Elektroforesis PDF
Elektroforesis PDF
Pendahuluan
Suatu elektroforegram
Suatu elektroforegram
Elektroforesis
Electro phoresis = being carried
Electrically induced movement of
particles : gerakan partikel yang
bermuatan di dalam suatu media yang
diberi arus listrik
Digunakan untuk pemisahan suatu
campuran senyawa yang bermuatan :
protein atau DNA
Protein
Proteins adalah building blocks of life. Secara
kimiawi, protein adalah molekul yang terbentuk
dari suatu urutan asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida .
Susunan dari beberapa amino acids sepanjang
rantai peptida tersebut disebut struktur primer
(primary structure) protein, secara experimen
dapat dibuktikan melalui teknik sequencing atau
dengan analisis DNA yang meng-encoding
specific proteins.
Struktur Protein
Struktur protein
Analisis protein
Penggunaan elektroforesis
dalam analisis
Analisis kualitatif Untuk Protein
Analisis kualitatif DNA
Elektroforesis DNA
Pada gel electrophoresis untuk DNA, enzim restriksi
memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan
panjang bervariasi. Larutan yang mengandung fragmen2
ini ditempatkan di dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik
diberikan pada gel tersebut, maka satu sisi gel
akanbermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan
bermuatan negatif.
Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang
bermuatan negatif ke arah ujung yang bermuatan positif.
Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat
dibandingkan yang berukuran lebih besar.
Apabila arus listrik dihentikan , fragmen DNA tadi telah
terpisah-pisah di dalam gel tersebut dan yang berukuran
lebih kecil akan berada lebih dekat pada ujung postif.
Fragmen tersebut akan terlihat seperti bentuk barcode.
Elektroforesis Protein
Metode yang paling umum untuk memisahkan
protein adalah dengan cara electrophoresis
menggunakan discontinuous polyacrylamide gel
sebagai medium penyangga dan sodium
dodecyl sulfate (SDS) untuk men-denaturasi
protein.
Metode ini disebut Sodium Dodecyl Sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE).
Metode ini disebut juga Laemmli method
karena penemunya U.K. Laemmli, adalah yang
pertama kali menggunakan metode SDS-PAGE
ini
1-D Electrophoresis
Ketika protein dan macromolecules lain di
treatment dengan SDS suatu strong detergent,
maka mereka akan ter denaturasi dan akan
bermuatan negatif.
Jumlah yang terikat akan proposional dengan
massa.
Jumlah yang tertarik per unit massa di electric field
adalah sama dan seluruh molekul akan bergerak
dengan kecepatan yang sama bila tidak ada friksi.
Pada proses electrophoresis dengan SDS
dilakukan di dalam suatu gel yang akan melewati
pori-pori gel., sehingga kemudahan pergerakan
melalui pori tergantung pada diameter molekul.
2-Dimensional Electrophoresis
Umum digunakan : 2-D polyacrylamide gel
electrophoresis
Memisahkan, identifikasi, dan mengukur seluruh
protein yang terdapat dalam suatu sample sel
Pada dimensi pertama, Protein dipisahkan pada
titik isoelektriknya yaitu pada pH dimana muatan
tiap protein sama dengan 0. Pada dimensi
kedua, protein lalu didenaturasi sedemikian
sehingga setiap residu asam amino mempunyai
muatan tertentu. Selanjutnya protein dipisahkan
berdasarkan ukurannya.
Bahan penyangga
Berupa gel (sediaan semisolid transparan)
Utk pemisahan protein : digunakan gel
polyacrylamide
Utk pemisahan DNA : digunakan gel
agarose
Mempersiapkan gel
Menjalankan gel
Anode (+ electrode) harus dihubungkan pada
bagian dasar chamber dan Cathode pada
bagian atas chamber.
Protein yang bermuatan negatif akan bergerak
menuju anode,Gel biasanya dialiri listrik pada
voltase kira-kira 150 Volts untuk mencegah
overheating
Overheating dapat mendistorsi acrylamide
bahkan dpt merusak pelat.
Hasil elektroforesis
Elektroforesis DNA
DNA
marker
Produk PCR
M. Ryan
y = -1,2916x + 1,2809
2
R = 0,9949
MW, log
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
Distance, cm
0,80
1,00
1,20
5,00
MW(kb)
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
1
Blotting
Southern Blot : untuk identifikasi DNA
Western Blot : untuk identifikasi Protein
Northern Blot : untuk identifikasi RNA
Southern Blot
The figure on the left shows a photograph of a 0.7% agarose gel that has 14 different samples loaded
on it (plus molecular weight marker in the far right lane and a glowing ruler used for analysis of the
results). Each sample of DNA has been digested with the same restriction enzyme (EcoRI). Notice
that the DNA does not appear as a series of discrete bands but rather as a smear. The DNA was
transferred to nitrocellulose and then probed with a radioactive fragment of DNA that was derived from
the transformed gene. The figure on the right is a copy of the X-ray film and reveals which strains
contain the target DNA and which ones do not.
Western Blot
Lyme disease reactive Western blot
Description of lanes:
Lane 1 - molecular weight marker
Lane 2 - positive patient sample
Lane 3 - positive patient sample
Lane 4 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 5 - monoclonal antibodies for 41kD
band
Lane 6 - monoclonal antibodies for 39
and 41kD bands
Lane 7 - monoclonal antibodies for 31
and 34kD bands
Lane 8 - positive control pool
Northern Blot