III. METODE
Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, beaker glass, jarum ose, pipet tetes,
mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar spirtus, biuret
dan statif, sentrifuga, magnetik stirer, autoclave model S-90N, oven, laminar air
flow CRUMA model 9005-FL, waterbatch shaker incubator HAAKE, pH meter,
waterbath, incubator, ayakan 100 mesh dan spektrofotometer UV-VIS Cary Win
UV 32.
Bahan-bahan yang digunakan adalah Nutrient Agar, aquades, Gum arab, minyak
zaitun, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, Na2CO3, KH2PO4, MgCl.6H2O, CaCl2. 2H2O,
NaOH, Na(K)-Tartarat, NaH2PO4, Na2HPO4, Phenolphtalein (PP), reagen folinciocalteu, HCl, HF, Buffer fosfat pH 7, lautan Bovine Serum Albumin (BSA),
41
C. Prosedur Penelitian
1.
a.
b.
c.
42
Pereaksi A
Pereaksi B
Pereaksi C
Pereaksi D
Larutan standar
43
2.
3.
Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada
penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Prinsip
sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara pemusingan.
Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa
sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah suhu kamar) untuk
menjaga kehilangan aktifitas enzim (Suhartono, 1989). Media fermentasi
44
45
Keterangan :
V.sampel
V.blanko
[NaOH]
V.enzim
t.
1000
46
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (20-40%)
Endapan(F2)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (40-60%)
Endapan(F3)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (60-80%)
Endapan(F4)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (80-100%)
Endapan(F5)
Filtrat
47
b. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat
dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong
selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,05 M pH 7 selama 24 jam
pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian larutan bufer
selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat
dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam
kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak
ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan
larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong,
maka akan terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan
yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong.
Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Titrimetri serta diukur
kadar proteinnya dengan metode Lowry.
48
b.
49
a.
b.
c.
50
d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), dan perubahan
energi akibat denaturasi (Gi)
Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim lipase hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan
persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan
persamaan:
ln (Ei/E0) = - ki t
ki
kB
51
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang
ditunjukkan dalam Gambar 9.
Produksi Enzim
Isolasi Enzim
Ekstrak Kasar Enzim
Amobilisasi Enzim
Karakterisasi Enzim
Penentuan
suhu optimum
Uji pemakaian
berulang enzim amobil
Penentuan
Km dan Vmaks
Penentuan
stabilitas termal