PERCOBAAN I

OPTIMASI METODE ANALISA OBAT

I

TUJUAN PRAKTIKUM
1

Memahami langkah-langkah analisa obat di dalam darah.

Mampu melakukan validasi metode analisis obat di dalam darah.

II

DASAR TEORI
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium,

untuk

membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode

analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis
tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).
Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian,
yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta
uji kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan.
Pemilihan parameter yang akan diuji tergantung dari jenis dan metode pengujian
yang akan divalidasi (Chan, 2004).
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar obat dalam serum
hendaknya telah sahih, berkenaan dengan hal-hal berikut seperti spesifitas,
linieritas, kepekaan, ketepatan, ketelitian, dan stabilitas.
Metode analisis merujuk pada penetapan kadar senyawa tertentu dan evaluasi
hasil pengukuran, sedangkan prosedur analisis merupakan serangkaian proses
mulai dari penyiapan sampel sampai evaluasi hasil pengukuran.
Keseluruhan tahap atau langkah prosedur analisis dapat diringkas sebagai
berikut:
a

Definisi masalah
Definisi masalah terkait dengan informasi analisis yang berhubungan dengan
tingkat akurasi yang dibutuhkan. Selain itu menyangkut berapa lama waktu yang
dibutuhkan, biaya diperlukan, ketersediaan alat, bahan, dan pelarut yang
dibutuhkan untuk analisis.

Pemilihan teknik dan metode analisis.

Pemilihan teknik dan metode analisis terbaik yang akan digunakan untuk
analisis sampel harus diperhatikan, apakah akan menggunakan kromatografi,
spektrofotometri, titrimetri, atau yang lain.

Pengambilan sampel
Sampel harus dapat mewakili materi yang akan dianalisis secara utuh.
Masalah pengambilan sampel merupakan hal yang tidak boleh dipandang ringan
karena dari cara kita mengambil sampel itulah diperoleh hasil analisis.

Pra-perlakuan sampel atau pengkondisian.

Pengubahan analit ke bentuk yang sesuai sehingga analisis dapat dideteksi
atau dapat diukur harus juga diperhatikan. Tahap ini berkaitan dengan metode
pemisahan. Pemilihan teknik-teknik pemisahan untuk suatu situasi yang spesifik
tergantung pada sejumlah faktor. Pemilihan teknik ini umumnya didasari pada
ketelitian dan ketepatan hasil analisis yang diperlukan.

Pengukuran analit yang diperlukan

Berbagai sifat fisika kimia dapat digunakan sebagai suatu cara identifikasi
kualitatif dan pengukuran kuantitatif atau keduanya.

Perhitungan dan interpretasi data analisis

Suatu analisis dapat dikatakan selesai jika hasil-hasilnya dinyatakan
sedemikian rupa sehingga si peminta analisis (customer) dapat memahami artinya.
Suatu metode analisis terdiri atas serangkaian langkah yang harus diikuti
untuk tujuan analisis kuantitatif, kualitatif, dan informasi struktur dengan
menggunakan teknik tertentu. Dalam setiap analisis, pemilihan suatu metode
analisis harus memperhatikan faktor-faktor sebagai berikut:
1. Tujuan analisis, biaya yang dibutuhkan, serta waktu yang diperlukan.
2. Level analit yang diharapkan dan batas deteksi yang diperlukan.
3. Macam sampel yang akan dianalisis serta pra-perlakuan sampel yang
dibutuhkan.
4. Jumlah sample yang dianalisis.
5. Ketepatan dan ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif.
6. Ketersediaan bahan rujukan, senyawa baku, bahan-bahan kimia, dan pelarut
yang dibutuhkan.
7. Peralatan yang tersedia.

8. Kemungkinan adanya gangguan pada saat deteksi atau pada saat pengukuran
sampel.
Metode yang baik harus memenuhi beberapa kriteria yaitu metode harus:
1

Peka (sensitive), artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar
senyawa dalam kosentrasi yang kecil.

Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan
kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan
kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat
tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis.
Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan
dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan
yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan
suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur (Gandjar, 2007)

Selektivitas adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara
cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam
matriks sampel. (Riyadi, 2009)

Kasar (rugged), artinya adanya perubahan komposisi pelarut atau variasi

lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil analisis.

Praktis, artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak memerlukan
waktu dan biaya.

Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. (Riyadi,2009).
Walaupun untuk memenuhi semua persyaratan di atas sulit dicapai, namun

sekurang-kurangnya metode analisis harus memenuhi syarat ketepatan, ketelitian, dan

selektivitas. (Sudjadi, 2008)
Farmakokinetik meneliti perjalanan obat, mulai dari saat pemberianya, bagaimana
absorbsi dari usus transport dalam darah, dan distribusinya ketempat kerjanya dan
jaringan lainya. Begitu pula bagaimana perombakannya (biotransformasi) dan

akhirnya diekskresi oleh ginjal. Singkatnya farmakokinetik mempelajari segala

sesuatu tindakan yang dilakukan tubuh terhadap obat. (Tjan Hoan Tjay, 2007)
Ketersediaan hayati digunakan untuk memberi gambaran mengenai keadaan dan
kecepatan obat diabsorbsi dari bentuk sediaan dan digambarkan dengan kurva kadarwaktu setelah obat diminum dan berada pada jaringan biologic atau larutan sperti
darah dan urine.
Data ketersediaan hayati digunakan untuk menentukan:
1. Jumlah atau bagian obat yang diabsorbsi dari bentuk sediaan.
2. Kecepatan obat diabsorbsi.
3. Masa kerja obat berada di dalam cairan biologik atau jaringan, bila dihubungkan
dengan respon pasien.
4. Hubungan antara kadar obat dalam darah dengan efektivitas terapi/efek toksik.
Penilaian ketersediaan hayati dapat dilakukan dengan metode menggunakan
data darah, data urin, dan data farmakologis atau klinis, namun lazimnya
dipergunakan data darah atau data urin untuk menilai ketersediaan hayati sediaan obat
yang metode analisis zat berkhasiatnya telah diketahui cara dan validitasinya. Jika
cara dan validitas belum diketahui, dapat digunakan data farmakologi dengan syarat
efek

farmakologi

yang

timbul

dapat

diukur

secara

Cuplikan darah sangat relevan, karena semua proses obat dalam tubuh

kuantitatif.
melibatkan

darah sebagai media, suatu alat ukur dari organ satu ke organ lain seperti
absorpsi,distribusi, metabolisme, ekskresi.
Pengukuran
darah,

konsentrasi

serum,

a d a l a h pendekatan secaralangsung

obat

atau
yang

paling

di
plasma

baik

untuk

menilai

farmakokinetik obat ditubuh.

Darah mengandung elemen seluler mencakup sel darah merah, sel darah
putih,keping darah, dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum
atau plasma digunakan untuk pengukuran obat.Untuk mendapatkan serum, darah
dibekukan dan serum diambil dari supernatan setelah disentrifugasi. Plasma diperoleh

dari supernatan darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan antikoagulan seperti

heparin.Olehkarenaitu, serum dan plasma tidaksama.
P l a s m a m e n g a l i r keseluruh jaringan tubuh termasuk semua elemen
seluler dari darah.dengan berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan
equilibrium

dengan jaringan, perubahan

konsentrasi

obat

akan

merefleksikan

perubahan konsentrasi obat di jaringan

Selain itu serum adalah plasma yang fibrinogennya telah dihilangkan dengan
proses penjendalan, sedangkan plasma diperoleh dengan menambahkan suatu
pencegah penjendalan ke dalam darah. Bila darah tidak diberi antikoagulan terjadilah
penjendalan dan bila contoh seperti dipusingkan maka beningannya adalah serum.

III

ALAT DAN BAHAN

ALAT :
1 labu takar

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

mikropipet
tabung reaksi
tabung penampung darah (ephendrof)
vortex-mixer
sentrifuge
spektrofotometer uv
scalpel
pipet volume
filler
pipet tetes
beaker glass
sonikator

BAHAN :
1 Paracetamol
2 Asam trikloroasetat (TCA) 20%
3 Asam sulfamat 15%
4 HCl 6N
5 Heparin
6 NaOH 10%
7 Aquadest
Hewan uji : tikus

ANALISIS BAHAN
Paracetamol (Asetaminofen)

Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki

khasiat sebagai analgesik, antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah.
Parasetamol merupakan analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk
pengobatan gejala berbagai tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit
kepala hipertensi.

Pemerian
Berat jenis
Titik lebur
Kelarutan

: serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.

: 1.263 g/cm3
: 169C (336F)
: dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20C); larut
dalam air medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut
dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform,
praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene
Nama Kimia : N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau
4- hidroksiasetanilida
Rumus Empiris: C8H9NO2
Berat Molekul : 151,16
Jarak lebur
: antara 168-172 (Depkes RI, 1995).
Efek samping : nefrotoksisitas dan karsinogen

Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan

asam pada panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam
larutan basa pada panjang gelombang 257 nm (A11=715a)
sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506,
1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm1. (Moffat dkk, 2005).
Resorpsinya dari usus cepat dan praktis tuntas, secara rectal lebih
lambat. PP-nya ca 25%, plasma-t1/2-nya 1-4 jam. Antara kadar plasma dan
efeknya tidak ada hubungan. Dalam hati zat ini diuraikan menjadi
metabolit toksis yang diekskresi dengan kemih sebagai konjugatglukuronida dan sulfat.
(Tan Hoan Tjay. 2007. Halaman 318)

IV. SKEMA KERJA

1. Pembuatan larutan stok paracetamol
Timbang paracetamol 100,0mg

Dilarutkan dalam aquadest panas ad 100,0 ml

Kadar menjadi
2. Pembuatan
kurva 1mg/L
baku atau 1000
g/ml

Darah 250l mengandung

heparin 250 l larutan stok paracetamol
Ditambah

Kadar menjadi 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 g/ml
Campur sampai homogen

Ditambahkan TCA 20% 2,0ml dengan vortexing

3. Pemrosesan sampel darah in vivo (sebagai blangko)
Darah 250l mengandung heparin

2,0mlgelombang
TCA 20% ke dalam tabung centrifugasi
4. Ditambahkan
Mencari panjang

Disentrifuge butir 2 dan 3 tersebut

menit,2500rpm)
Diambil(10
supernatant
(1,5ml) di labu takar
Dimasukkan labu takar 10,0ml
Ditambah HCL 6N (0,5ml)
Ditambah NaNO2 10% (1,0ml)
Campur ad homogen
Diamkan 15 menit (suhu <15 drjt C)
Ditambah asam sulfamat 15% (1ml) melalui dinding
Ditambah NaOH 10% (3,5ml)
Ad aquadest

Baca intensitas
di spektrofotometer
dengan panjang gelombang 435nm
5. Validasi
metodewarna
penetapan
kadar paracetamol
a. Mencari panjang gelombang dan operating time
Larutan paracetamol dengan kadar 400 g/ml

Diukur serapannya pada panjang gelombang 380-580nm

b. Mencari kurva baku

Diukur resapan pada panjang gelombang maksimal larutan Paracetamol dalam
darah dengan kadar (100 700 ) g/ml

Dibuat kurva baku hubungan antara resapan terhadap kadar masing-masing

Dibuat persamaan garis

Dihitung nilai r nya

c. Mencari harga perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistemik

Absorbansi dari butir 4dan 5a dihitung kadarnya, kadar rata-rata dan

simpangan baku.

Dihitung harga perolehan kembali dan kesalahan acak dan kesalahan

sistematik

DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

Paracetamol
1. Pembuatan kurva baku internal Paracetamol
100 mg/100 ml 1 mg/ml 1000 g/ml
Penimbangan Paracetamol
Kertas + Paracetamol

0,5882 gram

Kertas + sisa

0,4887 gram

Paracetamol

0,0995 gram =

99,5 mg

Konsentrasi Paracetamol sebenarnya

Konsentrasi Paracetamol

99,5mg
g
=995
100 ml
ml

Deret Baku
0 g/ml (blanko)

Koreksi Kadar
0 g/ml (blanko)

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 0

0 . 995

500 . C2

V1

0 l induk +

C2 =

0 g/ml

500 l darah

100 g/ml

100 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 100

50 . 995

500 . C2

V1

50 l induk +

C2

99,5 g/ml

450 l darah

200 g/ml

200 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 200

100 . 995

500 . C2

V1

100 l induk +

C2

199 g/ml

400 l darah

300 g/ml

300 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 300

150 . 995

500 . C2

V1

150 l induk +

C2

298,5 g/ml

350 l darah

400 g/ml

400 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 400

200 . 995

500 . C2

V1

200 l induk +

C2 =

398 g/ml

300 l darah

500 g/ml
V1 . C1

V2 . C2

500 g/ml
V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 500

V1

250 l induk +

250 . 995
C2 =

500 . C2

497,5 g/ml

250 l darah

600 g/ml

600 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 600

300 . 995

500 . C2

V1

300 l induk +

C2 =

597 g/ml

200 l darah

700 g/ml

700 g/ml

V1 . C1

V2 . C2

V 1 . C1

V 2 . C2

V1 . 1000

500 . 700

350 . 995

500 . C2

V1

350 l induk +

C2

696,5 g/ml

150 l darah

total darah yang diperlukan = 500 l + 450 l + 400 l + 350 l + 300 l + 250 l +
200 l + 150 l =2.600 l = 3 ependrof

Pengukuran Kurva baku Paracetamol max 435 nm

Absorbansi

Absorbansi

Absorbansi

Kelompok IV

Kelompok V

Kelompok VI

99,5

0,180

0,053

0,174

199

0,378

0,083

0,269

298,5

0,518

0,171

0,344

398

0,594

0,256

0,477

497,5

0,605

0,621

0,499

597

0,765

0,697

0,567

696,5

0,779

0,755

0,798

Konsentrasi (g/ml)

Kelompok IV

a = 0,1656

b = 9,5466 x 10-4

r = 0,9600

y = bx + a
y = 0,0009546 x + 0,1656

A = 0,180
y
0,180
x
A = 0,378
y
0,378
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 15,0848 g/ml
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 222,5015 g/ml

A = 0,518
y
0,518
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 369,1598 g/ml

A = 0,594
y
0,594
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 448,7743 g/ml

A = 0,605
y
0,605
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 460,2975 g/ml

A = 0,765
y
0,765
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 627,9069 g/ml

A = 0,779
y
0,779
x

= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 9,5466.10-4x + 0,1656
= 642,5728 g/ml

Kelompok V
a = -0,1640
y = bx + a

b = 0,1358 x 10-4

r = 0,9612

y = 0,001358 x + 0,1656

A = 0,053
y
0,053
x
A = 0,083
y
0,083
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 159,7938 g/ml
= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 181,0851 g/ml

A = 0,171
y
0,171
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 246,6863 g/ml

A = 0,256
y
0,256
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 309,2784 g/ml

A = 0,621
y
0,621
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 578,0559 g/ml

A = 0,697
y
0,697
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 634,0206 g/ml

A = 0,755
y
0,755
x

= 0,001358x - 0,1640
= 0,001358x - 0,1640
= 676,7304 g/ml

Kelompok VI
a = 0,0731

b = 9,4149 x 10-4

y = bx + a
y = 0,0009415x + 0,0731

A = 0,174
y

= 0,0009415x + 0,0731

r = 0,9759

0,174
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 108,2315 g/ml

A = 0,269
y
0,269
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 209,1344 g/ml

A = 0,344
y
0,344
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 288,7945 g/ml

A = 477
y
0,477
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 430,0584 g/ml

A = 0,499
y
0,499
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 453,4254 g/ml

A = 0,567
y
0,567
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 525,6506 g/ml

A = 0,798
y
0,798
x

= 0,0009415x + 0,0731
= 0,0009415x + 0,0731
= 771,0037 g/ml

PERHITUNGAN % RECOVERY
kadar terukur
Perolehan Kembali kadar diketa hui 100
Kadar
diketahui
99,5
199
298,5
398
497,5

Kadar Terukur
% Recovery
Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok
IV
15,0848
222,5015
369,1508
448,7743
460,2975

V
159,7938
181,8861
246,6863
309,2784
578,0559

VI
108,2315
209,1344
288,7945
430,0584
453,4254

IV
15,16
106,97
118,32
107,88
88,52

V
160,60
87,45
79,07
74,35
111,16

VI
108,78
100,55
92,56
103,38
87,20

597
696,5

627,9069
642,5728

634,0206
676,7304

525,6506
771,0037

100,63
88,27

101,61
92,96

84,24
105,91

PERHITUNGAN KESALAHAN SISTEMATIS

Kesalahan Sistemis

= 100 % Recovery

Kadar

Kesalahan Sistematis (%)

diketahui

Kelompok IV
84,84
-6,97
-18,32
-7,88
11,48
-0,63
11,73

99,5
199
298,5
398
497,5
597
696,5

Kelompok V
-60,60
12,55
20,93
25,65
-11,16
-1,61
7,04

Kelompok VI
-8,78
-0,55
7,44
-3,38
12,80
15,76
-5,91

PERHITUNGAN KESALAHAN ACAK

Kesalahan acak

Kadar
diketahui
99,5
199
298,5
398
497,5
597
696,5

Kelompok

simpangan baku
x 100
ratarata

Kadar Terukur
Kelompok Kelompok

IV

VI

15,0848
222,5015
369,1508
448,7743
460,2975
627,9069
642,5728

15,0848
222,5015
369,1508
448,7743
460,2975
627,9069
642,5728

15,0848
222,5015
369,1508
448,7743
460,2975
627,9069
642,5728

Kesalahan
SD
73,34
20,7
62,22
75,72
70,06
60,88
66,52

Acak (%)
94,37
204,51
301,54
396,04
497,26
595,86
696,77

77,72
10,12
20,63
19,12
14,09
10,22
9,55

PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini dilakukan optimasi metode analisis obat dengan tujuan
memahami langkah-langkah analisa obat di dalam darah dan mampu melakukan
validasinya. Suatu metode analisa obat perlu divalidasi agar hasil analisis yang diperoleh
sesuai dengan nilai-nilai parameter farmakokinetik obat dan dapat dipercaya. Metode
analisa obat dikatakan valid jika metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan
kembali yang tinggi (parameter:75%-90% atau lebih), kesalahan acak dan sistematiknya
yang rendah (parameter: < 10%). Pada percobaan ini digunakan darah karena darah
merupakan tempat yang paling cepat dicapai obat dan paling logis bagi penetapan kadar
obat di dalam tubuh.
Suatu metode dapat dikatakan valid apabila memenuhi beberapa kriteria diantaranya
sensitivitas, spesifitas, akurat, presisi, dan praktis. Sensitivitas adalah suatu metode yang
digunakan dapat menetapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil.

Spesifitas

dari suatu metode yaitu jika metode tersebut hanya dapat digunakan untuk menetapkan
kadar dari senyawa yang kita inginkan. Akurat yaitu dari pengukuran menggunakan
metode tertentu dapat dihasilkan nilai rata-rata yang mendekati nilai sesungguhnya.
Presisi adalah dari suatu seri pengukuran didapat hasil satu sama lain yang hamper sama.

Praktis yaitu metode yang akan dilakukan mudah,tidak memerlukan waktu pengerjaan
yang lama dan dilihat dari segi ekonomi metode tersebut tidak memerlukan biaya yang
banyak.
Praktikum kali ini kelompok kami mendapatkan obat paracetamol (analgesikantipiretik) untuk ditetapkan kadar senyawanya. Adapun mekanisme dari Paracetamol
adalah hambatan terhadap enzim siklooksigenase yang menyebabkan adanya
prostaglandin, suatu mediator yang berperan penting dalam proses terjadinya inflamasi,
nyeri dan demam.
Hewan uji yang digunakan adalah tikus, yang diambil darahnya pada bagian vena
ekor. Sampel diambil dari ekor tikus dengan cara memotong sedikit pada ujung ekor
tikus dan ditampung dalam ependorf yang sudah diberi heparin. Heparin digunakan agar
darah yang berada di ependrof tidak cepat menggumpal. Selain itu, heparin juga dapat
menjernihkan plasma yang mengandung lipid. Mekanisme heparin adalah meningkatkan
efek antitrombin III dan menginaktifasi trombin (demikian juga dengan faktor koagulan
IX, X, XI, XII dan plasmin) dan mencegah konversi fibrinogen menjadi fibrin. Akibatnya
tidak terbentuk benang-benang fibrin dan darah menjadi encer atau tidak menggumpal.
Jika darah susah keluar bisa diberi etanol pada ekor dengan cara dioleskan dengan kapas
sambil diurut, supaya aliran darahnya lancar.
Larutan stok dibuat kurva baku dengan kadar 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, dan 700
untuk baku Paracetamol, fungsi dari deret baku ini untuk membuat suatu persamaan
regresi linier. Lalu masing-masing kadar ditambah dengan larutan TCA 20% sebanyak
2,0 ml dan divortexing. Vortexing bertujuan untuk menghomogenkan pencampuran
antara heparin dan darah. Kemudian dilakukan proses pemusingan dengan menggunakan
sentrifuge pada kecepatan 2500 rpm selama 5-10 menit.
Proses sentrifuge bertujuan untuk membantu larutan TCA dalam memisahkan protein
dari darah. Proses sentrifuge juga dilakukan untuk lebih mengendapkan protein plasma
darah dan didapatkan plasmanya dalam bentuk beningan (supernatan). Larutan TCA
mampu mengendapkan protein darah karena ion negative dari larutan TCA mampu
bergabung dengan protein darah yang bermuatan positif (sebagai kation). Pada dasarnya
di dalam darah mengandung suatu protein, diantaranya albumin. Tanpa larutan TCA
protein darah mampu berikatan dengan obat terutama albumin. Juga dengan adanya
protein dapat menggangu dalam pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer.

Baku tengah paracetamol yaitu 400 g/ml digunakan untuk mengukur operating time
dan panjang gelombang. Tahap selanjutnya diambil 1,5 ml supernatan. Kemudian
supernatan ditambah NaNO2 10% dan 0,5 ml HCl untuk reaksi diazotasi, yaitu
pembentukan garam diazonium yang sangat reaktif. Dengan adanya reaksi diazotasi
inilah yang menyebabkan paracetamol dapat diukur di spektrofotometer.
Reaksi ini dikenal dengan reaksi diazotasi, dengan persamaan yang berlangsung
dalam dua tahap seperti dibawah ini :

NaNO2 + HCl NaCl + HNO2

Ar- NH2 + HNO2 + HCl Ar-N2Cl + H2O
(Zulfikar, 2010).
Reaksi ini tidak stabil dalam suhu kamar, karena garam diazonium yang terbentu
mudah tergedradasi membentuk senyawa fenol dan gas nitrogen. reaksi dilakukan pada
suhu dibawah 15oC.

Karena alasan itulah setelah penambahan HCl dan NaNO 2 didiamkan selama 15
menit dibawah suhu <15oC. agar garam dizonium yang terjadi tidak mudah
terdegradasi membentuk senyawa fenol dan gas nitrogen. Selanjutnya ditambahkan
asam sulfamat dan NaOH. Fungsi penambahan asam sulfamat ini adalah agar tidak
tebentuk HNO2 yang berlebih. Apabila HNO2 bereaksi dengan TCA, akan membentuk
ion nitroniuom yang menyebabkan reaksi diazotasi tidak sempurna. Hal yang
menujukkan hilangnya HNO2 yaitu dengan berkurangnya gas N2 atau gelembung
udara yang terbentuk. Penambahan NaOH bertujuan untuk melarutkan parasetamol
dan untuk meningkatkan intensitas serapan(absorbansi).
Dalam praktikum ini, didapatkan operating time selama 10 menit yang ditandai
dengan nilai absorbansi sampel sudah konstan. Tahap selanjutnya, dibuat kurva baku
untuk Paracetamol 100 g/ml 700 g/ml sehingga diperoleh persamaan kurva baku
untuk masing masing kelompok. Kemudian dihitung perolehan kembali atau recovery.

Dimana perolehan kembali merupakan tolok ukur afisiensi analisis. Perolehan

kembali diperoleh dengan membandingkan kadar terukur dengan kadar yang
sesungguhnya dalam satuan persen. Apabila nilai perolehan kembali mendekati nilai
yang sesungguhnya, maka metode yang digunakan dapat dikatakan akurat.
Pada konsentrasi 99,5 g/ml yaitu 160,60% dan 108,78%. Pada konsentrasi 298,5
g/ml yaitu 82,64% dan 96,75%. Pada konsentrasi 497,5 g/ml yaitu 116,19% dan
91,14%. Berdasar data yang didapatkan metode analisa yang digunakan untuk analisis
Parasetamol dinyatakan tidak valid karena tidak memenuhi syarat secara keseluruhan.

G. Kesimpulan
1. Optimasi metode analisis mempunyai tujuan untuk menjamin bahwa metode
analisis yang digunakan memenuhi syarat yang sesuai dan dapat diterima sesuai
dengan tujuan yang ditetapkan.
2. Bahan obat yang digunakan adalah Paracetamol
3.

Hasil

perhitungan
Kesalahan

paracetamol
acak

menunjukkan

Dan

nilai

recovery

kesalahan

yang

sistematis

sehingga disimpulkan bahwa metode yang digunakan untuk analisis

paracetamol tidak valid.
4. Validasi metode analisis yang tidak akurat ini dapat disebabkan pengaruh alat
dan pengerjaan yang tidak sesuai prosedur. Pengaruh alat misalnya kalibrasi alat yang
jarang dilakukan juga mungkin perawatan yang tidak maksimal. Sedangkan pengaruh
pengerjaan yang dominan adalah factor manusia yang tidak teliti dalam pengerjaan
validasi metode analisis obat.

H. Daftar Pustaka
1. Gandjar, G.H., (2007). Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta
2. Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C dan Zhang X.M. (2004). Analytical Method
Validation and Instrument Performance Verification. Canada: A John Wiley & Sons
Inc. Hal 11-49
3. Riyadi, W. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di http://www.chem-istry.org
4. Sudjadi. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka pelajar
Yogyakarta.
5. Tjay, Tan Hoan dan Kirana Rahardja. 2007. Obat-Obat Penting. Jakarta: PT Elex
Media Komputindo.