Anda di halaman 1dari 44

UJI INHIBISI EKSTRAK ETANOL DAUN SRIKAYA (Annona

squamosa L.) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM XANTIN


OKSIDASE SECARA IN VITRO

Proposal Penelitian untuk Skripsi

oleh
NANDYA ARDYA GHARINI
G1F013048

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN


FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
JURUSAN FARMASI
PURWOKERTO
2016

PERNYATAAN
1

Yang bertanda tangan di bawah ini saya :


Nama

: Nandya Ardya Gharini

Nomor Mhs

: G1F013048

Judul Penelitian

: Uji Inhibisi Ekstrak Etanol Daun Srikaya (Annona

Squamosa L.) Terhadap Aktivitas Enzim Xantin Oksidase


secara In Vitro
Menyatakan bahwa penelitian ini adalah hasil karya skripsi saya dan di
dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh
gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga
tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah tertulis atau diterbitkan oleh orang
lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam
daftar pustaka.

Purwokerto, 2016

(Nandya Ardya Gharini)

Proposal Penelitian untuk Skripsi


UJI INHIBISI EKSTRAK ETANOL DAUN SRIKAYA (Annona
squamosa L.) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM XANTIN
OKSIDASE SECARA IN VITRO

Oleh :
NANDYA ARDYA GHARINI
G1F013048
Telah disetujui dan disahkan
Pada tanggal ........................

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Sri Sutji Susilowati, M.Si., Apt


NIP. 19521208 198703 2 001

Esti Dyah Utami, M. Sc., Apt


NIP. 19841005 200801 2 009

Mengetahui,
Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan
Universitas Jenderal Soedirman
Wakil Dekan Bidang Akademik

Dr. Saryono, S.Kep., M. Kes


NIP. 19761210 200212 1 001

DAFTAR ISI
Halaman
PERNYATAAN..................................................................................................... ii
PENGESAHAN.................................................................................................... iii
DAFTAR ISI.......................................................................................................... iv
DAFTAR GAMBAR............................................................................................. v
DAFTAR TABEL.................................................................................................. vi
BAB I. PENDAHULUAN.................................................................................... 1
A.
B.
C.
D.
E.

Latar Belakang.............................................................................................
Perumusan Masalah.....................................................................................
Tujuan Penelitian.........................................................................................
Manfaat Penelitian.......................................................................................
Keaslian Penelitian.......................................................................................

1
2
2
3
3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................... 5


A. Penyebaran tanaman (J. curcas).................................................................. 5
B. Ekstraksi dan Maserasi................................................................................. 7
C. Inflamasi....................................................................................................... 8
D. Karagenin..................................................................................................... 9
G. Landasan Teori............................................................................................. 9
H. Hipotesis...................................................................................................... 11
BAB III. METODE PENELITIAN....................................................................... 12
A. Waktu danTempat Penelitian........................................................................ 12
B.
C.
D.
E.
F.
G.

Bahan dan Alat............................................................................................. 12


RancanganPenelitian.................................................................................... 13
Jalannya Penelitian....................................................................................... 14
Analisis Data................................................................................................ 17
Jadwal Penelitian.......................................................................................... 18
Skema Penelitian.......................................................................................... 19

BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................. 20

A. Ekstraksi dan Fraksinasi Daun J. curcas...................................................... 20


B. Uji Aktivitas Antiinflamasi.......................................................................... 21
C. Keterbatasan Penelitian................................................................................ 30
DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 31
LAMPIRAN.............................................................................................. 34

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1.Jarak Pagar(J. curcas)....................................................................... 6

Gambar 2.2.Struktur Natrium Diklofenak............................................................. 9


Gambar 3.1.Skema Jalannya Penelitian................................................................ 19
Gambar 4.1.Kenaikan volum edema terhadap waktu pada tikus yang diinduksi
karagenan......................................................................................... 22
Gambar 4.2.Diagram Daya Antiinflamasi (DAI) pada tikus yang diinduksi
karagenan dan diberikan obat........................................................... 24
Gambar 4.3.Jumlah neutrofil pada jaringan kaki tikus Wistar yang di induksi
karagenan dengan pewarnaan Hematoksilin-eosin pada perbesaran
400x dengan miskroskop Nikon....................................................... 27

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1.Jadwal Penelitian................................................................................... 19


Tabel 4.1.Bobot serbuk, bobot ekstrak, dan FTLNH daun J. curcas ................... 20
Tabel 4.2.Purata Area Under Curve/ AUC0-6 (%jam) pada kelompok kontrol dan
perlakuan FTLNH daun J. curcas setelah diinduksi karagenan 1%...... 23
Tabel 4.3Rata-rata jumlah neutrofil pada kelompok kontrol dan perlakuan FTLNH
daun J. curcas setelah diinduksi karagenan 1%.................................... 26

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit gout atau pirai adalah keadaan gangguan metabolik pada


manusia yang diderita oleh lebih dari 2 milyar penduduk di dunia dan dapat
menyerang pria, wanita, usia tua atau muda bahkan anak kecil (Kramer and
Curhan, 2002). Di Indonesia, penyakit reumatik (gout) menduduki peringkat
kedua terbanyak setelah osteoarthritis. Gout terjadi bila timbunan kristal
monosodium urat monohidrat (MSU) di persendian meningkat. Timbunan
kristal ini menimbulkan peradangan jaringan yang memicu timbulnya reumatik
gout akut (Dalimartha, 2001). Asam urat merupakan hasil akhir dari
katabolisme nukleotida purin yang berlangsung di dalam tubuh. Purin yang
berasal dari dalam tubuh merupakan penghancuran dari sel-sel yang sudah tua
dan sintetsis dari CO2, glisin, asam aspartat, glutamin, dan asam folat
(Dalimartha, 2008). Secara alami, asam urat diproduksi dalam tubuh melalui
jalur metabolisme yang menggunakan makanan dan minuman sebagai substrat.
Mengkonsumsi makanan dengan kandungan purin tinggi seperti kacangkacangan, melinjo atau emping, jeroan, dan minuman yang mengandung kafein
seperti kopi, teh serta kola dapat menaikkan kadar asam urat dalam darah
(hiperurisemia) (Sustrani and Lany, 2005). Keadaan hiperurisemia juga
disebabkan karena adanya katabolisme purin menjadi xantin lalu menjadi asam
urat oleh aktivitas enzim xantin oksidase. Biasanya penyakit gout dapat
dicegah dengan menginhibisi xantin oksidase melalui pemberian obat-obat
sintetik baik itu urikosurik maupun urikostatik (alopurinol) (Dewani and
Sitanggang, 2006). Penggunaan alopurinol dapat menimbulkan efek samping
mual, muntah dan diare dapat juga terjadi neuritis perifer, depresi unsur
sumsum tulang belakang dan kadang-kadang anemia aplastika. Dilaporkan

juga terjadi toksisitas hati dan nefritis intestinal. Alopurinol juga dapat terikat
ke lensa mata yang akan menyebabkan katarak (Katzung, 1995). Oleh karena
itu perlu dilakukan pencarian alternatif baru dengan mengembangkan
penggunaan obat tradisional yang cenderung lebih aman. Saat ini penggunaan
tanaman obat sebagai obat alternatif semakin meningkat, sehingga diperlukan
penelitian agar penggunaannya sesuai dengan kaidah pelayanan kesehatan,
yaitu secara medis harus dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah tentang
khasiat, keamanan dan standar kualitasnya (Depkes RI, 2002).
Salah satu tanaman yang dapat digunakan sebagai antihiperurisemia
adalah srikaya (Annona squamosa L.). Hasil uji metabolit sekunder daun
srikaya mengandung flavonoid, fenolik, saponin, triterpenoid, steroid, alkaloid,
dan kumarin (Purwaningsih, 2015). Flavonoid dapat berfungsi sebagai penurun
kadar asam urat melalui penghambatan enzim xantin oksidase. Sarawek et al.
(2007) menyatakan bahwa beberapa senyawa flavonoid yang memiliki
aktivitas penghambatan xantin oksidase antara lain luteolin, apigenin,
kaemferol, dan kuersetin. Berdasarkan mekanisme ini, daun srikaya diduga
mempunyai indikasi untuk menurunkan kadar asam urat dalam darah karena
kandungan flavonoid di dalamnya. Untuk mendapatkan data ilmiah mengenai
efek antihiperurisemia daun srikaya, maka perlu dilakukan penelitian uji
inhibisi ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) terhadap aktivitas
enzim xantin oksidase secara in vitro.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian diatas maka dapat dirumuskan permasalahan, yaitu :
1. Apakah ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) mengandung
senyawa flavonoid ?

10

2. Apakah ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) mempunyai


daya inhibisi terhadap aktivitas enzim xantin oksidase ?
3. Berapa konsentrasi ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.)
yang menghasilkan penghambatan aktivitas xantin oksidase sebesar 50%
(IC50) ?
C. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mengetahui apakah ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.)
mengandung senyawa flavonoid
2. Mengetahui apakah ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.)
mempunyai daya inhibisi terhadap aktivitas enzim xantin oksidase
3. Mengetahui konsentrasi ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa
L.) yang menghasilkan penghambatan aktivitas xantin oksidase sebesar
50% (IC50)
D. Manfaat Penelitian
Penelitian ini akan memberikan informasi kepada masyarakat tentang
pengaruh ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) yang dapat
menghambat pembentukan asam urat yang berlebihan melalui inhibisi xantin
oksidase.
E. Keaslian Penelitian
Penelitian mengenai uji antihiperurisemia ekstrak etanol daun srikaya
(Annona squamosa L.) secara in vitro belum pernah dilakukan, sedangkan
untuk penelitian secara in vivo sudah dilakukan. Beberapa penelitian terkait
mengenai pemanfaatan daun srikaya, antara lain:
1. Purwita et al. (2013) melaporkan bahwa ekstrak daun srikaya dapat
digunakan sebagai pengendali jamur. Penelitian menunjukkan bahwa
ekstrak daun srikaya berpengaruh terhadap pertumbuhan diameter koloni

11

miselium jamur F. oxysporum. Konsentrasi yang optimal dalam penelitian


ini ialah konsentrasi 6,5 % karena dapat menghambat pertumbuhan F.
oxysporum dengan rata-rata diameter koloni sebesar 2,840,30 cm dan
persentase penghambatannya sebesar 60 %.
2. Putra (2014) membuktikan bahwa ekstrak daun srikaya dapat digunakan
sebagai antiradikal bebas. Ekstrak yang memiliki aktivitas sebagai
antiradikal bebas yaitu ekstrak etil asetat (IC50 = 2,87 ug/mL ) dan ekstrak
etanol (IC50 = 12,69 ug/mL). Kedua ekstrak daun srikaya (Annona
squamosa L.) memiliki aktivitas yang sangat kuat sebagai antiradikal
bebas (< 50 ug/mL).
3. Endrawati and Saputri (2015) membuktikan bahwa ekstrak perasan dan
infusa daun srikaya memiliki aktivitas antelmitik terhadap cacing gelang
ayam. Efektivitas yang baik ditunjukkan pada konsentrasi 75 g/100 ml,
namun masih lebih rendah dibandingkan dengan pirantel pamoat 0,4 %.
4. Endah (2016) membuktikan bahwa ekstrak etanol daun srikaya dapat
digunakan sebagai antikolestrol. Pemberian ekstak etanol daun srikaya
dapat menurunkan kolesterol LDL pada eksperimen tikus hiperlipidemia
dengan dosis optimum 0,25mg/gBB dengan p = 0,025 (p<0,05).
5. Nurilahi (2015) melakukan penelitian uji aktivitas antihiperurisemia
ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) terhadap tikus putih
jantan galur Sprague Dawley yang diinduksi potassium. Hasil penelitian
ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun srikaya dapat
menurunkan kadar asam urat secara signifikan pada dosis uji I yaitu 67,5
mg/KgBB tikus dengan persentase efektivitas 46,87 %, dosis uji II yaitu
135 mg/KgBB tikus dengan persentase efektivitas 93,75 % dan dosis uji
III yaitu 270 mg/KgBB tikus dengan persentase efektivitas 60 %. Dosis

12

yang paling efektif dapat menurunkan kadar asam urat adalah dosis uji II
yaitu 135 mg/KgBB tikus.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Landasan Teori
1. Tumbuhan Srikaya (Annona squamosa L.)
a. Sistematika Tumbuhan
Klasifikasi tanaman srikaya dalam sistematika tumbuhan sebagai berikut :
Divisio

: Spermatophyta

Subdivisio

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledoneae

Ordo

: Ranales

Familia

: Annonaceae

Genus

: Annona

Spesies

: Annona squamosa Linn


(Irawati, 2001)

b. Nama Daerah dan Nama Asing

13

Tanaman

srikaya

mempunyai

bermacam-macam

sebutan.

Masyarakat Aceh menyebut srikaya adalah delima bintang atau serba


bintang, orang Melayu menyebutnya delima srikaya, dan seraikaya bagi
masyarakat di daerah Lampung. Sarikaya adalah sebutan untuk tanaman
srikaya di daerah Sunda, dan orang Jawa menyebutnya serkaya atau
surikaya. Masyarakat Madura, Gorontalo, dan Buru menyebutnya
sarkaya, serekaya, dan sirikaya, ata bagi masyarakat Timor, sirkaya bagi
masyarakat Bali, srikaya kebo bagi masyarakat Sumbawa, nagametawata
bagi orang-orang Sumba, dan garoso bagi masyarakat Bima. Masyarakat
Sulawesi Utara, Ternate, dan Tidore menyebutnya atis, sedangkan
masyarakat halmahera menyebutnya atisi atau hirikaya (Ahmad, 2007).
c. Morfologi Tumbuhan

Gambar 2.1 Tanaman Srikaya

Pohon atau perdu, tinggi 2-7 m. Daun elliptis memanjang sampai


bentuk lanset tumpul 6-17 kali 2,5-7,5 cm, tepi rata. Bunga 1-2
berhadapan atau di samping daun. Daun kelopak segitiga, waktu kuncup
bersambung secara katup (klepsgewijs), kecil. Daun mahkota yang
terluar berdaging tebal, panjang 2-2,5 cm, dari putih kuning, dengan
pangkal yang berongga akhirnya ungu. Daun mahkota yang terdalam
sangat kecil atau tidak ada. Dasar bunga dipertinggi. Benang sari banyak,

14

putih. Penghubung ruang sari di atas ruang diperpanjang dan melebar dan
menutup ruangnya. Bakal buah banyak, ungu tua. Kepala putik duduk,
rekat menjadi satu, mudah rontok. Buah majemuk lengkung bentuk bola,
garis tengah 5-10 cm, berlilin. Anak buah khususnya dengan ujung yang
melengkung, pada waktu masak sedikit atau banyak melepaskan diri satu
dengan yang lain. Biji masak mengkilat. Daging buah putih. Pohon buahbuahan dari Hindia Barat, banyak ditanam (Steenis, 2005).

d. Kandungan Kimia
Hegnaur (1986) menyebutkan bahwa daun srikaya mengandung
mirisil alkohol senyawa polifenol, flavonoid, leukosianidin, asam kafeat,
asam kumarat, sedangkan pada buahnya mengandung protein, kalsium,
fosfor, gula, vitamin A, vitamin C, asam amino, dan tanin pada daun
buah muda. Biji srikaya mengandung selulosa, amilum, lemak, protein,
gula, resin, minyak lemak, bahan beracun, asetogenin (Annonacin-A,
Skuamosten-A, Neoannonin, Squamocin-I, Squamocin-K, Squamocin-N,
Squamocin-E,
Squamocin-D

Squamocin,

Annonin-III

(asiminacin),

(metrilin),

Squamocin-F,

Squamocin-B,

Squamostatine-A

(almuneguin), Squamostatine-D, Squamostatine-E. Akar dan kulit batang


srikaya mengandung senyawa borneol, kamper, terpen, alkaloid
annonain, asetogenin, (squamone,2,4 cis dan trans bullatacinone).
e. Khasiat Tanaman
Berbagai bagian tumbuhan srikaya di Indonesia, seperti daun,
akar, buah, kulit batang, dan biji, digunakan dalam pengobatan

15

tradisional untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Misalnya,


daun tumbuhan ini digunakan untuk mengatasi encok, batuk, salesma,
demam, rematik, gangguan saluran pencernaan seperti diare, disentri, dan
penyakit kulit, seperti borok, luka, bisul, kudis, ekzema, dan menurunkan
kadar asam urat yang tinggi dalam darah. Adapun biji A.squamosa
digunakan untuk pengobatan gangguan pencernaan dan cacingan,
sedangkan buah tumbuhan ini digunakan pula untuk gangguan pecernaan
seperti diare dan disentri. Akar dan kulit batang digunakan untuk
mengatasi gangguan saluran pencernaan seperti sembelit, diare, dan
disentri. Dilaporkan pula bahwa buah A.squamosa, kecuali sebagai bahan
minuman dan makanan, digunakan pula sebagai sari rapet, sedangan biji
digunakan sebagai insektisida (Ahmad, 2007).

2. Proses Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan yang dapat berupa kering, kental dan cair
dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa
atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi syarat
baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995).
Penyarian adalah peristiwa memindahkan zat aktif yang semula
didalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan
penyari. Cairan pelarut dalam pembuatan ekstrak adalah pelarut yang
optimal untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan
demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan, serta ekstrak hanya

16

mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan (Dirjen


POM, 2000). Salah satu contoh metode penyarian adalah maserasi, maserasi
merupakan metode yang sederhana dan banyak digunakan untuk menyari
bahan obat yang berupa serbuk simplisia yang halus (Voight, 1994).
Maserasi merupakan proses perendaman sampel menggunakan pelarut
organik pada suhu ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi
senyawa bahan alam karena melalui perendaman sampel tumbuhan akan
terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan
antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam
sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan
sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan
pengekstrak untuk proses maserasi akan memberikan efektivitas yang tinggi
melalui cara memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pelarut tersebut
(Darwis, 2000).
Pembuatan maserasi kecuali dinyatakan lain dilakukan dengan
memasukkan 10 bagian simplisia atau campuran simplisia dengan derajat
halus yang cocok kedalam sebuah bejana kemudian dituangi dengan 75
bagian cairan penyari, bejananya ditutup dan dibiarkan selama 5 hari yang
terlindung dari cahaya sambil sering diaduk. Maserat kemudian diserkai dan
ampasnya dicuci dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100
bagian. Maserat dipindahkan ke dalam bejana tertutup dan dibiarkan
ditempat sejuk dengan terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian
dienap tuang atau saring (Depkes RI, 1979). Waktu maserasi berbeda-beda
tergantung dari sifat campuran obat dan menstrum, lama maserasi harus

17

cukup agar dapat menyari semua zat yang mudah disari yaitu sekitar 2-14
hari (Ansel, 1989).
Kelemahan penyarian dengan metode maserasi ini pengerjaannya
membutuhkan waktu yang cukup lama dan penggunaan zat organik yang
biasanya beracun (Vongsak et al., 2012). Pada maserasi ini digunakan
larutan penyari etanol 96 % karena flavonoid dapat diekstraksi dengan
etanol 96 % (Harbone, 1987; Voight, 1994).

3. Hiperurisemia
Suatu keadaan dimana terjadi peningkatan kadar asam urat normal
dalam tubuh disebut hiperurisemia. Kadar asam urat yang normal pada pria
adalah dibawah 7 mg/dl, sedangkan pada wanita adalah dibawah 6 mg/dl.
Asam urat adalah hasil produksi oleh tubuh yang merupakan hasil akhir dari
metabolisme purin. Purin adalah protein yang termasuk golongan nukleoprotein. Purin didapat dari makanan yang juga berasal dari penghancuran
sel-sel tubuh yang sudah tua. Didalam tubuh, purin mengalami metabolisme
dan mengalam oksidasi menjadi asam urat, dan kelebihan asam urat akan
dibuang melalui ginjal melalui urin dan usus. Hiperurisemia yang
berkepanjangan dapat menyebabkan timbulnya penyakit gout atau pirai,
namun tidak semua hiperurisemia akan menimbulkan kelainan patologi
berupa gout. Penyakit gout adalah salah satu tipe dari arthritis (reumatik)
yang disebabkan terlalu banyaknya atau tidak normalnya kadar asam urat di
dalam tubuh karena tubuh tidak bisa mengeksresikan asam urat secara

18

normal, sehingga menimbulkan gejala nyeri hebat pada bagian sendi, seperti
pada mata kaki, lutut, pergelangan tangan dan siku. Masalah tersebut timbul
karena terbentuknya kristal-kristal dari monosodium urat monohidrat
(bentuk garam dari asam urat yang terbentuk) yang terdapat pada sendisendi dan jaringan sekitarnya (Misnadiarly, 2008).
Penyebab tingginya asam urat dalam darah dapat disebabkan oleh
beberapa hal, seperti adanya gangguan metabolisme purin bawaan, adanya
kelainan pembawa sifat atau gen, kelebihan mengkonsumsi makanan
berkadar purin tinggi (seperti daging, jeroan, kerang, kepiting, keju,
gorengan, tape, bayam, buncis, kacang tanah, petai, alpukat dan alkohol)
dan efek dari penyakit seperti leukimia, kemoterapi dan radioterapi (Murray
et al., 2006).
Penghambatan ekskresi asam urat dari dalam tubuh juga dapat
menyebabkan peningkatkan kadar asam urat dalam darah. Terdapat
beberapa faktor yang dapat menghambat ekskresi asam urat dari dalam
tubuh antara lain karena minum obat tertentu (diuretik) dalam keadaan
puasa atau diet yang terlalu ketat, keracunan, olah raga terlalu berat,
meningkatnya kadar kalsium darah akibat penyakit hiperparatiroid atau juga
hipertiroid, hipertensi dan gagal ginjal (Misnadiarly, 2008).
Terdapat gambaran klinis bagi seseorang yang menderita penyakit
gout atau arthritis, yaitu pada tahap I, terjadi hiperurisemia asimptomatik
dan belum menunjukkan gejala selain peningkatan urat serum. Lalu pada
tahap II, terjadi pembengkakan mendadak dan nyeri luar biasa, sendi-sendi
lain dapat terserang termasuk sendi-sendi jari tangan, lutut mata kaki,

19

pergelangan tangan dan siku. Tahap kedua ini disebut tahap kedua gout
arthritis. Pada tahap III terjadi interkritikal, dimana pada tahap ini tidak
ditemui gejala-gejala klinis tetentu dan berlangsung selama beberapa bulan
sampai tahun. Lalu, pada tahap IV yaitu tahap gout kronis, dimana pada
tahap ini terjadi penimbunan asam urat yang terus bertambah dalam kurun
waktu beberapa tahun jika pengobatan tidak dilakukan. Peradangan kronik
akibat kristal-kristal asam urat mengakibatkan nyeri, sakit dan kaku juga
pembesaran dan penonjolan sendi yang bengkak (Wilmana and Sulistia,
2007).
Untuk pengobatan hiperurisemia, strategi yang dapat dilakukan
adalah dengan cara meningkatkan ekskresi asam urat dengan menghambat
enzim xantin oksidase, yaitu suatu enzim yang dapat mengubah hipoxantin
menjadi xantin dan selanjutnya menjadi asam urat (Wilmana and Sulistia,
2007). Terdapat obat konvensional yang dapat digunakan dalam mengurangi
gejala penyakit ini yaitu allopurinol. Dapat digunakan juga pengobatan
tradisional menggunakan tanaman herbal (Misnadiarly, 2008) seperti herba
kumis kucing, daun salam (Muflihat, 2008), rosela, ciplukan (Yulianto,
2009), tempuyung (Susanti, 2011) dan daun gandarusa (Katrin et al., 2011).

4. Xantin Oksidase
Biosintesis purin atau pirimidin diatur dan dikoordinasikan dengan
ketat oleh mekanisme umpan balik yang menjamin agar waktu dan jumlah
produksi kedua zat tersebut selalu sesuai dengan kebutuhan fisiologis yang

20

bervariasi. Salah satu penyakit genetik metabolisme purin adalah gout


(Murray et al., 2006).
Xantin oksidase merupakan suatu kompleks enzim yang terdiri dari
molekul-molekul protein yang tiap molekulnya tersusun atas 2 mol FAD, 2
mol atom Mo dan 8 mol atom Fe. Enzim ini terdapat pada hati dan otot
tubuh manusia. Satu unit xantin oksidase dapat mengkonversi satu mol
substrat (xantin) menjadi asam urat tiap satu menit pada pH optimum (pH
7,5) dan suhu optimum (25oC) (Umamaheswari et al., 2009).
Katalisis xantin oleh enzim xantin oksidase dapat mengakibatkan
akumulasi asam urat (xantin + O2 + H2O

urat + H 2O2), dan

penumpukan urat tersebut menimbulkan penyakit gout (Owen et al., 1998).


Xantin oksidase mampu mengoksidasi hipoxantin menjadi xantin dan
selanjutnya menjadi asam urat, selama proses oksidasi, xantin membentuk
asam urat, atom oksigen ditransfer dari molibdenum ke xantin. Perombakan
pusat molibdenum yang aktif terjadi dengan penambahan air (Murray et al.,
2006). Alopurinol merupakan inhibitor xantin oksidase yang sering
digunakan dalam penyakit gout kronik, bertindak sebagai substrat dan
bersifat inhibitor kompetitif bagi enzim xantin oksidase (Collin et al., 2006).

21

Gambar 2.2 Pembentukan asam urat dari nukleosida purin melalui basa purin,
hipoxantin, xantin dan guanin (Rodwell, 2003).

5. Alopurinol

Gambar 2.3 Struktur alopurinol (Depkes RI, 1995).

Alopurinol merupakan obat yang memiliki efek dalam menurunkan


kadar asam urat dan berguna dalam mengobati penyakit pirai. Obat ini
bekerja dengan menghambat enzim xantin oksidase, yaitu enzim yang
mengubah hipoxantin menjadi xantin dan selanjutnya menjadi asam urat.
Melalui mekanisme umpan balik, alopurinol menghambat sintesis purin
yang merupakan prekursor xantin. Mekanisme kerjanya adalah alopurinol
mengalami biotransformasi oleh enzim xantin oksidase menjadi aloxantin,
sehingga tidak terbentuk adanya asam urat. Aloxantin memiliki masa paruh
yang lebih panjang daripada alopurinol, maka alopurinol yang masa
paruhnya pendek cukup diberikan satu kali sehari (Wilmana and Sulistia,
2007).

Alopurinol
menghambat

menghambat

XO

Hipoxantin

XO

Xantin

Asam urat

Gambar 2.4 Skema kerja alopurinol dalam menghambat pembentukan asam urat
oleh xantin oksidase (Berg et al., 2002).

22

Efek samping alopurinol yang sering terjadi adalah reaksi kulit.


Bila kemerahan kulit timbul, obat harus dihentikan karena gangguan
mungkin akan lebih berat. Reaksi alergi berupa demam, menggigil,
leukopenia dan leukositosis, eosinofilia, artralgia dan pruritus juga pernah
dilaporkan. Gangguan saluran cerna kadang-kadang juga dapat terjadi.
Dosis untuk penyakit pirai ringan yaitu 200-400 mg sehari dan 400-600 mg
untuk penyakit yang lebih besar (Wilmana and Sulistia, 2007).
6. Flavonoid
Flavonoid merupakan senyawa turunan 1,3 difenilpropan yang
umumnya tersebar di seluruh dunia tumbuhan. Kerangka dasar flavonoid
biasanya diubah sedemikian rupa, sehingga terdapat lebih banyak ikatan
rangkap yang menyebabkan senyawa itu menyerap cahaya tampak dan
membuatnya menjadi berwarna (Salisbury and Ros, 1995). Flavonoid
terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Flavonoid berupa senyawa
fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amonia,
sehingga mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan. Flavonoid
mengandung

sistem

aromatik

yang

terkonjugasi

dan

karena

itu

menunjukkan pita serapan pada daerah spektrum UV dan spektrum tampak


(Harbone, 1987).

7. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)


Pada pemisahan zat secara cepat dapat digunakan kromatografi
lapis tipis, menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan
serba rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap

23

sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan didasarkan pada


penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat
penyerap dan cara pemberian lapisan zat penyerap dan jenis pelarut,
kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan
untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada
kromatografi lapis tipis, tidak tetap jika dibandingkan dengan yang
diperoleh pada kromatografi kertas. Karena itu pada lempeng yang sama
disamping

kromatogram dari zat pembanding kimia lebih baik dengan

kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan


pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran yang kurang lebih sama.
Ukuran dan intensitas bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar.
Penetapan kadar yang lebih teliti dapat dilakukan dengan cara densitometri
atau dengan mengambil bercak dengan hati-hati dari lempeng, kemudian
disari

dengan

pelarut

yang

cocok

dan

ditetapkan

dengan

cara

spektrofotometri. Pada kromatografi lapis tipis dua dimensi, lempeng yang


telah dielusi diputar 90 dan dielusi lagi, umumnya menggunakan bejana
yang berisi pelarut lain (Depkes RI, 1995).

8. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrum UV-Vis merupakan hasil interaksi antara radiasi
elektromagnetik (REM) dengan molekul. REM merupakan bentuk energi
radiasi yang mempunyai aksi gelombang dan partikel (foton), karena
bersifat sebagai gelombang maka beberapa parameter perlu diketahui seperti

24

panjang gelombang, frekuensi, bilangan gelombang dan serapan (Harmita,


2006).
Spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur besarnya
energi yang diabsorpsi atau diteruskan. Salah satu syarat agar suatu zat atau
senyawa dapat dianalisa secara spektrofotometri adalah senyawa tersebut
memiliki gugus kromofor, yaitu gugus fungsional yang mengabsorpsi
radiasi ultraviolet dan tampak, jika mereka diikat oleh senyawa-senyawa
bukan pengabsorpsi (auksokrom). Yang menentukan suatu kromofor dapat
memberikan serapan pada spektrum serapan yang dibuat adalah senyawa
tersebut memiliki panjang gelombang lebih besar dari 190 nm dan daya
serap molar (maks) lebih besar dari 1000 agar konsentrasi yang digunakan
tidak terlalu besar (Harmita, 2006).
Penggunaan spektrofotometer UV-Vis dapat digunakan untuk
analisa kualitatif maupun kuantitatif. Untuk analisa kualitatif, yang perlu
diperhatikan adalah membandingkan maksimum, serapan, daya serap dan
spektrum serapannya. Pengukuran serapan dapat dilakukan pada panjang
gelombang daerah ultraviolet (panjang gelombang 190-380 nm) atau pada
daerah cahaya tampak (panjang gelombang 380-780 nm) (Harmita, 2006).
Terdapat

beberapa

faktor

yang

mempengaruhi

munculnya

spektrum serapan pada analisa secara spektrofotometri, diantaranya adalah


jenis pelarut yang digunakan, pH larutan, kadar larutan (jika konsentr
Pemilihan pelarut yang digunakan dalam spektrofotom asi tinggi
akan terjadi polimerisasi yang menyebabkan panjang gelombang maksimum
berubah sama sekali), tebal larutan atau tebal kuvet yang digunakan dan

25

lebar celah (Harmita, 2006). etri UV sangat penting, dimana pelarut tidak
boleh mengabsorpsi cahaya pada daerah panjang gelombang dimana
dilakukan pengukuran sampel. Umumnya pelarut yang tidak mengandung
sistem terkonjugasi sesuai untuk digunakan dalam spektrofotometri UV-Vis.
Pelarut yang umum digunakan adalah air, etanol, metanol dan n-heksan,
karena pelarut ini transparan pada daerah UV (Harmita, 2006).

9. Uji Penghambatan Aktivitas Enzim Xantin Oksidase


Uji penghambatan aktivitas enzim xantin oksidase dilakukan
dengan metode

Continous

Spectrophotometric Rate Determination,

menggunakan reagen larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5, larutan substrat


xantin 0,15 M dan larutan enzim xantin oksidase. Reaksi enzimatik
diinkubasikan selama 30 menit dibawah kondisi aerob dengan suhu
optimum. Kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan larutan HCl 1
N. Pengujian dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 290 nm sebanyak 3 kali (Umamaheswari et al., 2009).

B. Kerangka Teori
Makanan tinggi purin

Katabolisme purin meningkat

Produksi asam urat meningkat

yang diteliti
mengakibatkan /
mempengaruhi

Adenosin

Guanosin

26

Inosin

Guanin

Hipoxantin

Alloxantin

Alopurinol

Flavonoid

Ekstrak etanol
daun srikaya

Xantin oksidase

Xantin

Xantin oksidase

Asam urat meningkat


Hiperurisemia
Alantoin
Gambar 2.5 Kerangka Teori Penelitian

C. Kerangka Konsep
Variabel Terkendali
a. Pemilihan sampel

b. Metode ekstraksi
c. pH, suhu dan konsentrasi substrat.

Variabel Tergantung

Variabel Bebas

Inhibisi xantin oxidase /


pembentukan asam urat

Ekstrak etanol daun srikaya


dengan bebagai

Gambar 2.6 Kerangka konsep penelitian

D. Hipotesis

27

Ekstrak etanol daun srikaya (Annona squamosa L.) mengandung flavonoid


dan memiliki daya inhibisi terhadap aktivitas enzim xantin oksidase dalam
penghambatan pembentukan asam urat.
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Desain Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental (true experimental
designs) dengan rancangan post test group design.

B. Lokasi dan Waktu Penelitian


Penelitian ini akan dilakukan selama 6 bulan di Laboraturium
Taksonomi dan Tumbuhan Jurusan Biologi, Laboratorium Kimia Farmasi dan
Laboratorium Biologi Farmasi Jurusan Farmasi Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan
Universitas Jenderal Soedirman.

C. Populasi dan Sampel


Sampel adalah sebagian dari jumlah dan karakteristik yang dimiliki
suatu populasi yang akan diteliti (Notoatmodjo, 2005). Populasi dalam
penelitian yang akan dilakukan adalah daun srikaya (Annona squamosa L.).
Sampel dalam penelitian adalah daun srikaya yang dibuat ekstrak etanolik.

D. Variabel Penelitian
Variabel bebas

Ekstrak etanol daun srikaya dengan bebagai

konsentrasi.
Variabel tergantung

: Inhibisi xantin oxidase / pembentukan asam urat (IC50).

28

Variabel terkendali

: Pemilihan sampel, metode ekstraksi, pH, suhu dan


konsentrasi substrat.

E. Definisi Operasional
No
1

Variabel
Konsentrasi

Definisi
Konsentrasi

Cara Ukur
V1M1=V2M2

Alat ukur
-

Skala ukur
Numerik

ekstrak daun

larutan

srikaya

dalam

Absorbansi

(g/mL)
Nilai absorbansi

Diukur

spektrofotom

Numerik

sampel

sampel

panjang

IC50

uji
ppm

pada

pada

masing-masing

gelombang

konsentrasi
Nilai
yang

maksimum
Persamaan

menunjukkan

regresi

eter

Kategorik

konsentrasi
ekstrak
yang

(ppm)
mampu

menghambat
xantin oksidase
sebesar 50 %

F. Alat dan Bahan


Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah spektrofotometer
UV-Vis, fase diam GF254, chamber, lampu UV 366 nm, blender, timbangan
digital, vortex mixer, pipet mikro, pipet ukur, pipet volume, tabung reaksi,
cawan petri, waterbath , ayakan dan alat-alat gelas.

29

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun srikaya


(Annona squamosa L.), air suling demineralisata, alopurinol, xantin, xantin
oksidase, kalium difidrogen ortofosfat, dimetil sulfoksida, HCl, etanol 96 %,
NaOH, dapar fosfat, n-butanol-asam asetat-air, aseton, asam oksalat, asam
borat, aluminium klorida dan dietil eter.

G. Alur Penelitian
Daun srikaya

Determinasi

Simplisia daun srikaya

Ekstrak etanol daun srikaya

Identifikasi flavonoid

Penentuan suhu
optimum

Penentuan
panjang
gelombang

Penentuan pH
optimum

Penentuan
operating
time

Uji inhibisi xantin


oksidase

Uji pendahuluan

Penentuan konsentrasi
substrat optimum

Pengujian
blanko dan
kontrol
blanko

Pengujian
standar dan
kontrol standar

Pengujian
sampel
(ekstrak etanol
daun srikaya)
dan kontrol
sampel

IC 50
Gambar 3.1 Skema penelitian

30

1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui kebenaran dari
tanaman yang akan digunakan sebagai bahan uji. Determinasi dilakukan di
Laboratorium Taksonomi dan Tumbuhan Jurusan Biologi Universitas
Jenderal Soedirman
2. Pembuatan simplisia
Daun srikaya yang digunakan tidak terserang hama, penyakit dan
terbebas pengganggu dan pencemar lainnya, kemudian dibersihkan di
bawah air mengalir sebanyak 2 kali, ditiriskan, dikeringkan dibawah sinar
matahari langsung. Bahan

yang sudah kering

diserbuk dengan

menggunakan blender kemudian serbuk diayak.


3. Pembuatan ekstrak etanol daun srikaya
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 200 g, kemudian ditambah
dengan larutan penyari yaitu etanol 96 % sebanyak 1500 ml, ditutup dan
dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil diaduk, kemudian
disaring. Setelah itu ampasnya diremaserasi, disaring sampai mendapatkan
100 bagian (2000 ml) dan dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan
ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari dimaksudkan untuk
mengendapkan, disaring. Maserat diuapkan diatas penangas air pada suhu
600C.
4. Identifikasi Flavonoid
a. Identifikasi flavonoid dengan teknik kromatografi lapis tipis (KLT)
menggunakan fase diam GF254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan

31

fase gerak campuran dari n-butanol-asam asetat-air (BAA) (4:1:5),


kemudian plat disemprot dengan AlCl3 10 % dan diamati
menggunakan sinar UV 366 nm akan berfluoresensi kuning (Depkes
RI, 1995).
b. Ekstrak dilarutkan dalam aseton, ditambahkan 50 mg asam oksalat
dan 50 mg asam borat, diaduk kemudian didiamkan hingga
mengering. Lalu ditambahkan dietil eter, diaduk kemudian diamkan
hingga mengering lalu dilihat dibawah sinar UV 366 nm akan
berfluoresensi kuning kehijauan (Depkes RI, 1995).
5. Pembuatan Larutan Uji dan Larutan Pereaksi
a. Pembuatan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5
Dibuat dengan mencampur 6,805 gram kalium dihidrogen
ortofosfat ke dalam 600 mL air bebas CO2, lalu ditambahkan 18 mL
larutan natrium hidroksida 2 N dan dicukupkan volumenya hingga 1000
mL, sesuaikan pH larutan menjadi 7,5 dengan natrium hidroksida 0,2 N
atau asam klorida 0,2 N.
b. Pembuatan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,8
Ditimbang kalium dihidrogen ortofosfat sebanyak 1,3609 gram
dan dilarutkan ke dalam 200 mL air bebas CO 2. Dapar dibuat dengan
mencampur 50 mL kalium dihidrogen fosfat 0,05 M dengan 44,5 mL
natrium hidroksida 0,2 N dan diencerkan dengan air bebas CO 2 hingga
200 mL. Sesuaikan pH larutan menjadi 7,8 dengan natrium hidroksida
0,2 N atau asam klorida 0,2 N.
c. Pembuatan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 8
Dibuat dengan mencampur 25 mL kalium dihidrogen fosfat 0,05
M dengan 23,05 mL natrium hidroksida 0,2 N dan diencerkan dengan
air bebas CO2 hingga 100 mL. Sesuaikan pH larutan menjadi 8 dengan
natrium hidroksida 0,2 N atau asam klorida 0,2 N.

32

d. Pembuatan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 8,3


Dibuat dengan mencampur 25 mL kalium dihidrogrn fosfat 0,05 M
dengan 25 mL natrium hidroksida 0,2 N dan diencerkan dengan air
bebas CO2 hingga 100 mL. Sesuaikan pH larutan menjadi 8,3 dengan
natrium hidroksida 0,2 N atau asam klorida 0,2 N.
e. Pembuatan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 8,5
Dibuat dengan mencampur 25 mL kalium dihidrogrn fosfat 0,05 M
dengan 26,5 mL natrium hidroksida 0,2 N dan diencerkan dengan air
bebas CO2 hingga 100 mL. Sesuaikan pH larutan menjadi 8,5 dengan
natrium hidroksida 0,2 N atau asam klorida 0,2 N.
f. Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Daun Srikaya
Ekstrak kental sebanyak 10 mg ditambahkan 4 tetes DMSO hingga
larut kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Setelah itu
diencerkan dengan air suling demineralisata bebas CO2 sampai batas
dan diperoleh larutan induk dengan dengan konsentrasi 1000 g/mL,
selanjutnya dilakukan pengenceran hingga diperoleh konsentrasi 1
g/mL, 5 g/mL, 10 g/mL, 20 g/mL dan 100 g/mL.
g. Pembuatan Larutan Substrat Xantin
Xantin, BM = 152,1
Substrat xantin yang ditimbang = 15,21 mg
15,21 mg
=0,1 mmol
mmol xantin =
152,1
Dilarutkan dengan 5 tetes NaOH 1 M dan encerkan dengan aquadest
sampai dengan 100 ml (0,1 L)
mM larutan substrat xantin =

0,1mmol
=1 mM
0,1liter

Sebanyak 15,21 mg xantin ditimbang menggunakan botol timbang,


ditambahkan dengan lima tetes NaOH 1 M hingga larut, setelah itu
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL menggunakan pipet, kemudian
diencerkan dengan air suling demineralisata bebas CO 2 sampai dengan
100

mL

(konsentrasi

1mM).

Larutan

xantin

dibuat

dengan

33

mengencerkan larutan induk sampai diperoleh larutan xantin dengan


konsentrasi 0,05 mM; 0,1 mM; 0,15 mM, 0,2 mM dan 0,25 mM.
h. Pembuatan Larutan Standar Alopurinol
Standar alopurinol dibuat dengan konsentrasi 1000 ppm.
Ditimbang sebanyak 10 mg ditambahkan NaOH 1 N beberapa tetes
hingga larut lalu diencerkan dengan air suling demineral bebas CO 2
didalam labu ukur 10 ml kemudian dicukupkan volume nya hingga
tanda batas dan diperoleh larutan induk dengan konsentrasi 1000
g/mL. Larutan standar alopurinol dibuat dengan mengencerkan larutan
induk hingga diperoleh larutan standar alopurinol dengan konsentrasi 5;
10; 20; 50 dan 100 g/mL .
i. Pembuatan Larutan Xantin Oksidase
Satu kemasan enzim mengandung 45,45 mg solid :
a. 0,8 unit/mg protein
b. 0,11 unit/mg solid
Diperlukan 0,1 Unit/mL larutan xantin oksidase. Enzim
dilarutkan dalam 25 mL, maka diperlukan larutan xantin oksidase 2,5
Unit/mL.
a. Jumlah total mg protein dalam satu kemasan :
14,1 % x 45,45 mg solid = 6,408 mg potein
b. Jumlah total enzim dalam satu kemasan :
0,8 Unit/mg protein x 6,408 mg protein = 5,126 Unit
Maka dalam satu kemasan terdapat :
a. 5,126 Unit/6,408 mg protein

34

b. 6,408 mg protein/45,45 mg solid


c. 5,126 Unit/45,45 mg solid
Oleh karena itu, ditimbang enzim sebesar
2,5 unit
x 45,45 mg solid= 22,17 mg
5,126 unit
Cara pembuatan, ditimbang 22,17 mg xantin oksidase
menggunakan botol timbang, ditambahkan 10 tetes dapar fosfat hingga
larut yang dilakukan pada kotak es, kemudian dimasukkan kedalam labu
ukur 25 mL dan dilarutkan ke dalam dapar fosfat sampai dengan 25 mL.

6. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum


Pada penentuan panjang gelombang maksimum digunakan pH 7,5
dan suhu 25 C (Sigma Aldrich, 1994). Larutan dapar fosfat 0,05 M pH
7,5 sebanyak 3,9 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan
2 mL larutan substrat xantin dengan konsentrasi 0,15 mM kemudian
dilakukan prainkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit. Setelah
prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin oksidase ditambahkan ke dalam
tabung reaksi dan dihomogenkan selama 1 menit menggunakan vortex
mixer. Campuran diinkubasi pada suhu 25C selama 30 menit. Kemudian
segera tambahkan 1 mL HCl 1 N untuk menghentikan reaksi. Serapan
diukur menggunakan spektrofotometer untuk memperoleh panjang
gelombang maksimum pengukuran.
7. Penentuan Operating Time

35

Pada penentuan panjang gelombang maksimum digunakan pH 7,5


dan suhu 25 C (Sigma Aldrich, 1994). Larutan dapar fosfat 0,05 M pH
7,5 sebanyak 3,9 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan
2 mL larutan substrat xantin dengan konsentrasi 0,15 mM kemudian
dilakukan prainkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit. Setelah
prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin oksidase ditambahkan ke dalam
tabung reaksi dan dihomogenkan selama 1 menit menggunakan vortex
mixer. Campuran diinkubasi pada suhu 25C selama 30 menit. Kemudian
segera tambahkan 1 mL HCl 1 N untuk menghentikan reaksi. Serapan
diukur menggunakan spektrofotometer pada menit ke- 0, 5, 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, dan 60 pada panjang gelombang maksimum.

8. Uji Pendahuluan
a. Penentuan Suhu Optimum
Larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5 sebanyak 2,9 mL
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 2 mL larutan
substrat xantin dengan konsentrasi 0,15 mM kemudian dilakukan
prainkubasi masing-masing pada suhu 20, 25, 30, 35 dan 40 C selama
10 menit. Setelah prainkubasi selesai, 0,1 mL larutan xantin oksidase
ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan dihomogenkan menggunakan
vortex mixer. Campuran diinkubasi pada suhu 20, 25, 30, 35 dan 40 C
selama 30 menit, kemudian segera tambahkan 1 mL HCl 1 N untuk
menghentikan reaksi. Serapan diukur menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang maksimum.
b. Penentuan pH optimum

36

Larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5; 7,8, 8, 8,3 dan 8,5


sebanyak 2,9 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan
2 mL larutan substrat xantin dengan konsentrasi 0,15 mM kemudian
dilakukan prainkubasi masing-masing pada suhu optimum selama 10
menit. Setelah prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin oksidase
ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan dihomogenkan menggunakan
vortex mixer. Campuran diinkubasi pada suhu optimum selama 30
menit, kemudian segera tambahkan 1 mL HCl 1 N untuk menghentikan
reaksi. Serapan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang maksimum.
c. Penentuan Konsentrasi Substrat Xantin Optimum
Larutan dapar fosfat 0,05 M pH optimum sebanyak 2,9 mL
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 2 mL larutan
substrat xantin dengan konsentrasi 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 dan 0,25 mM
kemudian dilakukan prainkubasi masing-masing pada suhu optimum
selama 10 menit. Setelah prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin
oksidase ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan dihomogenkan
menggunakan vortex mixer. Campuran diinkubasi pada suhu optimum
selama 30 menit, kemudian segera tambahkan 1 mL HCl 1 N untuk
menghentikan reaksi. Serapan diukur menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang maksimum.
d. Perhitungan Aktivitas enzim
Kondisi optimum dapat ditentukan dengan menentukan aktivitas
enzim yang dihitung dengan menggunakan :

37

Aktivitas =

( serapan blankoserapan kontrol ) x vol x df


12,2 x 0,1

(3.1)
Keterangan :
Vol : Total volume saat pengujian
df

: faktor pengenceran

12,2 : koefisien ekstrinsik asam urat pada 290 nm (mM)


0,1 : Volume xantin oksidase yang digunakan unit/ml enzim
Satu unit xantin oksidase akan mengkonversi 1 mol xantin
menjadi asam urat per menit pada suhu 25 C dan pH 7,5 (Sigma
Aldrich, 1994).

9. Uji Penghambatan Aktivitas Xantin Oksidase


a. Pengujian Standar
Larutan standar alopurinol sebanyak 1 mL (konsentrasi 5, 10, 20,
50 dan 100 g/ml) ditambahkan 2,9 mL dapar fosfat 0,05 M pH
optimum dan 2 mL larutan substrat xantin konsentrasi optimum,
kemudian dilakukan prainkubasi masing-masing pada suhu optimum
selama 10 menit. Setelah prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin
oksidase ditambahkan kedalam tabung reaksi dan dihomogenkan
menggunakan vortex mixer selama 20 detik. Larutan campuran
kemudian diinkubasikan pada suhu optimum selama 30 menit. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 1 mL HCl 1 N, kemudian diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum menggunakan
spektrofotometer.
b. Pengujian Kontrol Standar

38

Larutan standar alopurinol sebanyak 1 mL dengan konsentrasi 5,


10, 20, 50 dan 100 g/ml ditambahkan 3 mL dapar fosfat 0,05 M pH
optimum dan 2 mL larutan substrat xantin konsentrasi optimum
kemudian dilakukan prainkubasi selama 10 menit pada suhu optimum,
kemudian ditambahkan larutan HCl 1 N, kemudian diinkubasikan pada
suhu optimum selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, larutan diukur
serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
maksimum.
c. Pengujian Sampel
Larutan uji sebanyak 1 mL ditambahkan 2,9 mL dapar fosfat 0,05
M pH optimum dan 2 mL larutan substrat xantin konsentrasi optimum,
kemudian dilakukan prainkubasi masing-masing pada suhu optimum
selama 10 menit. Setelah prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin
oksidase ditambahkan kedalam tabung reaksi dan dihomogenkan
menggunakan vortex mixer selama 20 detik. Larutan campuran
kemudian diinkubasikan pada suhu optimum selama 30 menit. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 1 mL HCl 1 N, kemudian diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum menggunakan
spektrofotometer.
d. Pengujian Kontrol Sampel
Larutan uji sebanyak 1 mL ditambahkan 3 mL dapar fosfat 0,05
M pH optimum dan 2 mL larutan substrat xantin konsentrasi optimum.
Larutan dilakukan prainkubasi selama 10 menit pada suhu optimum,
kemudian ditambahkan larutan HCl 1 N, kemudian diinkubasikan pada
suhu optimum selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, larutan diukur

39

serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang


maksimum.
e. Pengujian Blanko
Dapar fosfat 0,05 M pH optimum sebanyak 3,9 mL dan 2 mL
larutan substrat xantin konsentrasi optimum, kemudian dilakukan
prainkubasi masing-masing pada suhu optimum selama 10 menit.
Setelah prainkubasi selesai 0,1 mL larutan xantin oksidase ditambahkan
kedalam tabung reaksi dan dihomogenkan menggunakan vortex mixer
selama 20 detik. Larutan campuran kemudian diinkubasikan pada suhu
optimum selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1 mL
HCl 1 N, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang
maksimum menggunakan spektrofotometer.
f. Pengujian Kontrol Blanko
Dapar fosfat 0,05 M mL pH optimum sebanyak 4 mL dan 2 mL
larutan substrat xantin konsentrasi optimum. Larutan dilakukan
prainkubasi selama 10 menit pada suhu optimum, kemudian
ditambahkan 1 mL larutan HCl 1 N, kemudian diinkubasikan pada suhu
optimum selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, larutan diukur
serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
maksimum.
Volume
Reagen

Kontrol
Blanko

Kontrol
Sampel

Blanko

Kontrol
Standar

Sampel

standar

Sampel
-

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

(inhibitor)
Standar
(alopurinol)

40

Dapar

3,9 mL

4 mL

2,9 mL

3 mL

2,9 mL

3 mL

2 mL

2 mL

2 mL

2 mL

2 mL

2 mL

10 menit

10 menit

10 menit

10 menit

10 menit

10 menit

0,1 mL

0,1 mL

0,1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

30 menit

30 menit

30 menit

30 menit

30 menit

30 menit

1 mL

1 mL

1 mL

Substrat
xantin
Inkubasi
(suhu

optimum)
Enzim
HCl 1 N
Inkubasi
(suhu

optimum)
HCl 1 N

Serapan diukur menggunakan panjang gelombang maksimum


Tabel 3.1 Reagen dan volume yang dibutuhkan pada uji penghambatan aktivitas
xantin oksidase (Dewi, 2012).

g. Perhitungan Penghambatan Aktivitas Xantin Oksidase


% inhibisi = (1

B
x 100 %
A

Keterangan :
A

: Perubahan absorbansi larutan uji tanpa ekstrak, blanko


(dengan enzim) kontrol blanko (tanpa enzim)

: Perubahan absorbansi larutan uji dengan ekstrak, sampel


(dengan enzim) kontrol sampel (tanpa enzim)

H. Sumber Data
Sumber data dalam penelitian yang dilakukan diperoleh dari data
primer dan sekunder. Data primer merupakan data yang diperoleh secara

41

langsung oleh peneliti dari pengukuran langsung kepada objek penelitian. Data
sekunder merupakan data yang diperoleh penyusun dari literatur dan
kepustakaan terkait.

I. Analisis Data
Nilai IC50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi y = a +
bx, pada beberapa konsentrasi larutan sampel. Sebagai variabel x adalah
konsentrasi sampel dan sebagai variabel y adalah % inhibisi. Setelah diketahui
rumus persamaan regresi , nilai IC50 dicari dengan cara mensubtitusi nilai y
dengan 50 kemudian dicari nilai x (g/mL).

J. Etika Penelitian

K. Jadwal Penelitian
No
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bulan

Jenis Kegiatan

Pengadaan alat dan bahan


Pembuatan Ekstrak
Identifikasi flavonoid
Uji Pendahuluan
Uji inhibisi xantin oksidase
Penyusunan laporan hasil
DAFTAR PUSTAKA

Ahmad S. A., 2007, Ilmu Kimia dan Kegunaan Tumbuh-tumbuhan Obat


Indonesia, ITB Press, Bandung.
Ansel, H.C., 1989, Pengatar Bentuk sediaan Farmasi Edisi 4, UI Press, Jakarta.
Berg J.M., Tymoczko J.L. and Stryer L, 2002, Biochemistry 5th Edition, WH
Freeman p, 108-109.

42

Collin D.J., Culvenor C.C.J., Lamberton J.A., Loder J.N.and Price J.R., 2006,
Plants for Medicine: A Chemical and Pharmacological Survey of Plants in
the Australian Region, Melbourne, Australia.
Dalimartha S., 2001, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 2, Trubus Agriwidya,
Jakarta.
Dalimartha Setiawan., 2008, Care Your Self Hipertensi, Penebar Plus, Jakarta.
Darwis D., 2000, Teknik Dasar Laboratorium dalam Penelitian Senyawa Bahan
Alam Hayati, Workshop Pengembangan Sumberdaya Manusia di dalam
Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati, FMIPA Universitas Andalas,
Padang.
Depkes RI, 2002, Pedoman Pelaksanaan Uji Klinik Obat Tradisional,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Depkes RI, 1995, Farmakope Indonesia edisi IV, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta.
Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia edisi III, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta.
Dewani and Sitanggang, 2006, 33 Ramuan Penakluk Asam Urat, AgroMedia,
Jakarta.
Dewi Trias K., 2012, Isolasi, Uji Penghambatan Aktivitas Xantin Oksidase dan
Identifikasi Senyawa Aktif dari Fraksi n-Butanol pada Ekstrak Akar
Tanaman Acalypha indica Linn, Skripsi, Universitas Indonesia, Jakarta.
Dirjen POM, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat cetakan
pertama, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Endah F., 2016, Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Srikaya (Annona
squamosa Linn.) terhadap Kadar Kolesterol LDL pada Tikus
Hiperlipidemia, Tesis, Universitas Muhammadiyah, Malang.
Endrawati S. and Wiyana A. Saputri, 2015, Uji Daya Antelmintik Ekstrak
Perasan dan Infusa Daun Srikaya (Annona squamosa L.) Terhadap Cacing
Gelang Ayam (Ascaridia galli) Secara In Vitro, Jurnal Biologi Papua, Vol.
7 No.2.
Harbone J. B., 1987, Metode Fitokimia; Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, diterjemahkan oleh Padmawinata K., ITB, Bandung.
Harmita, 2006, Buku Ajar Analisis Fitokimia, Departemen Farmasi, Universitas
Indonesia.
Hegnauer R., 1986, Chemotaxonomie der Pflanzen, Bhrkhauser Verlag, Sturttgart.

43

Irawati, 2001, Tumbuhan langka Indonesia, Pusat Penelitian dan Pengembangan


Biologi, LIPI. Balai Penelitian Botani, Herbarium Bogoriense, Bogor.
Katrin B, Elya, Juheini A. and Iqbal Julian M., 2011, Activity of Ethanolic Extract
from Justicia gandarusa Burm Leaves on Decreasing The Uric Acid
Plasma, 15,67-70.
Katzung B. G., 1995, Farmakologi Dasar dan Klinik edisi II, Salemba Medika
Jakarta.
Kramer and Curhan, 2002, The Association etween Gout and Nephrolithiasis: The
National Health and Nutrition Examination Survey III, Am J Kidney Dis.,
40(1):37-42.
Misnadiarly, 2008, Mengenal Penyakit Arthritis, Mediakom, Baylor College of
Medicine, Houston Texas 77030.
Muflihat A.D., 2008, Inhibisi Ekstrak Herba Kumis Kucing dan Daun Salam
terhadap Aktivitas Xantin Oksidase, Skripsi, Institut Pertanian Bogor,
Bogor.
Murray R.K., Granner D.K., Rodwell V.W., 2006, Biokimia Harper, Penerbit
Buku EGC, Jakarta.
Nurilahi R., 2015, Uji Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak Etanol Daun Srikaya
(Annona squamosa L.) terhadap Tikus Putih Jantan Galur Sprague Dawley
yang Diinduksi Potassium Oxonate, Skripsi, STIKES BTH, Tasikmalaya.
Owen L., Patrick and Johns, Timothy, 1998, Xantin Oxidase Inhibitory Activity of
Northeastern North American Plant Remedies Used for Gout, Journal of
Ethnophamacology, 65;149-180.
Purwaningsih Nur V., 2015, Daya Bunuh Ekstrak Daun Srikaya (Annona
Squamosa L.) terhadap Telur dan Larva Aedes Aegypti, Tesis, Universitas
Udayana, Denpasar.
Purwita A.A, Novita Kartika Indah, Guntur Trimulyono, 2013, Penggunaan
Ekstrak Daun Srikaya (Annona squamosa) sebagai Pengendali Jamur
Fusarium oxysporum secara In Vitro, LenteraBio, Vol 2 No. 2.
Putra A.,2014, Uji antiradikal bebas ekstrak daun srikaya (Annona squamosa L)
dengan metode ekstraksi bertingkat menggunakan DPPH, Skripsi, UMI,
Makassar.
Rodwell, V.W., 2003, Metabolisme Nukleotida Purin dan Pirimidin. Dalam:
Murray, R.K., D.K.Graner, P.A.Mayes, and V.W.Rodwell, Biokimia
Harper (diterjemahkan oleh Andry Hartono), Penerbit Buku Kedokteran
EGC, Jakarta.
Salisbury, F.B., and C.W. Ross, 1995, Fisiologi tumbuhan Jilid 1, Terjemahan
Diah R. Lukman dan Sumaryo, ITB, Bandung.

44

Sarawek S., Derendorf H. and Butterweck V., 2007, Xanthine Oxidase Inhibitory
Activity of Various Flavonoids in vitro and on Plasma Uric Acid Levels in
Oxonate-Induced Rats, http://www.scipub.org.
Steenis V., 2005, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT Pradya Paramita, Jakarta.
Susanti A., 2011, Pengaruh Ekstrak Tempuyung (Sonchus arvensis) terhadap
Aktivitas Xantin Oksidase Secara In Vitro sebagai Dasar Uji Kinetika,
Tesis, IPB, Bogor.
Sustrani and Lany, 2005, Asam Urat, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Umamaheswari M., Asokkumar K., Subhadradevi V., Sivashanmugam A.T., 2009,
In Vitro Xantine Oxidase Inhibitory Activity of the Fractions of Erythrina
stricia Roxb, Departemen Farmakologi Institut Ilmu Pramedikal Sri
Ramakhrisna, India
Voight R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan Noerono S.,
edisi V, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Vongsak B., Sithisarn P., Mangmool S., Thongpraditchote S., Wongkrajang Y.,
GritsanapanW., 2012, Maximizing total phenolics, total flavonoids
contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the
appropriate extraction method. Journal of Crops and Products.
Wilmana P.F., and Sulistia, G., 2007, Analgesik-Antipiretik, Analgesik
AntiInflamasi Nonsteroid dan Obat Gangguan Sendi Lainnya, Dalam:
Gan, S., Setiabudy, R., dan Elysabeth, eds. Farmakologi dan Terapi. Edisi
5, Departemen Farmakologi dan Terapeutik FK UI, Jakarta.
Yulianto, Dede. 2009. Inhibisi Xantin Oksidase Secara In Vitro oleh Ekstrak
Rosela (Hibiscus sabdariffa) dan ciplukan (Physalis angulata), Skripsi,
Institut Pertanian Bogor, Bogor.