BIOQUÍMICA-Guía de Laboratorio

Bioqumica
Autores: Alvaro Marcelo Rodrguez

Juan Salazar Snchez
Lima Per
2015-II
Gua Prctica de Bioqumica
GUA DE PRCTICAS DE BIOQUIMICA

Derechos Reservados 2012
rea de Qumica
Segunda Edicin
Primera reimpresin
Diseo, Diagramacin e Impresin

Universidad Cientfica del Sur
Panamericana Sur Km. 19. Lima-Per 610-6400
Tiraje 1500 ejemplares

IMPRESO EN PER
MBA Rolando Vallejo Cortz

Vicepresidente Ejecutivo
Dra. Josefina Takahashi Amiel Prez
Rectora
Dr. Edmundo Gonzles
Vicerrector Acadmico
Dra. Mara Pa Sirvent De Luca
Coordinadora General de Cursos Bsicos
Directora de Gestin Acadmica
M Sc. Alejandro Fukusaki
Coordinador de Cursos Bsicos de Ciencias
Q.F. Juan Salazar Snchez
Coordinador de rea Qumica
Autores
Dr. Alvaro Marcelo Rodrguez
Dra. Elena Benavides Rivera
Q.F. Juan Salazar Snchez
Reservados todos los derechos: ningn material de este manual puede ser reproducido sin autorizacin expresa por
escrita por los autores. La autorizacin ser en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso
suscrito aparte, no se refiere a este manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado interno en una cantidad no mayor
de 100, solo para uso con fines educativos y sin lucro
CONTENIDO
"Me lo contaron y lo olvid, lo vi y lo entend, lo hice y lo aprend"
Confucio
INDICE
Prctica
Prctica 1. Espectrofotometra
Prctica 2. Factores que afectan la actividad enzimtica
Prctica 3. Determinacin de cido rico en suero
Prctica 4. Digestin enzimtica del almidn
Prctica 5 . Efecto de la dieta sobre el contenido de glucgeno
heptico
Determinacin de glucosa en sangre
Pgina
1
5
9
11
13
Prctica 6. Clculo del balance energtico
16
Prctica 7. Hidrlisis enzimtica de los lpidos
25
Prctica 8. Determinacin de triglicridos en plasma. Determinacin de

colesterol total
Prctica 9. Determinacin de HDL y LDL colesterol en plasma
Prctica 10. Determinacin de protenas plasmticas
Prctica 11.Determinacin de Vitamina C en alimentos vegetales.
Prctica 12. Determinacin de hemoglobina en sangre.
Determinacin de urea en orina
Hojas de informes
27
30
32
34
36
39
SISTEMA DE EVALUACION:
Evaluacin Continua de laboratorio
[Promedio de 10 pasos (Pasos cortos)(10%) +
Promedio de Informes (5%) +
Investigacin en el laboratorio (5%)]
Primer examen parcial (cuarta semana)
Examen final (sptima semana)
10%
10%
Total Laboratorio
~1~
Nmero
de
campos
10
12
01
1
1
Normal
(%)
10
5
5
10
10
40
~2~
El anlisis espectrofotomtrico, constituye una serie de mtodos de anlisis

cuantitativos que utilizan la medicin de la intensidad de la luz transmitida a
travs de soluciones que tienen la propiedad de absorber una determinada
longitud de onda.
El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a travs de una
solucin, es reflejada en parte, mientras que la mayor fraccin de sta, es
absorbida por la sustancia disuelta. La absorcin es proporcional a la
concentracin del soluto.
La propiedad de una sustancia para absorber una determinada longitud de
onda es dependiente de su estructura qumica. La ley de Lambert y Beer
expresa las relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuacin:
Io
Log
.l.c
It
Io = Luz incidente
It = Luz transmitida
= Coeficiente de extincin
c = concentracin de la solucin
l = Distancia recorrida por la luz a travs de la solucin.
El log Io/It tambin se conoce como densidad ptica (D.O.) de la solucin y
es directamente proporcional a la concentracin del soluto.
Para determinar la concentracin de una sustancia puede hacerse uso del
factor de calibracin o de una curva de absorcin.
La preparacin de una curva de calibracin se realiza utilizando
concentraciones conocidas de la sustancia cuya concentracin deseamos
conocer. Luego se determina la densidad ptica de cada una de dichas
concentraciones y se procede a preparar un grfico, donde, en el eje de
abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia y en el eje de
ordenadas la densidad ptica.
Factor de calibracin.Se define como la relacin que existe entre la concentracin del estndar y su
densidad ptica. Este factor puede obtenerse de la manera siguiente:
Concentracin del estndar
Factor de calibracin =
Densidad ptica
La concentracin del estndar puede expresarse como: mg/dL,

U/L, etc.
~3~
g/dL, mEq/L,
Para encontrar la concentracin de una sustancia problema, se multiplica el

factor de calibracin por la D.O. del problema, operacin que se realiza de
acuerdo al siguiente procedimiento
D.O.st
st
. lst . cst
=
luego:
D.O. x
D.O.st
. l x . cx
cst
cst
=
D.O. x
finalmente : cx
D.O.x
cx
D.O.
st
cst
La relacin:
se denomina
FACTOR DE CALIBRACIN.
D.O.st
Experimento N 1.- Preparacin de una curva de Absorcin.Para elaborar una curva de absorcin se preparar el siguiente sistema:
Solucin de azul de metileno (10 mg/dL)
1 mL.
Agua destilada
4 mL
Luego se proceder a realizar lecturas en el espectrofotmetro a las siguientes
longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las densidades pticas en funcin de las
longitudes de onda y determinar el pico de mxima absorcin del azul de
metileno, el cual corresponde al mayor valor de la densidad ptica.
Experimento N 2.- Preparacin de una curva de calibracin.Preparar un experimento de la siguiente manera:

Tubo N
mL Azul de metileno (10mg/dL)
0.5
mL Agua destilada
4.5
Reactivos
~4~
Con agua destilada llevar el espectrofotmetro a una D.O. de cero.

Luego leer los 5 tubos a una longitud de onda de 660 nm.
Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las
concentraciones en el eje de abscisas y las densidades pticas (D.O.) en el eje
de ordenadas, luego trazar una recta a travs de los puntos obtenidos
experimentalmente.
Utilizando la curva de calibracin o el factor de calibracin determinar la
concentracin de la sustancia problema que recibirn en la presente prctica.
Experimento N 3.- Elaborar una curva de absorcin con p-nitrofenol.

Preparar el siguiente sistema:
Solucin de p-nitrofenol 0.00005 M
Agua destilada
NaOH 0.5 N
2.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
Leer las densidades pticas en el espectrofotmetro en las siguientes

longitudes de onda: 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480 y 500 nm.
Con los resultados obtenidos graficar en un papel milimetrado los valores de
las densidades pticas en funcin de las longitudes de onda y determinar el
pico de mxima absorcin.
Experimento N 4.- Elaborar una curva de calibracin con p-nitrofenol.

Preparar el siguiente experimento:
Tubo N
Reactivos
mL p-nitrofenol 0.0001 M
mL Agua destilada
mL NaOH 0.5 N
0.1
1.4
0.5
0.2
1.3
0.5
0.3
1.2
0.5
0.4
1.1
0.5
0.5
1.0
0.5
Leer la densidad ptica de cada tubo en el espectrofotmetro a la longitud de

onda de mxima absorcin, encontrada en el experimento anterior.
Graficar en un papel milimetrado las densidades pticas en funcin de las
concentraciones de p-nitrofenol y hallar el coeficiente de extincin molar del
p-nitrofenol.
Determinar la concentracin de una muestra problema que recibir en
Prctica.
~5~
~6~
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de

acelerar las reacciones qumicas sin modificar la constante de equilibrio del
sistema. Su actividad es afectada por diversos factores: concentracin de
sustrato, pH, concentracin de enzima, temperatura, inhibidores, fuerza
inica, constante dielctrica, etc.
Efecto de la concentracin del sustrato
La velocidad de una reaccin catalizada por enzimas es dependiente de la
concentracin del sustrato. Esta dependencia es lineal cuando la concentracin
de sustrato es menor que el valor Km, perdindose esta relacin cuando la
concentracin es muy cercana a Km, para finalmente tornarse independiente
de la concentracin de sustrato.
El experimento se realizar utilizando la enzima Fosfatasa cida de hgado de
pollo, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar el p-nitrofenil fosfato en
medio cido formando como productos de la reaccin fosfato inorgnico y pnitrofenol. Este ltimo compuesto absorbe a 405 nm. Con tal propsito se
prepararn los siguientes medios de reaccin:
B-1 1 B-2
B-3
mL. Tampn citrato

0.1M pH 5.0
1.0 1.0 1.0
1.0
mL. p-nitrofenil
fosfato 0.001 M
mL. p-nitrofenil
fosfato 0.01 M
mL. agua destilada
0.2 0.2 0.4
0.4
B-4
1.0 1.0
1.0
1.0
---- ----
----
----
---- ---- ---- ----
0.1
0.1
0.2 0.2
0.8 0.7 0.6
0.9 0.8
0.8 0.7
0.5
Colocar los tubos en bao mara a 37 C durante 2 minutos, luego adicionar la

enzima conforme se indica a continuacin:
mL. de enzima
----
0.1 ----
0.1
---
0.1
---- 0.1
Detener la reaccin EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adicin de

1 mL de NaOH 1 N. Leer en el espectrofotmetro a 405 nm
Determinar la velocidad de reaccin de cada uno de los tubos y luego graficar:
~7~
a.- velocidad en funcin de la concentracin de sustrato.

b.- 1/v versus 1/[S].
c.- Calcular los valores de Vmax y Km de la enzima.
Determinar la velocidad mxima y el Km de la enzima utilizando ambos
grficos.
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

La velocidad de una reaccin enzimtica depende directamente de la
concentracin de enzima. Los experimentos deben realizarse en condiciones
de velocidad inicial. Para este propsito se preparan los siguientes medios de
reaccin:
mL. de tampn citrato 0.1 M pH 5.0
1.0
1.0
1.0
1.0
mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M
0.2
0.2
0.2
0.2
mL. agua destilada
0.8
0.75
0.7
0.65
Los tubos de ensayo se incubarn durante 2 minutos a 37 C a cuyo trmino

se adicionar la enzima, que dar inicio a la reaccin.
mL. de enzima
----
0.05
0.1
0.15
Se colocarn nuevamente los tubos en el bao mara durante 2 minutos

EXACTAMENTE y se detendr la reaccin mediante la adicin de 1 mL de
NaOH 1 N. Se leern las densidades pticas a 405 nm.
Graficar la actividad enzimtica o la velocidad de la reaccin en funcin de la
concentracin de enzima expresada como mL de enzima.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.El pH del medio de reaccin afecta la velocidad con que una enzima cataliza
una reaccin. La variacin en la velocidad de catlisis ocurre debido a que el
~8~
pH puede afectar la estabilidad de la enzima, los grupos ionizables en la

enzima, los grupos ionizables del sustrato, etc. Con la finalidad de observar
este efecto se prepararn los siguientes medios de reaccin:
pH
mL. tampn citrato 0.1M

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01M
mL. de agua destilada
3.0
1.0
0.2
0.7
4.0
1.0
0.2
0.7
5.0
1.0
0.2
0.7
6.0
1.0
0.2
0.7
7.0
1.0
0.2
0.7
Colocar los tubos en el bao mara a 37 C durante 2 minutos e iniciar la

reaccin mediante la adicin de la enzima:
mL. de enzima
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
La reaccin se detiene transcurridos EXACTAMENTE 2 minutos, mediante

la adicin de 1 mL de NaOH 1 N, luego leer en el espectrofotmetro a 405
nm.
Graficar actividad enzimtica en funcin del pH.
~9~
~ 10 ~
El cido rico es un compuesto que se forma en el organismo como producto

de excrecin de las purinas. Los niveles sricos se encuentran elevados en
diversas enfermedades tales como: insuficiencia cardiaca crnica, leucemia,
gota, sndrome de Lesch-Nyhan, etc.
Determinacin enzimtica de cido rico en suero
La determinacin de cido rico en suero se realiza utilizando dos enzimas, la
uricasa que transforma el cido rico en alantona y la enzima peroxidasa,
que en presencia de 4-aminoantipirina y DCBS forma quinonimina de color
rojo.
Uricasa
cido rico + 2H2O + O2
Alantona + H2O2 +
CO2
POD
2 H2O2 + DCBS + 4-Aminoantipirina
Quinonimina roja
Preparar lo siguientes medios de ensayo:
St
Suero o plasma
-----
25 uL
-----
Estndar
-----
-----
25 uL
Reactivo de Trabajo (mL)
1.0
1.0
1.0
Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C.

Enfriar y leer la densidad ptica en el espectrofotmetro a 520 nm.
Valores de referencia:
Hombres:
2.5 6.0 mg/dL
Mujeres:
2.0 5.0 mg/dL
~ 11 ~
~ 12 ~
El almidn constituye un importante componente de la dieta de los seres

humanos. El proceso de digestin de este nutriente se inicia en la cavidad oral,
lugar en que acta la alfa-amilasa salivar, enzima que tiene la propiedad de
hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidn y formar polisacridos de menor
peso molecular.
HIDROLISIS DEL ALMIDON POR LA AMILASA SALIVAR

Para realizar el experimento se prepararn los siguientes medios de reaccin:
mL. tampn fosfato 0.1 M pH 6.5

mL. de almidn al 1%
mL. cido clorhdrico 0.5 N
mL. de agua destilada
1.0
2.0
--2.0
1.0
2.0
--1.5
1.0
2.0
1.5
---
Colocar los tubos de ensayo en el bao mara a 37 C durante 2 min, luego

adicionar:
mL. solucin de saliva
---
0.5
0.5
Colocar nuevamente los tubos en bao mara y sacar alcuotas de 0.5 mL. de
cada uno de los tubos a los 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a los tubos
previamente preparados que contienen 2.0 mL de cido clorhdrico 0.04 N, de
acuerdo al siguiente esquema:
Tubo N 1
mL de cido clorhdrico
2.0
2.0
2.0
I gota
I gota
Luego adicionar a cada tubo:

Gotas de solucin de Lugol
1 gota
Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarn modificaciones del color
inicial de los tubos como consecuencia de la accin de la alfa-amilasa salivar.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo
claro.
~ 13 ~
~ 14 ~
El hgado es el rgano que almacena glucgeno como un elemento de

particular importancia energtica, que le permite al organismo mantener la
glicemia durante los periodos en que no ingiere alimentos. A diferencia del
tejido muscular, el hgado puede degradar el glucgeno y liberar glucosa a la
sangre.
Extraccin de glucgeno de hgado de rata.Preparacin de los animales de experimentacin.- Se dispondrn de 2 ratas
en jaulas individuales, una de las cuales recibir su dieta habitual, mientras
que la otra ser sometida a un ayuno de 24 horas. A ambas se les
proporcionar agua "ad libitum".
Extraccin del glucgeno.- Se sacrificarn ambos animales previamente
anestesiados con cloroformo y se proceder a extraerles el hgado. Luego, se
realizar una observacin del tamao y color del mencionado rgano. Se
pesar 0.5 g de hgado de cada animal se colocarn en tubos de boca ancha.
y se les adicionar 1 mL de KOH al 30%. Se colocar en la boca de cada tubo
un embudo pequeo y se les someter al bao mara hirviente durante 30
minutos. Despus de enfriar, se les adicionar 3 mL de agua destilada y 5 mL
de alcohol etlico. Se formar
precipitado en aquel hgado que contenga
glucgeno. Se centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm a cuyo trmino se
eliminar el sobrenadante. Disolver el precipitado en 200 mL de agua
destilada. La determinacin del glucgeno se realizar con la antrona.
Se prepararn los siguientes medios de reaccin:
1
mL disolucin rata en ayunas
mL disolucin rata normal
mL estndar de glucosa (5mg/dL)
mL agua destilada
1.0
-------
--1.0
-----
----1.0
---
-----1.0
Colocar los tubos en agua helada y adicionar 5.0 mL del reactivo de

antrona. Llevar los tubos al bao mara durante 15 minutos, enfriar y
leer a 660 nm.
~ 15 ~
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un
indicio, que podra permitir diagnosticar diversas patologas: diabetes
mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.
Determinacin enzimtica de glucosa en sangre (Mtodo de Trinder).
La determinacin enzimtica de glucosa sangunea se realiza utilizando 2
enzimas: glucosa oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalticas en presencia
de apropiados reactivos qumicos, permitirn la formacin de un compuesto
coloreado que es directamente proporcional a la glucosa existente en el medio
de reaccin.
Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + 02
Acido glucnico + H2O2

Peroxidasa
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol
quinona roja + 4 H2O
Preparar los siguientes medios de ensayo:
Suero o plasma
Standard
Reactivo de trabajo (mL)
St
------1.0
10 uL
---1.0
---10 uL
1.0
Incubar en bao mara a 37 C durante 5 minutos

espectrofotmetro a 500 nm.
~ 16 ~
leer en el
~ 17 ~
GENERALIDADES:
El Balance Energtico es el equilibrio que debe existir entre el Gasto
Energtico diario de un individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad,
sexo y actividad fsica, y
la Ingesta Energtica diaria a travs de los
macronutrientes de los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energtico sobre la ingesta energtica, en un tiempo

prolongado, el individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se
adelgaza. Por otro lado, si predomina la ingesta, el exceso de
energa se
acumular en el cuerpo, en forma de triglicridos, en el tejido adiposo,

observndose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario calcular, en forma independiente, el

Gasto Energtico en las 24 horas de cualquier da rutinario, de acuerdo a la
Tasa Metablica Basal (TMB) y la Actividad Fsica realizada, luego
compararlo
con la Ingesta Energtica que proporcionaron los alimentos
consumidos el mismo da, utilizando la Tabla de Composicin Qumica de

los
Alimentos de Mayor Consumo en el Per, Tabla de Medidas Caseras, y
los Factores de Conversin de Peso de Alimentos Cocidos a Crudos.
OBJETIVOS:
1. Calcular las propias Necesidades Energticas (Gasto Energtico) del
alumno.
2. Calcular la Ingesta Energtica del alumno.
3. Establecer el Balance Energtico.
MATERIALES:
Calculadora electrnica de bolsillo.
Lista detallada de las actividades realizadas durante las 24 horas, de un da
rutinario (6:00 a m - 6:00 a m).
Lista detallada de alimentos consumidos durante las 24 horas del mismo da
-Peso real actual.
~ 18 ~
PROCEDIMIENTO:
1. Calcular la Ingesta Energtica, utilizando:
1.1. La Tabla de Trabajo.

1.2. Listado de alimentos consumidos en 24 horas.
1.3. Tabla de medidas caseras (ANEXO N1).
1.4. Tabla de Factores de Conversin de peso de alimentos cocidos a
crudos (ANEXO N2).
1.5. Tabla de Composicin Qumica de Alimentos de mayor consumo en

el Per (ANEXO N3 y N4).
2. Calcular el Gasto Energtico, utilizando:

2.1. Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) de la
Tabla N1.
2.2. Tabla de Categoras y Factores de la Actividad Fsica (Tabla N2).

3. Calcular el Balance Energtico:
Balance Energtico = Ingesta Energtica - Gasto Energtico
4. Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) (-) (dficit)
4.1. EQUILIBRIO: Ingesta Energtica = Gasto Energtico.

4.2. BALANCE (+): Ingesta Energtica Gasto Energtico.
4.3. BALANCE (-): Ingesta Energtica Gasto Energtico.
5. Calcular el Porcentaje de Adecuacin de la Dieta:
~ 19 ~
% de Adecuacin = (Energa ingerida / Energa requerida(*) ) x 100
(*) Gasto Energtico = Necesidades energticas Energa requerida.
6. Analizar el Porcentaje de la Adecuacin de la Dieta obtenido, segn los

siguientes parmetros:
6.1 Valores normales = 90 - 110%.

6.2 Dficit
90%
6.3 Exceso
110%
CLCULO DE LA INGESTA ENERGTICA

a) En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones de todo
el da en cada uno de sus constituyentes. En columnas ordenadas calcular
mediante regla de tres el contenido de protenas, grasas y carbohidratos de
cada alimento respectivamente, segn la cantidad que se haya consumido.
Ejemplo1: ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL.

Leche fluida de vaca: protenas en 100 mL
Para calcular
3.1 g
la cantidad de protena que existe en 250 mL de
leche fluida de vaca:

100 mL. de leche --------- 3.1 g de protena
250 mL.
---
------
X X = 250 x
3.1 / 100
X = 7,75 g de protenas
Pulpa de carne de vacuno: protenas en 100 g de porcin comestible.
~ 19 ~
21.3
Ejemplo2: ingesta de pulpa de carne de vacuno = 90 g.
Pulpa de carne de vacuno: protenas en 100 g de porcin comestible.
~ 19 ~
21.3
.
Para calcular la cantidad de protena que existe en 90 g de pulpa de carne
de vacuno:
100 g. de pulpa de carne de vacuno(*) --------- 21.3 g. de protena
90 g.
---------
X = 90 x 21.3 / 100
X = 19.17 g de protenas
(*) La tabla de Composicin
qumica
de los alimentos indica los valores
en 100 g de porcin comestible cruda (a menos que indique los valores en

cocido).
b) Totalizar luego cada una de las tres columnas, y el valor obtenido en

gramos de cada macronutriente se multiplica por el factor respectivo.
Protena
x 4,0 kcal.
Grasa
x 9,0 kcal.
Carbohidrato
4,0 kcal.
c) Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad de

energa (kilocaloras) que aportaron los alimentos consumidos ese da.
TABLA DE TRABAJO
~ 20 ~
Alimentos
Cantidad en
Cantidad (g)
Protenas (g)
Grasas (g)
medida casera
Carbohidra
tos (g)
Desayuno
Almuerzo
Comida
Entre
comidas
Sub-total:
Factor:
x4
x9
x4
TOTAL
: (kilocaloras)
INGESTA ENERGTICA = (kcal)/d
CLCULO DEL GASTO ENERGTICO
G.E. = TMB
Factor de Actividad
a) Se calcula la Tasa Metablica Basal (TMB) o gasto en reposo, aplicando la

frmula de la siguiente tabla.
TABLA N1
Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) a partir del peso corporal
~ 21 ~
(P)
Rango de edad (aos)
kcal/da
Hombres:
0 -3
60,9 P - 54
4 - 10
22,7 P + 495
11 - 18
17,5 P + 651
19 - 30
15,3 P + 679
31 - 60
11,6 P + 879
> 60
13,5 P + 487
Mujeres:
0-3
61,0 P - 51
4 - 10
22,5 P + 499
11 18
12,2 P + 746
19 - 30
14,7 P + 496
31 - 60
8,7 P + 829
> 60
10,5 P + 596
OMS(1985)
Ejemplo: La TMB para una estudiante de 19 aos de edad
con 55 kg. de
peso, ser:
TMB = 14.7 P + 496
TMB = 14.7 55 + 496
TMB = 1 305 kcal/d
b) Con la lista de actividades,
se agrupan stas por categoras, tomando en
cuenta el tiempo empleado (en minutos)
y multiplicndolas por el
mltiplo de la TMB o factor de actividad (o gasto de energa promedio

por actividad).
Las categoras de actividad fsica son las siguientes:
~ 22 ~
TABLA N2
Actividad Fsica
Categora
Dormir, descansar.
Manejando automvil, escribiendo en computadora,
atendiendo clase, trabajando en laboratorio, viendo TV,
cocinando, planchando, jugando cartas, tocando un
instrumento musical .
Reposo
Muy ligera
Mltiplo
de la TMB
o Factor
por
actividad
1,0
1,5
Caminando a 4 - 5 km/h, atendiendo al pblico,

limpieza de la casa, cuidando nios, trabajo de
carpintera y electricidad, jugar tenis de mesa.
Ligera
2,5
Caminando a 5.5 - 6.5 km/h ,Manejando bicicleta,

bailando, trabajando en jardinera, cargando bultos
pesados.
Moderada
5,0
Jugando ftbol, vley, bsquet, caminando con

carga
pesada cuesta arriba, cortando rboles, trabajo de
excavacin manual.
Pesada
7,0
* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y muscular.

Recomendacin FAO/OMS 1985.
Ejemplo:
1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:
HORA
ACTIVIDAD
TIEMPO
06:00 a.m. a 06:15 a.m.
Aseo personal
15
06:15 a.m. a 06:45 a.m.
Tomar desayuno
30
06:45 a.m. a 07:00 a.m.
Caminar para tomar el bus
15
07:00 a.m. a 08:00 a.m.
Viajar en bus
60
08:00 a.m. a 10:00 a.m.
Asistir a clase
120
etc. (Debe completar 1440 minutos).

2) Agrupar por categora de actividad:
Categora de actividad
Tiempo
~ 23 ~
Mltiplo de la TMB
Factor de
empleado
(Horas)
En reposo
Muy ligera
Ligera
8
14
2
factor por
actividad
1,0
1,5
2,5
TOTAL
Promedio / hora
(Factor de TMB/ 24 h)
Gasto Energtico
(1.417 x TMB)*
TMB
ponderad
o
8,0
21,0
5,0
34,0
1.417
1 850,0
GASTO ENERGTICO = 1.417 TMB

= 1.417 1 305
GASTO ENERGTICO = 1 850,0 kcal/d
~ 24 ~
~ 25 ~
Hidrlisis de los lpidos por la lipasa pancretica.Los lpidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por accin de la
lipasa pancretica. En este proceso juegan un papel muy importante las sales
biliares, compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lpidos para
una eficiente accin de la lipasa pancretica.
Con la finalidad de mostrar experimentalmente la accin hidroltica de esta
enzima se prepararn los siguientes medios de reaccin:
mL. de tampn fosfato 0.1 M pH 7.8

mL. de aceite
mL. de sales biliares al 1%
mL de agua
2.0
1.0
2.0
5.0
2.0
1.0
2.0
---
2.0
1.0
--2.0
--1.0
2.0
2.0
Aadir II gotas de fenolftalena a cada uno de los tubos, luego adicionar gota
a gota una solucin de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloracin
dbilmente grosella estable, luego adicionar:
mL. de solucin de pancreatina al 1%
---
5.0
5.0
5.0
Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitndolos

cada 5 minutos.
Al finalizar el tiempo de incubacin adicionar nuevamente a cada tubo II
gotas de fenolftalena y proceder a titular, utilizando una bureta, con una
solucin de NaOH 0.05 N hasta que aparezca nuevamente la coloracin
ligeramente grosella.
Los resultados se expresarn como miliequivalentes de cido esterico
liberado por accin de la lipasa pancretica.
~ 26 ~
~ 27 ~
La determinacin de triglicridos en plasma constituye un dato muy

importante en el manejo de ciertas Dislipidemias. Su incremento en el plasma
constituye un factor de riesgo positivo para aterosclerosis.
Determinacin de triglicridos en plasma
Los triglicridos del plasma son hidrolizados por una lipasa que forma como
productos glicerol y cidos grasos. El glicerol en presencia de ATP por accin
de la glicerol quinasa es convertido en glicerol-3-fosfato, compuesto que es
convertido por la glicerol fosfato oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y
perxido de hidrgeno, este compuesto en presencia de 4-aminofenazona (4Aminoantipirina), DCBS y peroxidasa (POD) es transformado en una
quinonimina de color rojo.
Lipasa
Triglicridos
cidos grasos
Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol
+ ATP
ADP +
Glicerol-3-fosfato
GPO
Glicerol-3-fosfato + O2
Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

POD
2 H2O2
4-AAP +
DCBS
Suero o plasma
Estndar
Reactivo de Trabajo
Quinonimina
------1.0 mL
10 uL
---1.0 mL
roja
St
---10 uL
1.0 mL
Mezclar e incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C, luego leer en el

~ 28 ~
DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen

una estrecha relacin con diversas patologas, por cuyo motivo su
determinacin puede contribuir al diagnstico de: aterosclerosis, mixedema,
diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.
Determinacin de colesterol total en sangre
La tcnica utilizada para la
determinacin se fundamenta en la
hidrlisis previa de los steres de colesterol por la colesterol esterasa, la
posterior accin de la enzima colesterol oxidasa que formar perxido de
hidrgeno en cantidades estequiomtricas y finalmente la participacin de la
peroxidasa que en presencia de reactivos qumicos formar un compuesto
coloreado proporcional a la cantidad de colesterol existente en la muestra de
sangre.
Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O
Colesterol + AGNE
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2
colesten-3-ona + H2O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AAP + pHBA
quinona coloreada + 4 H2O
Suero o plasma
Standard
------1.0
10 uL
---1.0
St
---10 uL
1.0
Incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C y leer en el

~ 29 ~
~ 30 ~
Determinacin de HDL colesterol

Las LDL y VLDL son precipitadas en forma selectiva con sulfato de dextrano
en presencia de iones magnesio, de tal manera que en el sobrenadante que se
obtiene despus de centrifugar, quedan las HDL, donde se realiza la
determinacin de colesterol que esta lipoprotena transporta.
Preparacin de la muestra:
Medir en un tubo de ensayo 200 L de suero o plasma luego adicionarle 500
L del Reactivo precipitante, agitar durante 20 segundos y dejar en reposo
por 15 minutos en bao de agua a una temperatura de 4 10 C. Centrifugar a
3000 rpm durante 15 minutos y proceder a preparar el siguiente sistema:
B
Sobrenadante
Estndar de colesterol
------1.0
X
100 uL
---1.0
St
---10 uL
1.0
Incubar durante 10 minutos a 37 C y leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

Determinacin de LDL colesterol
Las LDL se precipitan selectivamente con el uso de heparina, quedando en el
sobrenadante las HDL y VLDL. El colesterol que se encuentran con estas
lipoprotenas se determina enzimticamente, correspondiendo el valor de las
LDL a la diferencia entre el colesterol total y el determinado en este
sobrenadante.
Preparacin de la muestra:
Medir en un tubo de ensayo 50 L de suero o plasma luego adicionarle 500
L del Reactivo precipitante, agitar durante 20 segundos y dejar en reposo
por 15 minutos en un bao a 20 25 C. Centrifugar a 3000 rpm y separar
inmediatamente el sobrenadante. Preparar el siguiente esquema:
Sobrenadante
Estndar de colesterol
------1.0
100 u L
---1.0
St
---10 uL
1.0
~ 31 ~
~ 32 ~
Las protenas plasmticas cumplen diversas funciones que son muy

importantes para un apropiado funcionamiento de los diversos tejidos
del
organismo. Pueden cumplir funciones de transporte, catalticas, coagulacin,
etc. Su determinacin cuantitativa es muy til para el diagnstico de algunas
patologas como: desnutricin, deshidratacin, cirrosis, etc.
Determinacin de protenas plasmticas total (Mtodo de Biuret)

La determinacin de las protenas totales se realiza utilizando iones cpricos
que en medio alcalino reacciona con las protenas formando compuestos de
coordinacin de color violeta, cuyo pico de mxima absorcin es de 540 nm y
su intensidad es proporcional a la concentracin de protenas.
Preparar los siguientes medios de reaccin:
B
Agua destilada
Suero
Estndar de protenas
Reactivo de Biuret (mL)
---------1.0
---10 uL
---1.0
St
------10 u L
1.0
Determinacin de albmina
La albmina reacciona con el Bromo cresolsulfonftalena a pH 3.8 formando
un compuesto coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:
Estndar
Suero
Reactivo Verde de
bromocresol
(mL)
St
-------
10 uL
-----
---10 uL
1.0
1.0
1.0
Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 3 minutos y

leer en el espectrofotmetro a 620 nm.
~ 33 ~
~ 34 ~
La vitamina C es un compuesto que el ser humano debe ingerir

necesariamente en su dieta habitual, debido a que no dispone de las enzimas
necesarias para sintetizarlo, como ocurre en las ratas.
Determinacin de vitamina C en frutas ctricas
La vitamina C puede determinarse cuantitativamente utilizando el reactivo de
Folin-Ciocalteu, para cuyo propsito se proceder de la siguiente manera:
Preparacin de la muestra.Se proceder a extraer el jugo de una fruta ctrica como el limn o la naranja y
se proceder a diluirlo al 1/2 con cido tricloroactico al 10%, luego se filtrar
y centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.
Para la determinacin cuantitativa de vitamina C se proceder de la siguiente
manera:
B
---
0.1
---
0.2
0.2
0.2
---
0.1
mL. del jugo de fruta diluido

mL. del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10%
mL. de estndar de cido ascrbico (0.1 mg/mL) --mL. de agua destilada
1.8
1.7
St
1.7
Dejar en reposo durante 10 minutos y proceder a leer en el espectrofotmetro

a 750 nm.
Para realizar los clculos es necesario considerar la dilucin de la muestra
problema.
Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la vitamina C en frutas.En un tubo de cultivo con tapa rosca medir 2 mL del jugo de fruta diluido y
luego colocarlo en un bao mara a 100 C. Determinar el contenido de
vitamina C de acuerdo a la tcnica antes descrita a los 20 minutos y luego a
los 40 minutos de incubacin, para cuyo propsito se tomarn alcuotas de 0.1
mL.
En un papel milimetrado graficar el % del contenido de vitamina C en funcin
del tiempo el logaritmo del porcentaje de vitamina C remanente en funcin
del tiempo.
~ 35 ~
~ 36 ~
La hemoglobina es una protena que tiene un papel muy importante en el

transporte de gases en todo el organismo. Sus niveles en sangre mantienen
una estrecha relacin con la anemia, policitemia o deshidratacin.
Determinacin de hemoglobina (Mtodo de Drabkin).La determinacin de hemoglobina se realiza utilizando el reactivo de Drabkin,
en cuya composicin se encuentra el ferricianuro de potasio, cianuro de
potasio y bicarbonato de sodio. El ferricianuro transforma las hemoglobinas
en metahemoglobina, compuesto que luego reacciona con el cianuro de
potasio para formar cianometahemoglobina, que tiene la propiedad de
absorber a 540 nm.

X
Sangre
10 uL
2.5
Mezclar
y despus de 3 minutos leer en el espectrofotmetro a 540 nm
llevando el equipo a cero con el Reactivo de trabajo.
El Estndar de hemoglobina est preparado y se encuentra listo para leer su
D.O. en el espectrofotmetro, tiene una concentracin correspondiente a 18
g/dL de hemoglobina.
DETERMINACION DE UREA EN ORINA

La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hgado a partir del
ion amonio, bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reaccin
es la carbamoil fosfato sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N-acetil
glutamato. La excrecin de urea por la orina depende fundamentalmente de la
ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede ocurrir a causa de
una probable disfuncin renal.
~ 37 ~
Determinacin de urea en orina.La determinacin de urea en orina se fundamenta en la accin que ejerce la
enzima ureasa sobre la urea, descomponindola en anhdrido carbnico y
amoniaco. El amoniaco reacciona con salicilato e hipoclorito en medio
alcalino formando un complejo de color verde cuya intensidad es proporcional
a la concentracin de urea.
Urea + 2H2O
2 NH3
+ CO2
H2O
Muestra
Estndar
Blanco
-----1.0
Estndar
-----10 uL
1.0
Muestra
10 uL
-----1.0
Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego adicionar:

Reactivo hipoclorito (mL)
1.0
1.0
1.0
Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a

600 nm.
Clculos:
66
Factor =
D.O estndar
Urea (mg/dL) = Factor x D.O. de la muestra
~ 38 ~
PRACTICA N 12
INFORME
DETERMINACIN DE UREA EN ORINA
.................................................................
Apellidos
Nombre(s)
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 39 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
INFORME
DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA
..........................................................
Apellidos
Nombre
.................
Mesa N
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 40 ~
....................
Fecha
PRACTICA N 11
INFORME
DETERMINACIN DE VITAMINA C EN ALIMENTOS
................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 41 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 42 ~
PRACTICA N 10
INFORME
DETERMINACIN DE PROTEINAS PLASMATICAS
................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 43 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 44 ~
PRACTICA N 9
INFORME
DETERMINACIN DE HDL Y LDL COLESTEROL EN PLASMA
................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 45 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 46 ~
PRACTICA N 8
INFORME
DETERMINACIN DE TRIGLICRIDOS Y COLESTEROL EN
PLASMA
.............................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 47 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 48 ~
PRACTICA N 7
INFORME
HIDRLISIS ENZIMTICA DE LOS LIPIDOS
..............................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 49 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 50 ~
PRACTICA N 6
INFORME
CALCULO DEL BALANCE ENERGTICO
...............................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 51 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 52 ~
PRACTICA N 5
INFORME
EFECTO DE LA DIETA SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCOGENO
HEPTICO
.................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.a.- Rata con dieta normal.-
b.- Rata en ayuno de 24 horas.-
3.- Conclusiones.-
~ 53 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
INFORME
DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE
..................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 54 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
PRACTICA N 4
INFORME
DIGESTIN ENZIMTICA DEL ALMIDON
.................................................................
Apellidos
Nombre
.................
Mesa N
....................
Fecha
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.Tubo N
observado
Tiempo (min.)
Color
............................................
10
...........................................
15
...........................................
20
...........................................
............................................
10
...........................................
15
...........................................
20
...........................................
............................................
10
...........................................
15
...........................................
20
...........................................
3.- Conclusiones.-
~ 55 ~
~ 56 ~
PRACTICA N 3
INFORME
DETERMINACIN DE ACIDO URICO EN SUERO
..................................................................
Apellidos
Nombre
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.-
3.- Conclusiones.-
~ 57 ~
.................
Mesa N
....................
Fecha
~ 58 ~
PRACTICA N 2
INFORME
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
.............................................................
Apellidos
Nombre
.................
Mesa N
....................
Fecha
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.a.- Efecto de la concentracin de sustrato.Densidad ptica
Concentracin de
sustrato
.............
...............
.............
...............
.............
...............
.............
...............
b.- Efecto de la concentracin de enzimas.Densidad ptica
Concentracin de
Enzima
.........................
.................................
.........................
.................................
.........................
.................................
c.- Efecto del pH.-
~ 59 ~
Densidad ptica
pH
.........................
...............................
.........................
..............................
.........................
..............................
3.- Conclusiones.-
~ 60 ~
PRACTICA N 1
INFORME
ESPECTROFOTOMETRIA
....................................................................
Apellidos
Nombre
..................
Mesa N
..............
Fecha
1.- Objetivos.-
2.- Resultados.a.- Curva de absorcin de Azul de Metileno.Densidad ptica Longitud de onda
Densidad ptica
Longitud de onda
.............
...............
..............
.................
.............
...............
..............
.................
.............
...............
.............
.................
.............
...............
.............
.................
b.- Curva de calibracin de Azul de Metileno.Densidad ptica
Concentracin (Azul de metileno)
.........................
.................................
.........................
.................................
.........................
.................................
.........................
.................................
~ 61 ~
a.- Curva de absorcin de p-nitrofenol.Densidad ptica Longitud de onda Densidad ptica
Longitud de onda
.............
...............
..............
.................
.............
...............
..............
.................
.............
...............
..............
.................
.............
...............
..............
.................
b.- Curva de calibracin de p-nitrofenol.Densidad ptica
Concentracin (Azul de metileno)
.........................
.................................
.........................
.................................
.........................
.................................
.........................
.................................
3.- Conclusiones.-
~ 62 ~

BIOQUÍMICA-Guía de Laboratorio

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

BIOQUÍMICA-Guía de Laboratorio

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Bioqumica

Autores: Alvaro Marcelo Rodrguez

Gua Prctica de Bioqumica

GUA DE PRCTICAS DE BIOQUIMICA

Diseo, Diagramacin e Impresin

Tiraje 1500 ejemplares

Gua Prctica de Bioqumica

MBA Rolando Vallejo Cortz

Gua Prctica de Bioqumica

Prctica 6. Clculo del balance energtico

Prctica 7. Hidrlisis enzimtica de los lpidos

Prctica 8. Determinacin de triglicridos en plasma. Determinacin de

Gua Prctica de Bioqumica

Gua Prctica de Bioqumica

El anlisis espectrofotomtrico, constituye una serie de mtodos de anlisis

La concentracin del estndar puede expresarse como: mg/dL,

Gua Prctica de Bioqumica

Para encontrar la concentracin de una sustancia problema, se multiplica el

Experimento N 2.- Preparacin de una curva de calibracin.Preparar un experimento de la siguiente manera:

mL Azul de metileno (10mg/dL)

Gua Prctica de Bioqumica

Con agua destilada llevar el espectrofotmetro a una D.O. de cero.

Experimento N 3.- Elaborar una curva de absorcin con p-nitrofenol.

Leer las densidades pticas en el espectrofotmetro en las siguientes

Experimento N 4.- Elaborar una curva de calibracin con p-nitrofenol.

Leer la densidad ptica de cada tubo en el espectrofotmetro a la longitud de

Gua Prctica de Bioqumica

Gua Prctica de Bioqumica

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de

mL. Tampn citrato

1.0 1.0 1.0

0.2 0.2 0.4

---- ---- ---- ----

0.8 0.7 0.6

Colocar los tubos en bao mara a 37 C durante 2 minutos, luego adicionar la

Detener la reaccin EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adicin de

Gua Prctica de Bioqumica

a.- velocidad en funcin de la concentracin de sustrato.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA

mL. de tampn citrato 0.1 M pH 5.0

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M

mL. agua destilada

Los tubos de ensayo se incubarn durante 2 minutos a 37 C a cuyo trmino

Se colocarn nuevamente los tubos en el bao mara durante 2 minutos

Gua Prctica de Bioqumica

pH puede afectar la estabilidad de la enzima, los grupos ionizables en la

mL. tampn citrato 0.1M

Colocar los tubos en el bao mara a 37 C durante 2 minutos e iniciar la

La reaccin se detiene transcurridos EXACTAMENTE 2 minutos, mediante

Gua Prctica de Bioqumica

Gua Prctica de Bioqumica

El cido rico es un compuesto que se forma en el organismo como producto

Preparar lo siguientes medios de ensayo:

Reactivo de Trabajo (mL)

Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en bao mara a 37 C.

Gua Prctica de Bioqumica

Gua Prctica de Bioqumica

El almidn constituye un importante componente de la dieta de los seres

HIDROLISIS DEL ALMIDON POR LA AMILASA SALIVAR

mL. tampn fosfato 0.1 M pH 6.5

Colocar los tubos de ensayo en el bao mara a 37 C durante 2 min, luego

Luego adicionar a cada tubo:

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Gua Prctica de Bioqumica