RESUME

KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1

Teori Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi adalah pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi dalam
sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih. Teknik kromatografi umum membutuhkan zat
terlarut terdistribusi diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase gerak membawa
zat terlarut melalui media sehingga terpisah dari zat terlarut lainnya. Fase diam bertindak
sebagai zat penjerap, sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. KCKT
mempunyai banyak keuntungan yaitu:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Cepat
Berdaya pisah baik
Peka
Detektor unik
Kolom dapat dipakai kembali
Ideal untuk molekul besar dan ion
Mudah memperoleh kembali cuplikan
Akurasi dari hasil yang cukup baik.
KCKT sangat sesuai untuk senyawa yang tidak tahan panas karena biasa dilakukan pada

suhu kamar.
j. Difusi pelarut yang sangat lambat di dalam fase cair sehingga menghasilkan pemisahan
yang baik.
k. KCKT menggunakan kolom fase terikat sebagai fase diam.
l. KCKT dapat digunakan untuk menganalisa sebagian besar senyawa

tak

atsiri

(non-

volatil), senyawa yang memiliki bobot molekul yang tinggi, dan senyawa anorganik.
Adapun kerugian dari sistem KCKT ini, di antaranya :
1. Hanya dapat digunakan untuk senyawa yang larut dalam fase gerak.
2. Memerlukan perangkat yang cukup banyak sehingga biaya yang dikeluarkan cukup
mahal.
3. Memerlukan tenaga ahli dalam pengoperasian sistem KCKT.

Gambar 1. Diagram skematik alat KCKT

a

Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Daya elusi dan resolusi ini dipengaruhi oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab gas akan berkumpul dengan

komponen lain di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Pompa
Pompa harus inert terhadap fase gerak. Fungsi utama pompa yaitu adalah untuk
mengalirkam fase gerak ke dalam kolom. Pompa harus tahan terhadap segala jenis
pelarut, dapat mencapai tekanan sampai 6000 psi, dan dapat menghantarkan aliran
terukur 0,01-1,0 atau 0,1 mL/menit. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa

dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup telfon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)

internal atau eksternal.

Kolom

Tempat berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Suhu kolom pada umumnya tidak
begitu menentukan. Akan tetapi jika diperlukan pemanasan maka suhu harus
dikendalikan. Peningkatan suhu barangkali sampai 40-50 C, biasanya mempertajam
puncak. Pada kromatografi fase balik kolom yang sering digunakan adalah kolom
hidrofob oktadesilsilan (C18) merupakan fase diam yang sangat nonpolar sehingga
kekuatan ikatan analit nonpolar pada kolom sangat lemah yang menyebabkan pemisahan
e

yang baik.
Detektor
Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif). Dikelompokkan
menjadi 2 yaitu detektor universal yang mampu mendeteksi secara umum, tidak spesifik,
selektif dan golongan detektor yang spesifik yang hanya mendeteksi analit secara spesifik
dan selektif seperti detektor uv-vis, detektor fluorosensi, detektor elektrokimia.
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
1 Respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2 Sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3 Stabil dalam pengoperasiannya
4 Mempunyai sel volume yang sangat kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita.
5 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut.
6 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Rekorder
Rekorder berfungsi untuk merekam hasil deteksi dari detektor yang biasanya dilengkapi
dengan pencetak.

Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Prinsip kerja dari KCKT merupakan pemisahan senyawa dari campurannya
berdasarkan sifat kepolaran dari senyawa tersebut, yang terdiri dari fase gerak dan fase diam.
Untuk analit yang lebih mudah berdistribusi di dalam fase gerak, maka akan bergerak lebih
cepat.

Teknik Pemisahan dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

a

Sistem Isokratik
sistem pemisahan selama proses analisis berlangsung, komponen fase gerak tidak
berubah.
Sistem gradien (landaian)
sistem pemisahan dimana pelarut yang digunakan terdiri dari dua atau lebih dengan
berbagai perubahan komposisi sehingga selama analisis berlangsung komponen fase
gerak berubah secara periodik dengan peningkatan kekuatan fase gerak.

Aplikasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

a

Analisis kualitatif
Keterangan : Vr = Volume retensi

Vr= Tr x Fe

Tr = Waktu retensi
Fe = Kecepatan aliran
b

Analisis kuantitatif
Perhitungan kuantitatif berdasarkan pada pengukuran tinggi puncak atau luas area dari
suatu komponen zat. Umumnya metode kuantitatif yang digunakan adalah menggunakan
baku pembanding.
rumus :

Cu

Au
Cb
Ab

Keterangan : Cu = Konsentasi larutan uji

Au = Luas puncak larutan uji
Ab = Luas puncak larutan baku

Cb = Konsentrasi larutan baku

5

Uji Kesesuaian Sistem

Data spesifik dikumpulkan dari penyuntikkan ulang larutan uji atau larutan baku.
Bila tidak dinyatakan lain, untuk perhitungan digunakan data kromatogram lima kali hasil
penyuntikkan ulang, jika dinyatakan batas simpangan baku relatif 2,0% atau kurang, dan
digunakan data kromatogram enam kali penyuntikkan ulang, jika dinyatakan batas
simpangan baku relatif lebih dari 2,0%.
R=

2(t 2t 1)
w 2+w 1

Keterangan: t2, t1

= waktu retensi kedua komponen

w2, w1 = lebar dasar puncak

6

Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya. Untuk analisis rutin, secara berkala dilakukan verifikasi metode yaitu proses
konfirmasi untuk menunjukkan metode yang telah sesuai dan memenuhi kebutuhan
laboratorium. Pada penelitian ini dilakukan validasi metode parsial dengan karakteristik
analisis yaitu:
1 Akurasi (ketepatan)
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (nilai rata-rata hasil analisis) dengan
2

nilai yang diterima sebagai nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen.
Presisi (ketelitian)
Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari
beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Nilai RSD antara 1-2%
biasanya dipersyaratkan untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak,

sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar kecil, RSD berkisar antara 5-15% .
Uji Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil yang

secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan.

Perhitungan Kadar Senyawa

1. Menggunakan perhitungan dengan metode regresi linear
rumus :
y = a +
x
y

b=

x . y
n
x

2
n . x
a=

yb x
n
x
y

r=

x . y
n.

n x

n y 2

Keterangan : y = area
x= konsentrasi larutan
n= jumlah pengukuran
r=koefisien korelasi
2. Perhitungan Kandungan senyawa
Rumus :
PPM
x Vol .Total x bobot sampel x Kemurnian Baku
1000

Keterangan : Area = Luas area sampel

a
b

= intersep
= slopen (a dan b didapatkan dari hasil perhitungan dari persamaan
regresi baku)
Bs = Bobot Sampel
Kb = Kemurnian Baku