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MANU A L DE
PROCEDIMIENTOS DE
ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Lima - 2003
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD
Subcomit Editor
Ministro
Dr. lvaro Vidal Rivadeneyra
Presidente
Dra. Ada Palacios Ramrez
Viceministro
Econ. Carlos Rodrguez Cervantes
Secretario tcnico
Dr. Csar Cabezas Snchez
Miembros
Q.F. Zulema Arvalo Chong
Dr. Jorge Barnaby Rodrguez
Dr. Zuo Burstein Alva
Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto
Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr.
Csar Nquira Velarde
Q.F Rosa Mendoza Yanavilca
Dra. Frine Samalvides Cuba
Dr. Vctor Surez Moreno
Subjefe
Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez
Centro Nacional de Salud Pblica
Dra. Susana Zurita Macalup
Directora General
Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin
Dr. Napolen Chvez Villanueva
Director General
Centro Nacional de Control de Calidad
Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora
General
Editor
Dr. Leonid Lecca Garca
Asistente Editorial
Lic. Daniel Crdenas Rojas
Secretaria
Srta. Roco Sols Agurto
MPR-CNSP-016
la
de
la
la
Direccin:
,
Instituto Nacional de Salud
Cpac Yupanqui 1400. Lima 11 Per.
Telf.: (051-1)471-9920 Anexo 162
E-mail: revmedex@ins.gob.pe
Pgina web:
. www.ins.gob.pe
Editor: Dr Leonid Lecca Garca
ELABORACIN:
Blgo. Carlos Augusto Ybar
Varas Divisin de Biologa
Molecular
Centro Nacional de Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
Lima-Per
MPR-CNSP-016
II
II nstituto Nacional de
Salud
AGRADECIMIENTO:
Blgo. Roger Caldern Espinoza
Blgo. Carlos Padilla Rojas
Blgo. Christian Baldeviano Vidaln
Blgo. Omar Cceres Rey
Blga. Gisely Hijar Guerra
Blga. Elizabeth Snchez Roman
Divisin de Biologa Molecular
Centro Nacional de Salud Pblica
Instituto Nacional de Salud
MPR-CNSP-016
III
CONTENIDO
INTRODUCCIN
SECCIN 1:
1.1
1.2
1.3
1
1
1
1
GENERALIDADES
Objetivo
Campo de aplicacin
Abreviaturas y definiciones
SECCIN 4:
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
7
7
7
7
8
11
12
12
13
16
17
19
SECCIN 5:
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
21
21
21
22
25
27
5.7
5.8
SECCIN 6:
6.1
6.2
6.3
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Electroforesis bidimensional
Electroforesis de capilaridad
Electroforesis en campo pulsado (PFEG)
35
35
35
36
III
28
30
32
37
37
37
37
Instituto Nacional de Salud
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
Bromuro de etidio
Agarosa
Poliacrilamida al 30%
Agua destilada
Equipos de laboratorio
37
38
38
38
38
39
BIBLIOGRAFA
41
ANEXOS
43
ANEXO A:
43
ANEXO B:
UNIDADES Y FRMULAS
49
ANEXO C:
51
53
ANEXO E:
55
ANEXO F:
59
ANEXO D:
MPR-CNSP-016
IV
INTRODUCCIN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y
protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis
nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su
tamao o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un
patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la
visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e
interpretadas.
En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la
electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la
electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos
electroforticos que presentan ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado,
mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis
bidimensional para un anlisis ms sofisticado de las protenas etc.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin,
brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o
ADN de patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros.
El presente manual de procedimientos es la recopilacin de protocolos actualizados por los investigadores de la
Divisin de Biologa Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, adems de los
procedimientos tcnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparacin de soluciones de
electroforesis, unidades y frmulas bsicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que
deben considerarse durante la manipulacin de los reactivos.
MPR-CNSP-016
SECCIN 1
GENERALIDADES
1.1
OBJETIVO
Establecer los procedimientos de la tcnica de electroforesis de ADN y protenas para ser
difundidas en la red de laboratorios.
1.2
CAMPO DE APLICACIN
Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen anlisis y determinacin de ADN y protenas
en general.
1.3
ABREVIATURAS Y DEFINICIONES
1.3.1
1.3.2
1.3.3
kDa: kilodaltons.
1.3.4
nM: nanomolar.
1.3.5
1.3.6
1.3.7
1.3.8
pg: picogramo.
1.3.9
1.3.10
L: microlitro.
1.3.11
M: micromolar.
1.3.12
1.3.13
cido ribonucleico: molcula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo
fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimtico a nivel de ADN y durante la sntesis
de protenas.
1.3.14
aminocido: pequeas molculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su
conjunto forman la estructura de las protenas.
1.3.15
anfoterismo: propiedad de las protenas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,
dependiendo del pH y su punto isolctrico (pI).
MPR-CNSP-016
1.3.16
1.3.17
1.3.18
electroforesis: tcnica utilizada para separar partculas coloidales tales como protenas o cidos
nuclicos a travs una matriz slida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamao y
carga elctrica mediante la aplicacin de un campo elctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
1.3.19
1.3.20
1.3.21
estructura primaria de protenas: se refiere a la estructura lineal formada por la unin secuencial
de aminocidos.
1.3.22
1.3.23
1.3.24
grado biologa molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como
nucleasas, proteasas o pirgenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas
moleculares.
1.3.25
1.3.26
1.3.27
pares de bases: cada par de nucletidos complementarios que en conjunto forman una doble
hebra de ADN.
1.3.28
PCR: polimerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa; reaccin enzimtica in vitro
por el cual mediante mltiples ciclos de denaturacin, alineamiento y extensin se sintetizan
grandes cantidades de una regin gentica especfica.
1.3.29
1.3.30
polimerizacin: accin qumica por el cual las molculas de acrilamida y bisacrilamida forman un
entramado a manera de malla por la accin de catalizadores (TEMED y APS) generando una
sustancia gelatinosa.
1.3.31
MPR-CNSP-016
SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1
Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la caracterstica
de ser txicos, irritantes, corrosivos, cancergenos, mutagnicos y neurotxicos, por lo tanto el
investigador siempre deber usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos (Ver ms adelante lista de estos reactivos).
2.2
La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualizacin de ADN a 385 nm de longitud de onda con
8W de potencia ocasiona graves daos oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deber
contar con una lmina de policarbonato transparente ubicada entre la lmpara y el punto de
observacin. Adems, deber usar lentes de proteccin contra rayos UV del mismo material.
2.3
El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga elctrica.
Aunque la mayora de cmaras de electroforesis han sido diseadas para evitar el contacto directo
con la electricidad, el operador deber asegurarse de mantener la fuente poder apogada o
desconectada al momento de manipular el equipo.
2.4
El proceso de ebullicin de las protenas en bao mara a 100C deber realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio
resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para
colocar los viales.
MPR-CNSP-016
MPR-CNSP-016
SECCIN 3
MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR
3.1
El investigador deber usar guantes de ltex mientras se encuentre trabajando con ADN y
protenas.
Este paso ayudar a evitar la degradacin de las biomolculas por accin de las nucleasas o
proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitar que el
laboratorista se exponga ante algn posible riesgo de intoxicacin por material infeccioso.
3.2
El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genmico y los productos
de amplificacin pueden ser almacenados a 4C, mientras que el ADN plasmdico a - 20C. Las
protenas deben ser conservadas a -80C o en su defecto a -20C. Todas las muestras biolgicas
deben ser repartidas en alcuotas y en volmenes pequeos para evitar etapas de
descongelamiento o congelamiento drsticos que ocasionaran un eventual deterioro de las
molculas.
3.3
3.4
Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo
con las molculas de ADN sean nuevas y estriles, a fin de evitar una posible contaminacin de la
muestra con nucleasas. Es importante sealar que es posible trabajar con puntas previamente
usadas, siempre y cuando estn libres de restos orgnicos y hayan sido previamente esterilizadas
en autoclave (121C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulacin de las protenas, no se exige el
uso de puntas nuevas pero s se recomienda esterilizarlas previamente.
3.5
Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual
cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisin y calibracin (Ejm. ISO9000, ISO
8655, DIN
12650).
3.6
Los reactivos a usarse durante los procesos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos y
protenas deben tener grado "biologa molecular" para asegurar el xito del procedimiento. El uso
combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.
MPR-CNSP-016
5
Instituto Nacional
de Salud
MPR-CNSP-016
SECCIN 4
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS
4.1
OBJETIVO
Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de protenas.
4.2
MATERIALES
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
Gradillas de plstico.
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
4.2.13
4.2.14
Agua bidestilada.
4.2.15
4.2.16
4.3
4.3.1
4.3.2
Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis parten del mismo principio tcnico,
hemos representado grficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje
de este equipo (Figuras N 1-4).
MPR-CNSP-016
4.3.3
En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
4.3.3.1
Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara.
4.3.3.2
Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material
flexible pero resistente (generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los espaciadores es
determinar el grosor del gel.
4.3.3.3
Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarn las muestras
4.3.3.4
Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los
espaciadores, a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema
4.3.3.5
4.3.3.6
Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las
necesidades del investigador.
Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya ensamblada deber estar ubicada sobre
una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se
vierte la solucin del gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la
generacin de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar la distorsin del perfil de las bandas
de las protenas al final de la electroforesis.
4.4
4.4.1
La electroforesis de protenas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo
denaturante.
Es discontinuo porque est conformado por dos geles de poliacrilamida de resolucin y
empacamiento que presentan diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se
encuentran unidos pero limitados por una fase de separacin visible al trasluz. Debido a que en
estado lquido ambos geles pueden mezclarse fcilmente, deben ser preparados por separado
esperando la total polimeracin del primero para continuar con la polimerizacin del otro. El gel de
empacamiento generalmente se localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos
donde se depositarn las muestras. El gel de resolucin por su parte forma el cuerpo del gel por
donde migrarn y se separarn las protenas.
MPR-CNSP-016
Ctodo
Vidrio grande
Anodo
Peine
Vidrio chico
Tanque de electroforesis
vertical
Espaciadores
Soporte
Fuente de Poder
Voltmetros
Ganchos o prensas
Reguladores de
voltaje
Base de jebe
Electrodos
Interruptor
Peine
Peine
Espaciadores
Vidrio
grande
1 - 5 cm
Vidrio chico
Figura N 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cmara de electroforesis vertical
MPR-CNSP-016
Peine
Ganchos o
prensas
Soporte
Presin
Base de jebe
Peine
3. Aadir butanol
Dejar gelificando
MPR-CNSP-016
10
nodo
Ctodo
Buffer de
electroforesis
Fuente de poder
Tanque de electroforesis
vertical
4.5
4.5.1
Fundamento terico
El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a
migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al
peso molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo.
4.5.2
Procedimiento
4.5.2.1
4.5.2.2
Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea horizontal en el
vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por
debajo de los dientes del peine (Figura N 2)
4.5.2.3
Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades,
mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
4.5.2.4
4.5.2.5
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno por
uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.
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11
4.5.2.6
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada.
Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 L) sobre la solucin de
poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin.
4.5.2.7
Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin
la solucin de poliacrilamida remanente.
4.5.2.8
Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces
con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y
butanol.
4.6
4.6.1
Fundamento terico
El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las
protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este
proceso permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis.
4.6.2
Procedimiento
4.6.2.1
4.6.2.2
4.6.2.3
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solucin.
4.6.2.4
Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya polimerizado.
Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos
de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4.6.2.5
4.6.2.6
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
4.7
4.7.1
Objetivo
Someter las muestras de protenas a procesos qumicos y fsicos que permitan su ptimo
fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.7.2
Materiales
4.7.2.1
MPR-CNSP-016
12
4.7.2.2
4.7.2.3
Guantes.
4.7.2.4
Cocinilla de asbesto.
4.7.2.5
4.7.2.6
4.7.2.7
4.7.2.8
4.7.3
4.7.4
Procedimiento
4.7.4.1
Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporcin 3:1
(tres partes de la muestra y una de buffer).
4.7.4.2
Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de parafina y someter la muestra a una
temperatura de 100 C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para
microtubos dentro de un recipiente o vaso de precipitacin con agua hirviendo.
4.7.4.3
4.7.4.4
Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitacin y centrifugarlos por diez
segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con
hielo hasta el proceso de electroforesis.
4.8
ELECTROFORESIS
4.8.1
Objetivo
Fraccionar las protenas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando
un campo elctrico.
4.8.2
Materiales
4.8.2.1
4.8.2.2
MPR-CNSP-016
13
4.8.2.3
Fuente de poder.
4.8.2.4
4.8.2.5
Guantes.
4.8.2.6
4.8.2.7
4.8.2.8
4.8.3
4.8.4
Procedimiento
4.8.4.1
Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradacin de las molculas
por la accin de las proteasas presentes en la mano.
4.8.4.2
4.8.4.3
4.8.4.4
Considerar el uso de un marcador estndar de protenas para la medicin del peso molecular de la
muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la protena, excepto
cuando se trate de un marcador previamente teido en que el que se obviar el uso del buffer de
la muestra.
4.8.4.5
Una vez finalizada la colocacin de las protenas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa
y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
4.8.4.6
4.8.4.7
Para el clculo del voltaje es importante conocer la distancia en centmetros del gel desde la parte
superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V)
permitir determinar el voltaje total. El voltaje ptimo depender de la naturaleza de la molcula de
ADN que se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
4.8.4.8
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14
4.8.4.9
Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una lnea azul por el
colorante del buffer) haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel.
4.8.4.10
Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.
4.8.4.11
Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separacin
de los vidrios que contienen el gel.
4.8.4.12
4.8.4.13
Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientacin para
ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
4.8.4.14
Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frgil
y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentracin. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de esptula para levantarlo por una de las puntas. Coger
el gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante
azul brillante de coomasie.
4.8.4.15
El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo
ser reciclado hasta cinco veces, despus de los cuales se deber preparar una nueva solucin
dado que puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
4.8.4.16
Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergentes
especiales que puedan ser fcilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada
y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37C.
CTODO
NODO
e-
e-
e-
e-
a
Buffer de
resolucin
c
b
Gel de
empacamiento
d
e
e-
e-
Gel de
resolucin
Buffer de
resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 5. Interior de una cmara de electroforesis vertical en operacin: a) Durante la colocacin de la muestra en el pocillo
del gel, b) Despus de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las protenas, c, d y e) las
protenas migran hacia el nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
(e-)= electrones
MPR-CNSP-016
15
4.9
4.9.1
Objetivo
Visualizar las protenas en el gel de poliacrilamida.
4.9.2
Materiales
4.9.2.1
4.9.2.2
4.9.2.3
4.9.2.4
4.9.2.5
4.9.2.6
4.9.2.7
Agua destilada.
4.9.2.8
Guantes.
4.9.3
4.9.4
Procedimiento
4.9.4.1
Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algn tipo de contacto con los
reactivos.
4.9.4.2
4.9.4.3
Evitar la coloracin del gel por ms de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido
fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretincin que impedira la visualizacin de
las protenas.
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16
4.9.4.4
4.9.4.5
Cubrir el gel teido con solucin de decoloracin rpida e incubar por 30 minutos. Eliminar la
solucin decolorante rpida y aadir un segundo volumen de la misma solucin hasta apreciar las
primeras bandas. Acto seguido, eliminar la solucin de decoloracin rpida y aadir la solucin
decolorante lenta. Dejar destiendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la
solucin por una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiendo hasta que las bandas de
las protenas puedan ser apreciadas claramente.
4.9.4.6
Finalizada la remocin del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para
poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vaco o
manualmente.
4.9.5
4.9.5.1
Remojar el gel teido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotacin
suave.
4.9.5.2
4.9.5.3
Cubrir el gel con un segundo celofn previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo
"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 das.
4.9.5.4
Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofn que contiene el gel.
4.9.5.5
4.10
Interpretacin de resultados
4.10.1
Las protenas fijadas en geles de poliacrilamida y teidas con azul brillante de coomasie se
observan como bandas azules de diferentes pesos moleculares.
4.10.2
El peso molecular de una protena se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede
ser determinado comparando la banda con un patrn de protenas estndar de peso conocido
denominado marcador de peso molecular.
4.10.3
La distribucin de las protenas depende de la concentracin del gel, por lo tanto, el operador
deber seleccionar el marcador de peso molecular ms adecuado.
4.10.4
Algunas protenas suelen migrar anmalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilacin, fosforilacin y acetlizacin, las cuales podran retardar la
migracin de las muestras.
MPR-CNSP-016
17
4.10.5
Las protenas degradadas (desnaturalizacin de las protenas por causa de un agente qumico
catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con protenas de menor peso molecular (Figuras N 6 y 7)
1
Figura N 6. Electroforesis de protenas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:
concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 g de protena. Carriles 6 y 7: protenas degradadas.
97,4 66
-
45
31
21,5 -
MPR-CNSP-016
18
4.11
4.11.1
4.11.2
Temperatura
Depende bsicamente del voltaje de la electroforesis, la concentracin de sales (poder de
conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto
"sonrisa" o smiling (Figura N 8).
Figura N 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para protenas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extrada de Internet.
(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
4.11.3
MPR-CNSP-016
19
4.11.4.1
Las protenas tienen caractersticas moleculares que actan como factores intrnsecos durante la
electroforesis alterando su migracin y generando bandas de diferentes tamaos, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerizacin y formacin de complejos con otro tipo de molculas generan
modificaciones en el tamao de la protena dando pesos moleculares aparentes en el momento del
anlisis.
4.11.4.2
MPR-CNSP-016
20
SECCIN 5
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN
5.1
OBJETIVO GENERAL
Conocer los procedimientos bsicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.
5.2
ELECTROFORESIS VERTICAL
5.2.1
Objetivo
Conocer el procedimiento tcnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.
5.2.2
Materiales
5.2.2.1
5.2.2.2
5.2.2.3
5.2.2.4
5.2.2.5
5.2.2.6
5.2.2.7
Poliacrilamida al 30%.
5.2.2.8
APS al 10%.
5.2.2.9
TEMED.
5.2.3
5.2.4
5.2.4.1
5.2.4.2
Procedimiento
a.
MPR-CNSP-016
21
b.
No ser necesario marcar el lmite hasta donde ser vertida la poliacrilamida, debido a que el gel
usado es continuo.
c.
d.
e.
Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.
f.
Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.
Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando con papel toalla
los restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
g.
h.
Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
5.3
5.3.1
Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de poliacrilamida.
5.3.2
Materiales
5.3.2.1
5.3.2.2
Cmara de electroforesis.
5.3.2.3
Fuente de poder.
5.3.2.4
Poliacrilamida al 30%.
5.3.2.5
TEMED.
5.3.2.6
APS 10%.
5.3.2.7
5.3.2.8
5.3.2.9
Guantes.
5.3.2.10
5.3.2.11
MPR-CNSP-016
22
5.3.2.12
5.3.3
5.3.4
Procedimiento
5.3.4.1
Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las muestras, los reactivos y el equipo.
5.3.4.2
5.3.4.3
Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volmenes de solucin que
contiene el cido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o
buffer de muestra 6X. Aadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alcuotas, de
acuerdo al nmero de muestras que se colocarn en los pocillos, sobre un pedazo de lmina
extensible de parafina (Figura N 10). Acto seguido, aadir cinco volmenes de cada una de las
muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
5.3.4.4
NODO
e-
e-
e-
eA
Punta de la
micropipeta
depositando la
muestra en el pocillo
Buffer de
resolucin
Banda de ADN
e-
e-
Gel de resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- ee-
Figura N 9. Interior de una cmara de electroforesis vertical para ADN en operacin. A: Durante el depsito de la muestra de
ADN mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicacin del voltaje y migracin del ADN a travs del gel poliacrilamida. E: Las
molculas de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiiendo el ADN con
bromuro de etidio y aplicando luz ultravioleta.
MPR-CNSP-016
23
Micropipeta
Lmina extensible
de parafina
Alcuotas de buffer
de la muestra
Figura N 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lmina extensible de parafina antes de colocar las
muestras en el gel de electroforesis.
5.3.4.5
Considerar el uso de un marcador de peso molecular estndar de ADN para la determinacin del
peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.
5.3.4.6
Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.3.4.7
5.3.4.8
5.3.4.9
Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada
por el operador (este proceso debe ser estandarizado).
5.3.4.10
5.3.4.11
Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la
separacin de los vidrios que contienen el gel.
5.3.4.12
Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado,
pues el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio,
remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de
esptula para levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su
respectiva tincin en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).
5.3.4.13
Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergente
que no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura
ambiente o en una estufa a 37 C.
MPR-CNSP-016
24
5.3.4.14
5.4
5.4.1
Objetivo
Realizar la electroforesis de molculas de ADN mayores de 100 pb.
5.4.2
Materiales
5.4.2.1
5.4.2.2
5.4.2.3
5.4.3
5.4.3.1
5.4.3.2
5.4.3.3
Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en bao mara hasta que alcance una temperatura entre
50C y 60C.
5.4.3.4
Aadir agarosa en un volumen dependiente del tamao de la cmara (20mL-25 mL son suficientes
para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente
insertados (Figura N 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.
5.4.3.5
Agarosa
MPR-CNSP-016
25
Pocillo
0.5 - 1 cm.
Tanque 1
Tanque 2
Gel de agarosa
Cmara de
electroforesis
Fuente de
poder
NODO
Buffer de corrida
CTODO
MPR-CNSP-016
26
5.5
ELECTROFORESIS DE ADN
5.5.1
Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de agarosa.
5.5.2
Materiales
5.5.2.1
5.5.2.2
Fuente de poder.
5.5.2.3
5.5.2.4
5.5.2.5
Guantes.
5.5.2.6
5.5.2.7
5.5.2.8
5.5.2.9
5.5.2.10
5.5.3
5.5.4
Procedimiento
5.5.4.1
Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones, las muestras y el equipo.
5.5.4.2
Mezclar cinco volmenes de solucin conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X.
Para realizar la mezcla, aadir 1 volmen de buffer de muestra, repartidos en alcuotas de acuerdo
al nmero de muestras a cargar, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina (Figura N 10).
Aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la
muestra y mezclar totalmente.
5.5.4.3
5.5.4.4
muestra.
Considerar el uso de un marcador estndar de ADN para la medicin del peso molecular de la
Dicho marcador tambin debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se
encuentra previamente mezclado con el buffer.
MPR-CNSP-016
27
5.5.4.5
Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.5.4.6
5.5.4.7
Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las molculas de ADN que se va a separar.
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes
comprendidos entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genmico y plasmdico (>2kb) se
recomienda aplicar valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje
son explicados en la seccin 5.8.
5.5.4.8
Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posicin adoptada por los indicadores azul de
bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posicin permitie que el investigador tenga
una idea de la ubicacin aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante
que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolucin de
ADN.
5.5.4.9
5.5.4.10
Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada
por el investigador.
5.5.4.11
Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
agarosa.
5.5.4.12
El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un
siguiente procedimiento. Limpiar la cmara de electroforesis con chorro suave de agua destilada.
Secar a temperatura ambiente.
5.6
5.6.1
Objetivo
Visualizar molculas de ADN por coloracin con bromuro de etidio.
5.6.2
Materiales
5.6.2.1
5.6.2.2
Transiluminador.
5.6.2.3
Guantes.
5.6.2.4
Agua destilada.
MPR-CNSP-016
28
5.6.3
5.6.4
Procedimiento
5.6.4.1
5.6.4.2
5.6.4.3
Devolver la solucin de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con
abundante agua.
5.6.4.4
Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.
5.6.4.5
5.6.4.6
5.6.5
Interpretacin de resultados
5.6.5.1
Las molculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de
etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las molculas de ADN que
son ms grandes, generalmente migran ms retardadamente que las molculas de menor peso
(Figura N 15).
1
40001000500
Figura N 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2
y 3: molculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.
MPR-CNSP-016
29
5.6.5.2
Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estndar de peso
molecular conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de
manera aproximada el nmero de pares de bases de la molcula a analizar. Estos marcadores
comerciales adems pueden ser tiles como controles positivos del sistema de visualizacin del
ADN, principalmente cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz
(agarosa o poliacrilamida), o para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando
(clculos cualitativos de concentracin de ADN), etc.
5.6.6
5.6.6.1
Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solucin con papel filtro Whatman N 1.
5.6.6.2
Aadir 300 mg de carbn activado sobre el papel filtro y filtrar la solucin de bromuro usado sobre
el carbn.
5.6.6.3
5.6.6.4
5.6.6.5
Eliminar el carbn de un ao de antigedad as como los geles de agarosa teidos con bromuro de
etidio en bolsas de plstico de bioseguridad.
5.6.6.6
Incinerar.
5.7
5.7.1
Ventajas y desventajas
5.7.1.1
De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a travs del mtodo de
tincin con plata. La ventaja de este mtodo es que es de dos a cinco veces ms sensible que el
bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos txico. Del mismo
modo, puede teir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.
5.7.1.2
Entre las desventajas que tiene este mtodo es que tambin utiliza reactivos peligrosos, como el
formaldehdo, y requiere el uso de solucin de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas
que con el tiempo resultara muy costoso.
5.7.1.3
Es importante sealar que el mtodo de tincin con plata tambin puede ser aplicado para la
visualizacin de protenas usando un protocolo similar que no ser descrito en este manual. Para el
caso de las protenas, la sensibilidad del mtodo es de 10 a 50 veces ms alto que usando azul
brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipptido).
5.7.1.4
En general, el proceso de tincin con plata surge como una buena alternativa para la visualizacin
de ADN y protenas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en
muchos casos es necesario estandarizar las condiciones.
5.7.2
Materiales
5.7.2.1
Guantes.
MPR-CNSP-016
30
5.7.2.2
5.7.2.3
5.7.2.4
Agua bidestilada.
5.7.2.5
5.7.2.6
5.7.2.7
5.7.2.8
5.7.2.9
5.7.2.10
5.7.3.
Procedimiento
5.7.3.1
5.7.3.2
5.7.3.3
5.7.3.4
Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta
operacin tres veces.
5.7.3.5
Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lmina de plstico o placa petri por 10 a 20
segundos).
5.7.3.6
5.7.3.7
5.7.3.8
5.7.3.9
5.7.3.10
Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solucin fra (4C -8C)
de reactivo de parada o detencin y dejar en agitacin hasta que no aparezcan ms burbujas.
5.7.3.11
MPR-CNSP-016
31
10
11
12
Figura N 16. Gel de poliacrilamida teido con plata para la visualizacin de molculas de ADN. Carril1: Marcador de peso
molecular. Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.
5.8
5.8.1
5.8.2
Concentracin de la agarosa
Una molcula de ADN migrar y se distribuir de modo diferente a medida que vare la
concentracin de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenmeno se puede explicar
matemticamente mediante la siguiente frmula:
log = log o - Krt
Donde logm es el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN, t es la concentracin de la
agarosa, mo es la libre movilidad electrofortica del ADN y Kr es el coeficiente de retraso
relacionado a las propiedades del gel y del tamao y forma de las molculas que se desplazan
(Anexo B).
5.8.3
MPR-CNSP-016
32
Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parmetros fsicos como la
fuerza inica del buffer, el voltaje aplicado o la concentracin misma de agarosa (Figura N 17).
5.8.4
Voltaje aplicado
Este parmetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilizacin de las
molculas de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del
campo elctrico (aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las molculas de ADN de alto
peso molecular pero de manera indistinta. Ello genera que las molculas no se separen
completamente unas de otras pese a aumentar la velocidad de la electroforsis. En consecuencia,
se recomienda no aplicar ms de 5V/cm para molculas de ADN mayores de 2 Kb.
23130941665574361-
ADN circular
relajado
ADN circular
enrollado
23222027-
ADN
superenrollado
Figura N 17. Electroforesis de ADN plasmdico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1:
Marcador de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plsmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plsmido en
agarosa al 1%. Carril 4: Plsmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN
plasmdico. En el carril 3 se puede apreciar una menor concentracin de ADN.
5.8.5
MPR-CNSP-016
33
sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la
direccin del campo elctrico, las molculas ms grandes de 100 kb se autoalinearn, alterarn su
migracin y se podrn separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de
electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel
Electrophoresis), y es bastante usado para la separacin de molculas de ADN de grandes
tamaos (por encima de 100 kb).
5.8.6
5.8.7
5.8.8
MPR-CNSP-016
34
SECCIN 6
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Nuevos protocolos y tcnicas basadas en la electroforesis de ADN y protenas, han venido
apareciendo en los ltimos aos. Mencionaremos brevemente los ms importantes:
6.1
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
6.1.1
6.1.2
Figura N 18. Electroforesis en dos dimensiones de protenas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de:
http://www.aber.ac.uk/
parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).
6.2
ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD
6.2.1
Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de slica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de slica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un
dimetro de 25 a 100 m y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta
negativa.
6.2.2
El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo elctrico, donde el calor generado
es eficientemente disipado gracias a la accin de los pequeos capilares. Para este propsito, el
buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los
radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente elctrica se generar un flujo de protones hacia el
ctodo, proceso
conocido como flujo endo-osmtico.
MPR-CNSP-016
35
6.2.3
Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de molculas entre las cuales
tenemos: protenas, pptidos, aminocidos, cidos nucleicos, iones inorgnicos, bases orgnicas,
cidos orgnicos y clulas en general.
6.2.4
nodo (+)
Ctodo (-)
Buffer
Buffer
Foto-receptor
Computadora
con registrador
E = V/d
Figura N 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo elctrico, V = voltaje, d= distancia). La
figura es una versin modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html
6.3
MPR-CNSP-016
36
SECCIN 7
VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS
7.1
GENERALIDADES
7.1.1
Se recomienda que los equipos utilizados en biologa molecular cuenten con un certificado de
calidad avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el ptimo funcionamiento de las
pruebas moleculares.
7.1.2
Asimismo, los reactivos que se empleen debern ser de grado biologa molecular a fin de asegurar
resultados satisfactorios despus de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que
exigen mantenerse en refrigeracin, debern ser evaluados por el propio investigador que los
adquiri antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en
condiciones de refrigeracin, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida.
Generalmente, la polimerizacin no debe demorar ms de media hora.
7.1.3
7.1.4
7.2
7.2.1
Tanto el buffer de electroforesis para protenas como de ADN, debern ser preparados
adecuadamente y renovados en forma peridica. En tal sentido, se recomienda preparar solucin
stock de buffer de electroforesis concentrado 10 veces para protenas (Anexo A) 50 veces para
ADN (Anexo A). Este paso permite conservar la reproducibilidad del experimento.
7.3
PERSULFATO DE AMONIO
7.3.1
En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscpico, es decir,
suele hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deber realizarse un control peridico del frasco que lo
contiene a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la prdida de sus
propiedades qumicas durante el proceso de polimerizacin.
7.3.2
Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni
que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando
APS al 10% y verificar que la polimerizacin no demore por ms de media hora.
7.3.3
Para evitar la hidratacin del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la
tapa con lmina extensible de parafina.
7.4
BROMURO DE ETIDIO
7.4.1
La solucin de trabajo (1 g/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la
solucin, forrar el frasco con papel aluminio y rotular.
MPR-CNSP-016
37
7.4.2
La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde
50 pg (Seccin 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualizacin de la
mnima concentracin de ADN permitir determinar la calidad ptima del bromuro de etidio.
7.4.3
El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la prdida de sus propiedades
fluorescentes por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.
7.5
AGAROSA
7.5.1
7.5.2
7.6
POLIACRILAMIDA AL 30%
Esta solucin de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposicin a la
luz y el cambio de temperatura fcilmente deterioran su calidad.
7.7
AGUA DESTILADA
7.7.1
En biologa molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener ptimos
resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para
protena y ADN, as como tambin para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada.
Si el investigador cuenta con un equipo de destilacin asegrese que el agua presente una
resistividad elctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mnima
concentracin de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).
7.8
EQUIPOS DE LABORATORIO
7.8.1
Los equipos que se usan en biologa molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento
preventivo continuo por lo menos una vez al ao. Este proceso deber ser realizado por personal
tcnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compaa
fabricante.
MPR-CNSP-016
38
SECCIN 8
REGISTROS Y ARCHIVOS
Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes
pasos:
8.1
Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado
con la luz UV, tomar una fotografa con una cmara fotogrfica resistente a este tipo de luz.
8.2
En caso de no ser posible tomar una fotografa, tratar de dibujar con un lpiz el resultado lo ms
parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plstico para
cuaderno, colocarlo sobre la lmina de proteccin de luz UV y dibujar el gel con un marcador para
vidrio.
8.3
Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede
realizarse usando una cmara fotogrfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tincin con plata y
secar el gel para su posterior anlisis y registro. Para el caso de protenas teidas con azul
brillante de ccomasie tambin se recomienda secar el gel.
8.4
MPR-CNSP-016
39
ESQUEMA N 1
RESULTADOS EXPERIMENTO N
FECHA:
OBJETIVO DEL
EXPERIMENTO:
CONCENTRACIN DEL GEL:
CARRIL 1:
CARRIL 2:
CARRIL 3:
CARRIL 4:
CARRIL 5:
CARRIL 6:
CARRIL 7:
CARRIL 8:
CARRIL 9:
CARRIL 10:
CARRIL 11:
CARRIL 12:
CARRIL 13:
CARRIL 14:
OBSERVACIONES:
MPR-CNSP-016
40
BIBLIOGRAFA
Berg G, Garfin D. Protein and nucleic acid blotting and inmunobiochemical detection. Biotechniques
1985; 3: 276.
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2002. Serie de Normas Tcnicas N 18.
Maizel RM, Blexter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens parasite genes. A
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Montoya Y, Len C, Nolasco O, Talledo M, Padilla C, Velarde M, et al. Gua de prctica del
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Purves WK, Orians GH, Heller HC, Sadava D. Life: the science of biology. 5th ed. Massachusetts:
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Molecular cloning a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press;
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spectrometry: an analytical challenge for studying complex protein mixtures. Electrophoresis 2001;
22: 2844-55.
MPR-CNSP-016
41
MPR-CNSP-016
42
ANEXOS
ANEXO A
A.1
A.1.1
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
1 mg
Concentracin final
0,125 M
2.5 %
25 %
25 %
0,1 mg/mL
3,038 gr
15,01 gr
1 gr
Concentracin final
0,25 M
2M
1%
29,2 gr
0,8 gr
30 gr
Concentracin final
29,2%
0,8%
30%
Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N
1 y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft.
A.1.4
A.1.5
MPR-CNSP-016
43
A.1.6
A.1.7
BUTANOL-AGUA
Mezclar un volumen de butanol ms un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase
superior de la mezcla.
A.1.8
GEL AL 6
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
COMPONENTES DE LA SOLUCIN
GEL AL 8%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
GEL AL 10%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
10 mL
5,3
2,0
2,5
0,1
0,05
0,05
10 mL
15 mL
7,9
3,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
15 mL
20 mL
10,6
4,0
5,0
0,2
0,1
0,01
20mL
2,3
1,3
1,3
0,05
0,025
0,0025
4,6
2,7
2,5
0,1
0,05
0,05
6,9
4,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
9,3
5,3
5,0
0,2
0,1
0,01
1,9
4,0
5,9
7,9
1,7
3,3
5,0
6,7
1,3
2,5
3,8
5,0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,025
0,05
0,075
0,1
0,0025
0,05
0,0075
0,01
VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN
GEL AL 12%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
MPR-CNSP-016
5 mL
2,6
1,0
1,3
0,05
0,025
0,0025
5 mL
1,6
2,0
1,3
0,05
0,025
0,0025
44
3,3
4,0
2,5
0,1
0,05
0,05
4,9
6,0
3,8
0,15
0,075
0,0075
6,6
8,0
5,0
0,2
0,1
0,01
GEL AL 15%
Agua bidestilada
Acrilamida/bisacrilamida 30%
Tris 1,5 m pH 8,8
SDS 10%
Persulfato de amonio 10%
TEMED
A.1.9
1,1
2,5
1,3
0,05
0,025
0,0025
3,4
7,5
3,8
0,15
0,075
0,0075
4,6
10,0
5,0
0,2
0,1
0,01
A.1.10
2,3
5,0
2,5
0,1
0,05
0,05
3 mL
1,1
2,5
1,3
0,05
0,025
0.0025
4 Ml
2,3
5,0
2,5
0,1
0,05
0.05
6 mL
3,4
7,5
3,8
0,15
0,075
0.0075
8 mL
4,6
10,0
5,0
0,2
0,1
0.01
A.1.11
A.1.12
A.1.13
A.1.14
SDS 10%
Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N
de
NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada.
MPR-CNSP-016
45
MPR-CNSP-016
46
A.2
A.2.1
Cantidad
54 g
27,5 g
20 Ml
Concentracin final
0,45 M
0,45 M
0,01 M
Cantidad
242 g
571 Ml
100 Ml
Concentracin final
1,9 M
57,1%
0,05 M
Cantidad
25 mg
25 mg
4g
Concentracin final
0,25% w/v
0,25% w/v
40% w/v
Disolver en 10 mL de TAE 1X
A.2.4
3,5%
5,0%
8,0%
10%
12,0%
20%
11,6
16,6
26,6
33,3
40,0
66,6
Agua bidestilada
67,7
62,7
52,7
46,0
39,3
12,7
TBE 5X
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
20,0
APS
0,7
0,7
0,7
0,70
0,7
0,7
Acrilamida/bisacrilamida
al 30%
47
A.2.5
A.2.6
A.2.7
A.2.8
A.2.9
A.2.10
MPR-CNSP-016
48
MPR-CNSP-016
48
ANEXO B
B.1
UNIDADES Y FRMULAS
B.1.1
B.1.2
B.1.3
Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes
concentraciones de geles de poliacrilamida
Acrilamida
(% peso/volumen)
Rango de separacin
efectiva en pb
3,5
5,0
8,0
12,0
15,0
20,0
1000 - 2000
80 - 500
40 - 200
60 - 400
25 - 150
6 - 100
Xilene
Cianol FF (*)
Azul de
bromofenol (*)
460
260
160
70
60
45
100
65
45
20
15
12
(*) Los nmeros dados son los tamaos aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de
cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989)
B.1.4
MPR-CNSP-016
49
B.1.5
MPR-CNSP-016
15
12 - 43
10
16 - 68
7,5
36 - 94
5,0
57 - 212
50
ANEXO C
C.1
Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos
hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabn y
abundante agua.
Si hubo inhalacin, trasladarse inmediatamente hacia un rea donde haya aire fresco.
C.2
REACTIVO
CARACTERISTICA
Acrilamida
Agarosa
Azul de bromofenol
Bisacrilamida
Bromuro de etidio
Butanol
Dodecil sulfato de sodio (SDS)
EDTA
Glicerol
Glicina
Mercaptoetanol
Metanol
Persulfato de amonio
Sucrosa
TEMED
Tris
Xilene cianol
MPR-CNSP-016
51
MPR-CNSP-016
52
Solucin (es)
Pocillos de los geles de poliacrilamida mal Mala homogeneizacin del APS y el TEMED en la Realizar la mezcla del APS y el TEMED con
solucin de poliacrilamida.APS al 10% con ms de movimiento de rotacin lento y suave sin hacer
polimerizados.
una semana de antigedad.
burbujas.
Preparar nueva solucin de trabajo de APS al
10%
Muestra no cae eficientemente y se difunde en el Muestras de protenas no fueron calentadas a 100 Calentar las muestras a 100C antes de
buffer de electroforesis en el momento que es C antes de ser depositadas en el gel d e colocarlas en los pozos.
depositada en el pocillo.
agarosa.Buffer de la muestra tiene baja No diluir mucho el buffer de la muestra con la
concentracin de glicerol o sucrosa en el medio.
muestra propiamente dicha.
Volver a preparar buffer de la muestra.
Deficiente polimerizacin de los geles de
poliacrilamida.
Problema
Solucin (es)
ANEXO D
53
MPR-CNSP-016
Problema
MPR-CNSP-016
54
ANEXO E
E.1
E.1.1
Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solucin stock de TAE 50X
Solucin
Si se toma un volumen inicial de la solucin stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con
agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. Cmo calcular dicho volumen?
Se tiene los siguientes datos:
Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentracin inicial 1 (C1) = 10X
Volumen final 2 (V2)= 500 mL
Concentracin final 2 (C2) = 1X
Aplicando el siguiente factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2
y reemplazando valores se tiene:
V1(50X) = (1X)(500 mL)
Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda:
V1= 10 mL
Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada
E.1.2
V1 = (1X)(250 mL)
50X
V1 = 5 mL
Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego aadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen
de
250 mL con agua bidestilada.
MPR-CNSP-016
55
E.1.3
E.1.4
Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentracin de 1g/l a partir de una solucin
stock de 10 mg/mL.
Solucin
En este caso tambin usar la frmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1)
Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 g/L
Convirtiendo 10 mg/mL a g/L:
En 10 mg hay 10 000 g. En 1 mL hay 1000 L. Dividiendo:
10 000 g = 10 g/L = C1
1000 L
Reemplazando en (1)
V1 (10 g/L) = (1 g/L)(100 mL)
V1 = 10 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con
990 mL de agua bidestilada.
E.1.5
g/Mol
Preparar 50 mL de una solucin de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2
Solucin
El EDTA es un agente quelante cuya presentacin comercial es en forma de polvo. En
consecuencia, debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solucin de
0,5 M.
Aplicando la siguiente frmula:
W = M x PM x V.........................(a)
Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso
molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros.
Datos:
PM del EDTA = 336,2 g/Mol.
Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro.
Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt):
1 Lt contiene 1000 mL
x Lt habr en 50 mL
MPR-CNSP-016
56
E.1.7
E.1.8
MPR-CNSP-016
57
MPR-CNSP-016
58
ANEXO F
F.1
F.1.1
ELECTROFORESIS EN GENERAL:
DNA Electrophoresis.
http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm.
Polyacrilamide gel electrophoresis (Page):
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact
Electroforesis vertical:
http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf
Electrophoresis lecture notes.
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF.
Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol
Book.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html
Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images
to correct for geometric distortions of the spot pattern.
http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf
F.1.2
BIOSEGURIDAD:
F.1.3
UNIDADES Y FRMULAS:
Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of
Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu.
http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html
F.1.4
PROTEMICA:
MPR-CNSP-016
59
MPR-CNSP-016
60