BAB II

METODE KEGIATAN

2.1 Waktu dan Tempat

Kegiatan PPDH rotasi mikrobiolgi ini akan dilaksanakan pada tanggal 19-27
Oktober 2016 yang bertempat di Laboratorium mikrobiologi, Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Airlangga, Surabaya.
2.2 Peserta Dan Pembimbing
Peserta koasistensi mikrobiologi adalah mahasiswa PPDH FKH Universitas
Brawijaya yang berada di bawah bimbingan Drh. Didik :
Devi Purwanti
Nurfahmi Irfan S
Adhitya Fajar G
Ida Trisna Aritonang
Alda Putri Apriska
150130100011032
Anis Jayanti
Khoirinnisa Irdi
2.3 Metode Pengujian
Metode yang digunakan dalam koasistensi di Laboratorium mikrobiologi
adalah:
1. Melaksanakan pengujian terhadap sampel
2. Melaksanakan diskusi kelompok dan dengan dokter hewan pembimbing
koasistensi.
2.4

Metode dan Prosedur Pengujian

2.4.1 Uji Staphylococcus dengan Media Mannitol Salt Agar (MSA)

Menggunakan

media

selektif

MSA

(Manitol

Salt

Agar)

karena

Staphylococcus tumbuh optimal pada kadar garam 7,5% dan dapat memferrnentasi
manitol dan rnenghasilkan asarn. Waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37 'c. Media
MSA mengandung indikator pH berupa phenol red dengan range pH 6,8-8,4 (kuningmerah). pH awal adalah 7,4 0,2 (merah) berubah menjaeli kuning yang menandakan
adanya aktivitas Staphylococcus yang rnernferrnentasi manitol rnenghasilkan asarn
yang menurunkan pH media MSA

Alat dan bahan:

Tabung reaksi, ose, bunsen, inkubator, autoclave, beker glass, aquadest dan
media MSA
Cara Kerja:
111 gram media MSA dilarutkan ke dalam 1 liter aquades kemudian dipanaskan
sambil diaduk hingga larut. Kemudian dilakukan steril dengan autoclave pada suhu
1210 C selama 15 menit. Tuangkan larutan lersebut secara steril ke dalam cawan petri
steril dengan volume sesuai kebutuhan. Lalu media dibiarkan sampai dingin dan
diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam.
Setelah media jadi, cawan petri dibagi menjadi empat bagian kemudian diambil
sampel susu menggunakan ose secukupnya. Kemudian di streak pada cawan petri
yang telah terisi media Manitol Salt Agar (MSA). Diinkubasi cawan petri dalam
inkubator pada suhu 34-36C selama 24-36 jam dengan meletakkan cawan pada
posisi terbalik. Dilihat adanya koloni setelah diinkubasi selama 24-36 jam. Hasil
menunjukan postif apabila koloni yang tumbuh berwarna kuning.
Uji identifikasi lanjutan berupa:

Uji Kalalase (untuk membedakan Staphylococcus dengan Streptococcus).

Jika hasil uji positif maka mikroba yang ada adalah Staphylococcus.
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri
yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat
memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk
pertumbuhan aerobik karena H2O2 yang dibentuk dengan pertolongan
berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa
bakteri yang termasuk katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus, dan Clostridium.
Cara Kerja:
1. Mengambil kultur sampel dengan ose secara aseptis dari agar miring
dengan meijarkan ose dan mendinginkannya.
2. Biakan digoreskan pada petridish agar sel rata dan tidak bertumpuk.
3. Kultur mikroba kemudian ditetesi 1-2 tetes H2O2 3% agar aktivitas
katalase pada mikroba dapat diketahui.
4. Petridish

ditutup

kembali

agar

tidak

ada

kontaminasi

dan

memaksimalkan mikroba untuk merombak H2O2.

5. Amati ada tidaknya gelembung-gelembung kecil. Jika terdapat
gelembung maka dalam petridish tersebut merupakan bakteri katalase

positif, sebaliknya jika tidak ada gelembung termasuk bakteri katalase

negatif.

Uji Koagulase untuk menentukan jenis atau strain Staphylococcus.

Uji koagulase dilakukan dengan menanam koloni stafilokokus ke dalam
tabung yang telah berisi plasma darah kelinci, campur hingga rata dan
inkubasikan selama 4 hingga 24 jam. Hasil koagulase positif S.
aureus ditunjukkan dengan terbentuknya gumpalan, sedangkan disebut
stafilokokus koagulase negatif (CNS) bila setelah 24 jam tidak terjadi
penggumpalan (Cappucino & Sherman 2005).

2.4.2 Pemeriksaan E. coli menggunakan media EMBA

Prinsip: jika sel mikroba yang masih hidup pada sampel ditumbuhkan pada
media agar, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang. Diamati spesifikasi
pertumbuhan E.coli pada media EMBA.
Alat dan bahan: cawan petri, beker glass, pembakar bunsen, inkubator,
autoclave, EMBA (Eosin Methylene Blue Agar).
Prosedur :
37,5 gram media MSA dilarutkan ke dalam 1 liter aquades kemudian
dipanaskan sambil diaduk hingga larut. Kemudian dilakukan steril dengan
autoclave pada suhu 1210 C selama 15 menit. Tuangkan larutan lersebut secara
steril ke dalam cawan petri steril dengan volume sesuai kebutuhan. Lalu media
dibiarkan sampai dingin dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam.
Untuk mengkonfirmasi adanya pertumbuhan bakteri E.coli maka
dilakukan penanaman pada media EMBA langkah pertama adalah mengambil 1
ose inokulum pada sampel susu, kemudian di streak pada media EMBA dan
diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Hasil koloni bakteri E.coli
tumbuh berwarna kehijauan dengan kilat metalik.
2.4.3 Blood Haemolysis Test
Alat dan bahan
Darah fibrasi kelinci, spuit, EDTA 1% atau heparin, cawan petri, tabung
reaksi, inkubator, autoclave, ose, bunsen.

Cara Kerja:
Untuk mendapatkan darah fibrasi pada kelinci yang dilakukan pertama adalah
menyiapkan erlenmeyer khusus, jarum spuit steril. Pengambilan darah dilakukan
melalui jantung menggunakan jarum yang dihubungkan dengan pipet menuju
errlenmeyer berisi EDTA 1% atau heparin. Setelah darah didapat darah digoyanggoyangkan perlahan sehingga fibrin yang ada dalam darah diikat oleh EDTA 1% atau
heparin.
Untuk membuat media Blood Agar yang pertama yaitu melarutkan sebanyak 15 gram
media ke dalam 1 liter aquades kemudian dipanaskan sambil diaduk hingga larut.
Kemudian dilakukan steril dengan autoclave pada suhu 121 0 C selama 15 menit.
Dinginkan sampai suhu mencapai 500 C. Tambahkan darah fibrasi sebanyak 7%
secara aseptis. Campur dengan baik dan tuangkan larutan lersebut secara steril ke
dalam cawan petri steril dengan volume sesuai kebutuhan. Lalu media dibiarkan
sampai dingin dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam.
Sampel susu di-streak pada Blood Agar Plate dan diinkubasi 24 jam pada suhu
37oC. Koloni bakteri yang diamati akan terlihat clearing zone di sekitarnya.
Blood agar bertujuan untuk menumbuhkan kuman dan membedakan kuman
yang menghemolisa darah serta dipakai membedakan macam hemolisanya (,, ).
2.4.4 Uji TSA (Tryptic Soya Agar)
Alat dan Bahan:
Cawan petri, timbangan elektrik, spantula, erlenmeyer, hot plate, cling warp,
bunsen, botol, alumunium foil. Media Trypticase Soya Agar dan aquades.
Cara Kerja:
Timbang bahan yang akan digunakan, untuk media TSA ditimbang, setelah
ditimbang masukkan ke dalam erlenmeyer dan encerkan dengan aquades kemudian
dipanaskan sambil diaduk hingga larut. Kemudian dilakukan steril dengan autoclave
pada suhu 1210 C selama 15 menit. Tuangkan larutan lersebut secara steril ke dalam
cawan petri steril dengan volume sesuai kebutuhan. Lalu media dibiarkan sampai
dingin dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam.
Setelah media jadi, cawan petri dibagi menjadi empat bagian kemudian diambil
sampel susu menggunakan ose secukupnya. Kemudian di streak pada cawan petri
yang telah terisi media TSA. Diinkubasi cawan petri dalam inkubator pada suhu 3436C selama 24-36 jam dengan meletakkan cawan pada posisi terbalik. Dilihat
adanya koloni setelah diinkubasi selama 24-36 jam.

2.4.5 Uji Gula Gula

Alat dan bahan:
Media gula-gula (Sukrosa, manosa, maltosa, glukosa, laktosa), sampel susu,
tabung reaksi, ose, bunsen, air pepton, parafin cair.
Cara Kerja:
Gula-gula (Sukrosa, maltosa, glukosa, laktosa) ditimbang sebesar 1 gram
kemudian dilarutkan ke dalam tabung berisi air pepton kemudian ditetesi phenol red.
Kemudian tabung reaksi tersebut dimasukkan tabung durham lalu di sterilkan dengan
cara filtrasi.
Cara penanaman pada media gula-gula yang berbentuk cair dengan cara
mengaduk-aduk sampel susu yang diambil menggunakan ose ke dalam tabung reaksi
berisi media gula-gula. Kemudian ditetskan parafin cair kurang lebih 1 mL pada
tabung reaksi tersebut dan ditutup kapas. Interpretasi positif yaitu medium berwarna
kuning, artinya gula difermentasikan dan menghasilkan asam. Apabila negatif yaitu
medium berwarna merah atau tak ada perubahan.
2.4.6 Pewarnaan gram
Pewarnaan gram yaitu metode untuk membedakan spesies bakteri (bakteri
gram positif dan negatif) berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri dan
morfologinya.
Alat dan bahan:
Preparat ulas bakteri dari media ingin diamati, object glass, bunsen, ose,
minyak emersi, mikroskop, pewarna kristal violet, lugol, alkohol aseton, dan safranin.
Cara kerja:
Preparat ulas bakteri pada object glass di fiksasi kemudian diwarnai dengan
kristal violet, lugol, alkohol seton dan safranin secara bergantian dengan pewarnaan
masing-masing 1 menit yang kemudian dibilas dengan air mengalir. Kemudian
preparaat diberi oil emersi dan diperiksa di mokroskop dengan pembesaran 1000x.
Hasil bakteri gram positif terlihat ungu kebiruan, sedangkan bakteri gram negatif
terlihat berwarna pink kemerahan.