1. Tahapan Proses dalam transformasi A.

bacterium melalui Binary vector

Penemuan bahwa gen vir tidak perlu berada dalam plasmid yang sama dengan daerah
T-DNA untuk proses transfer dan insersi ke dalam genom tanaman membawa pada
konstruksi untuk transformasi tanaman di mana daerah T-DNA dan vir berada pada
plasmid terpisah.
Dalam sistem binary vector, dua plasmid yang berbeda yang digunakan adalah:
a. Sebuah replicon kecil lebar-host-range, yang memiliki ori yang memungkinkan
untuk dilakukan engineering plasmid pada berbagai bakteri, termasuk E. coli dan
Agrobacterium. Plasmid ini biasanya berisi:
Foreign DNA pada T-DNA,
The left and right T-DNA borders (or at least the right T-border),
Markers for selection and maintenance in both E. coli and A. tumefaciens,
Marker untuk seleksi tanaman.
b. Gen tumor-inducing yang terletak di DNA-T telah dihapus.
c. Ti plasmid helper, menempel pada A. tumaficiens yang memiliki sedikit T-DNA
region tapi banyak mengandung Vir region.
Secara umum, prosedur transformasi adalah sebagai berikut:
1. Small recombinant replicon di transfer melalu proses konjugasi bakteri atau
transfer langsung ke A.tumaficiens dengan cara menempel pada Ti plasmid
helper,
2. Sel tumbuhan di co-kultivasi dengan Agrobacterium, untuk memungkinkan
transfer dari T-DNA rekombinan kedalam genome tumbuhan dengan metode
particle bombardment ataupun floral dip.
3. Sel tumbuhan transforman diseleksi pada kondisi yang sesuai
Kelemahan
Kelemahan yang mungkin dapat terjadi adalah fakta bahwa stabilitas replikan pada inang
yang bervariasi. Tergantung pada orientasi, plasmid dengan dua ORI yang berbeda yang
mungkin tidak stabil dalam E. coli di mana kedua ORI aktif.
Keuntungan
Dibandingkan dengan vektor co-terintegrasi, binary vector menyajikan beberapa
keuntungan:
Tidak ada proses rekombinasi terjadi antara molekul-molekul yang terlibat.
Dibandingkan menggunakan Ti plasmid yang besar,dan rekombinan justru
menggunakan vektor yang lebih kecil untuk meningkatkan efesiensi dari E. coli ke
A. Tumaficiens

Gambar 1. Proses konstruksi plasmid pada binary vector

2. Tahapan Proses dalam transformasi A.bacterium melalui Co-integrated plasmid

Disebut vektor co-integrated atau atau hibrida Ti plasmid, vektor ini adalah di antara
jenis pertama dari plasmid Ti diubah dan direkayasa diciptakan untuk transformasi
dengan media Agrobacterium, tetapi tidak banyak digunakan saat ini.
Vektor ini dibentuk oleh rekombinasi homolog dari sebuah plasmid bakteri dengan
daerah T-DNA dari Ti plasmid endogen dalam Agrobacterium. Integrasi dari dua plasmid
memerlukan region yang sama ada pada keduanya.
Tiga vektor yang diperlukan dalam sistem ini:
Perombakan Ti plasmid pada Agrobacterium
Dalam Ti plasmid, onkogen terletak pada T-DNA digantikan oleh DNA eksogen.
Contoh dari vektor ini meliputi:
a. Seri SEV: Right border dari T-DNA bersama dengan coding gene
phytohormone untuk sitokinin dan auksin akan dihapus dan diganti
dengan gen yang resisten terhadap kanamisin sementara left border dan
sebagian kecil dari segmen kiri (TL) dari original T-DNA (referred to as
Left Inside Homology (LIH)) yang tersisa utuh.
b. Seri PGV: Gen phytohormone yang dipotong dan diganti dengan bagian
dari pBR322 sequence vector. Sekuens dari right and left border serta
gen sintase nopaline dari plasmid Ti dipertahankan.
c. Intermediate vektor
Plasmid pBR322 kecil berbasis (E. coli vektor) yang berisi T-DNA region.
Mereka digunakan untuk mengatasi masalah-masalah yang berasal dari
plasmid Ti berukuran besar yang dibongkar dan kekurangan dari restriksi
yang unik. Intermediate vectors direplikasi pada E. coli dan ditransfer
kedalam Agrobacterium dengan proses konjugasi. Mereka tidak dapat
bereplikasi di A. tumafaciens dan untuk itu, segemen DNA dibawa yang
homolog kedalam T-DNA yang sudah dibongkar untuk memungkinkan
rekombinasi untuk membentuk struktur T-DNA dari co-integrated.
d. Helper vectors, plasmid kecil yang membantu E. coli yang mengandung
transfer (tra) dan mobilization (mob) genes, yang memungkinkan transfer
dari konjugasi-deficient intermediate dari vektor ke dalam Agrobacterium
Co-integrated_plasmid.

Gambar 2. Co-integrated plasmid

Sebuah plasmid co-terpadu yang dirakit secara manipulasi in vitro biasanya mengandung:
1. the vir genes,
2. the left and right T-DNA borders,
3. sebuah sebuah DNA exogenous antara dua sekuen T-DNA borders, dan
4. eksplan tanaman dan marker.

Beberapa kelemahan:
Meskipun vektor co-terintegrasi telah dirancang untuk memungkinkan rekombinasi
site tertentu berdasarkan sistem rekombinasi dari phage P1 (misalnya, wP1loxP-Cre
seri), vektor co-terpadu pada umumnya kurang populer karena:
Membutuhkan homologi yang panjang antara Ti plasmid dan E. coli plasmid
sehingga sulit untuk direkayasa.
Transfer gen relatif tidak efisien dibandingkan dengan vektor biner.
3. Tahap-tahap transformasi dengan particle bombardment
Tahap-tahap transformasi melalui metode particle bombardment adalah:
a. Preparasi eksplan untuk transformasi particle bombardment
Eksplan tanaman yang akan disisipi bakteri yang berisi gen interest disiapkan.
Misalanya kotiledon dari tanaman semangka yang berumur 4 hari dan diletakkan
dalam cawan petri bagian tengah (diameter 9cm) yang mengandung medium MS
semi padat dengan 0,32% phytagel, disuplementasi dengan 3% (b/v) manitol, 3%
(b/v) sorbitol, 3% (b/v) sukrosa dan 20 M BAP dan diinkubasi pada suhu 25C.
Pada hari selanjutnya, kotiledon segera disisipi materi genetik asing menggunakan
alat Biolistic Particle Delivery.
b. Preparasi strain bakteri (host) dan plasmid (vektor)
Preparasi materi genetik interest yang akan dimasukkan dalam plasmid sebagai
vektor yang akan ditembakkkan dalam eksplan dengan particle bombardment.
Plasmid yang berada dalam host yang sebelumnya telah ditumbuhkan diambil
dengan cara tertentu yang kemudian disiapkan untuk pelapisan dengan partikel
gold/tungsen.
c. Preparasi particle (gold/tungsen particle)
12 mg gold particle 1.0m dicuci dengan 200 L etanol 100%, pada tube ependorf,
kemudian divortex selama 1-2 menit , dilanjutkan dengan sentrifugasi 10detik pada
20.000 g. Ethanol dibuang, dan pellet (peluru) dilarutkan lagi dengan 200L
aquabides steril, di vortex, disentrifugasi 20,000g. Suspensi dibuang, dan peluru
dilarutkan lagi pada 200L aquabides steril , dan divortex selama 1-2 menit. Peluru
kemudian disuspensikan ke aquabides steril dan di dibagikan ke 100L aliquot
(larutan DNA) yang sebelumnya disimpan pada suhu -200C.
d. Pelapisan DNA dengan particle (gold/tungsen particle)
Untuk presipitasi plasmid DNA ke microcarrier (gold particle), 100 L suspensi gold
particle (0.12 mg LG) dicampur dengan 20L plasmid pRQ6 (stok 1g LG) dan 40
L spermidine steril. Selanjutnya, 100L CaCl 2 steril ditambahkan sedikit demi
sedikit. Partikel atau suspensi DNA kemudian divortex dan dibiarkan selama 10menit
pada suhu ruang. DNA yang dilapiskan ke gold particle di sentrifugasi 20.000 g
selama 10detik. Supernatant kemudian dipindahkan. Pellet kemudian dilarutkan lagi
pada 100L etanol 100% . Total suspensi DNA 12L di pipet ke tengah microcarrier
(gold particle) dan dibiarkan kering sampai 30 detik.
e. Pengaturan parameter penembakan
Parameter penembakan yang perlu diatur meliputi: (1) jarak sel target dan partikel,
(2) tekanan vakum gas helium, (3) banyaknya partikel yang ditembakkan dan
konsentrasi DNA dalam partikel, (4) ukuran partikel.
f. Histochemical GUS assay

Ekspresi GUS dinyatakan dengan jumlah spot biru tiap eksplan, yang ditujukan untuk
mengetahui seberapa kesuksesan transformasi dengan particle bombardment pada
eksplan tanaman.
4. Tahap-tahap analisis GUS
Pengujian histochemical untuk glucuronidase (GUS) umumnya dilakukan saat eksplan umur
24 jam setelah penembakan. Bahan diinkubasi pada potassium ferricyanide (8.2 mg mLG1),
potassium ferrocyanide (10.6 mg mLG1), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-$-D-glucuronide (XGluc) (100 mg mLG1), sodium phosphate buffer (0.2M [pH 7]), 20% (v/v) methanol dan
0.5% (v/v) Triton X-100 pada suhu 370C selama semalam. Klorofil dihilangkan dengan cara
mencuci jaringan dengan etanol 100% sebelum pengujian GUS. Ekspresi GUS dinyatakan
dengan jumlah spot biru tiap explan.
5. Tahap-tahap proses PCR
Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA
cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase. PCR terdiri atas beberapa
siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus.
Komponen PCR
1. DNA template
2. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang
menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi
DNA. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA
template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita
inginkan.
3. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai batu bata penyusun DNA yang
baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu
dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
4. Buffer, untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan
enzim DNA polymerase.
5. Ion Logam,
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim
DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan Reaksi

Gambar 4. Tahapan reaksi PCR

1. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada
suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
2. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40
detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA
template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.
3. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA
polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan
dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G,
begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung.
Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi,
secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
4. Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan
denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau
dipanaskan terlebih dahulu).

5. Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72 oC) selama 5-15 menit untuk
memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

6. Tahap-tahap proses RAPD

Tahapan dalam RAPD hampir sama dengan tahapan pada PCR. Perbedaan dengan PCR
adalah dalam RAPD hanya digunakan 1 primer berukuran pendek yang tidak menempel
pada bagian tertentu DNA template.Tahapan dalam RAPD adalah:

Denaturasi
Primer annealing (penempelan)
Polimerisasi

7. Tahap-tahap proses RFLP

Isolasi DNA
Pemotongan dengan enzim restriksi dan elektroforesis gel
Transfer DNA dengan Southern blotting
Hibridisasi DNA