
kandungan pati dalam bahan pangan. Dengan mengetahui kadar pati, dapat
diketahui karakteristik dari bahan pangan tersebut sehingga dapat
ditentukan pengolahan yang tepat untuk bahan pangan tersebut.
6.7 Kesimpulan
Metode Luff Schoorl merupakan metode yang umum dilakukan
untuk penetapan kadar pati pada bahan pangan. Metode ini merupakan
metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan
sebesar 10%.
6.8 Daftar Pustaka
Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor.

55

PERCOBAAN VII
ANALISIS KURVA TITRASI ASAM AMINO

7.1 Tujuan Percobaan


Memahami proses pembuatan kurva titrasi asam amino secara
potensiometri dan menetukan pH isoelektrik asam amino methionine dan
alanin.
7.2 Dasar Teori
Asam

amino

merupakan

unit

pembangun

protein

yang

dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun


dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Asam amino yang
diperoleh dari hidrolisis protein ialah asam amino atau disebut juga asam
-aminokarboksilat. Asam amino yang terjadi secara alami sebagai
penyusun protein mempunyai gugus amino (NH 2) dan gugus karboksilat
(COOH) yang terikat pada atom yang sama yaitu pada atom karbon alfa.
Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam
pelarut organik non polar seperti eter, aseton dan kloroform. Asam amino
mempunyai titik lebur yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan asam
karboksilat atau amina. Kedua sifat fisika ini menunjukkan bahwa asam
56

amino cenderung mempunyai struktur yang bermuatan dan mempunyai


polaritas tinggi dan bukan sekedar senyawa yang mempunyai gugus
COOH dan gugus NH2. Hal ini tampak pula pada sifat asam amino
sebagai elektrolit.
Asam amino mengandung suatu gugus amino yang bersifat basa
dan gugus karboksil yang bersifat asam dalam molekul yang sama. Asam
amino mengalami reaksi asam-basa internal yang menghasilkan suatu ion
dipolar, yang juga disebut zwitterion atau ion amfoter.
7.3 Alat dan Bahan
1. Alat
a. Erlenmeyer 500 ml.
b. Piala gelas 500 ml.
c. Labu ukur 100 ml.
d. Magnetic stirrer.
e. Buret 50 ml.
f. Statif .
g. pH-meter.
h. Pipet volume10 ml.
i. Pipet tetes.
2. Bahan
a.
b.
c.
d.
e.

NaOH 0,1 M.
HCl0,1 M.
Asam amino L-methione.
Asam amino L-alanin.
H2O.

7.4 Prosedur Kerja


1. Ditimbang sejumlah x gram asam amino sesuai dengan massa relatif
yang dipunya untuk membuat 0,1 M asam amino.
2. Dilarutkan asam amino di dalam 100 ml H2O.
3. Dipipet 10 ml asam amino 0,1 M, dimasukkan di dalam piala gelas 500
ml.
4. Dicek pH larutan asam amino sebelum dititar.
5. Diasamkan asam amino hinggapH larutan menjadi 1,30 dengan
penambahan HCl 0,1 M.
57

6. Dititar dengan NaOH 0,1 M hingga pH larutan 12.00.


7. Dicatat setiap kenaikan pH larutan.
8. Dibuat kurva titrasinya.
7.5 Data Pengamatan
Asam amino L- methionine
pH awal ( simplo)

: 5,74

pH awal ( duplo)

: 5,50

pH setelah diasamkan (simplo)

: 1,29

pHsetelah diasamkan (duplo)

: 1,31

Volume NaOH
0,1 M (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

pH
Simplo
Duplo
1,31
1,31
1,31
1,32
1,31
1,32
1,33
1,33
1,33
1,34
1,34
1,34
1,35
1,36
1,38
1,39
1,40
1,41
1,43
1,44
1,46
1,47
1,49
1,50
1,52
1,54
1,56
1,58
1,60
1,62
1,64
1,66
1,68
1,7
1,72
1,74
1,76
1,78
1,81
1,83
1,87
1,89
1,93
1,95
1,99
2,03
2,05
2,06
2,12
2,09
2,20
2,15
2,29
2,25
2,38
2,36
2,49
2,47
58

30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66

2,63
2,78
2,99
3,30
4,59
7,72
8,24
8,49
8,73
8,87
9,02
9,16
9,31
9,47
9,60
9,76
10,01
10,32
10,70
11,06
11,29
11,39
11,47
11,54
11,62
11,68
11,72
11,77
11,8
11,84
11,86
11,89
11,91
11,95
11,96
11,98
12,00

2,66
2,78
3,02
3,32
4,61
7,79
8,27
8,53
8,74
8,90
9,05
9,16
9,25
9,45
9,62
9,78
10,03
10,33
10,71
11,08
11,31
11,39
11,48
11,61
11,65
11,70
11,78
11,83
11,88
11,92
11,95
11,97
11,99
12,03

59

pH awal ( simplo)
pH awal ( duplo)
pH setelah diasamkan (simplo)
pH setelah diasamkan (duplo)
Volume NaOH 0,1
M (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47

:
6,28
:
6,41
:
1,32
:
1,30

Asam

pH
Simplo
1,34
1,38
1,42
1,48
1,56
1,60
1,67
1,74
1,83
1,91
2,00
2,09
2,19
2,31
2,41
2,57
2,71
2,94
3,30
5,28
8,22
8,79
9,05
9,26
9,42
9,57
9,70
9,84
9,99
10,12
10,31
10,49
10,71
10,99
11,23
11,42
11,53
11,62
11,69
11,76
11,81
11,86
11,89
11,91
11,94
11,96
11,98

Duplo
1,33
1,38
1,44
1,50
1,59
1,68
1,79
1,90
2,05
2,20
2,39
2,58
2,96
3,82
8,48
9,06
9,38
9,58
9,84
10,08
10,41
10,77
11,21
11,46
11,60
11,70
11,79
11,84
11,89
11,93
11,97
12,00

amino

Alanine

7.6 Pembahasan
Asam

amino

dapat bereaksi dengan


basa

kuat

karena

bersifat asam lemah


dan bereaksi dengan

60

asam kuat karena mengandung gugus -NH2yang bersifat basa lemah.Gugus


yang memberikan sifat asam adalah gugus COOH.Hal ini karena asam
amino bersifat amfoter.
Asam -amino secara umum dimisalkan sebagai R-CH(NH2)COOH. Pada saat larutannya direaksikan dengan basa kuat, NaOH maka
OH-menyerang gugus -COOH terbentuklah -COO-.
R-CH(NH2)-COOH + OH- R-CH(NH2)-COO- + H2O
Ketika asam amino itu direaksikan dengan asam kuat, H 2SO4(aq),
ion-ion H+ tertarik ke gugus -NH2 membentuk -NH3+.

R-CH(NH2)-COOH + H+ R-CH(NH3+)-COOH

pH larutan dari asam amino diukur dengan menitrasinya dengan


larutan asam dan basa secara bergantian dengan mencatat perubahan pH
yang terjadi dengan bantuan pH meter pada saat penambahan larutan
titran. Pada saat menitrasi dengan NaOH, asam amino akan membentuk
struktur asam amino yang bersifat basa. Sebaliknya jika dititrasi dengan
H2SO4 akan membentuk struktur asam amino kation dalam keadaan asam
yang ditunjukkan oleh pH semakin kecil dari 7. jadi, dalam keadaan ini
maka gugus karboksil lebih banyak dibandingkan dengan gugus
aminonya.Dari sini dapat dilihat benar bahwa asam amino mempunyai
salah satu sifat khas yaitu bersifat amfoter (dapat bersifat basa maupun
bersifat asam).
Pada asam amino, jika ditambahkan dengan larutan asam, maka
konsentrasi H+ dalam air yang tinggi masuk berikatan dengan gugus
COO- sehingga membentuk COOH. Tetapi jika ditambahkan dengan
basa, maka ion OH- yang tinggi mampu mengikat H+.

61

Pada penggolongannya, alanin merupakan asam amino yang


nonpolar, Alanin merupakan asam amino yang tidak mempunyai muatan.
Titrasi ini juga dilakukan untuk mencari titik isoelektrik pada asam amino,
dimana asam amino mempunyai muatan listrik netral. Jika pH yang terjadi
terdapat di atas titik isoelektriknya maka asam amino tersebut bermuatan
negatif, dan jika pHnya berada dibawah titik isoelektriknya maka asam
amino tersebut akan bermuatan positif.Harga PH yang menyebabkan asam
amino memiliki muatan listrik netral disebut titik isoelektrik. Titik
isoelektrik untuk alanin adalah pada PH 6,0. Pemisah asam amino disebut
elektroforesis.

7.7 Simpulan
Harga PH yang menyebabkan asam amino memiliki muatan listrik
netral disebut titik isoelektrik. Titik isoelektrik untuk alanin adalah pada
PH 6,0.
7.8 Daftar Pustaka
Aminingsih, Tri M.Si, dan Dra Eka Herlina M.Pd, 2015, Penuntun
Praktikum Biokimia II, Bogor, Laboratorium Kimia Fakultas MIPA
Universitas Pakuan Bogor

62