Kuis 5 1. Ekspresi gen terdiri dari proses transkripsi yang menghasilkan mRNA dan translasi yang menghasilkan protein 2. Vektor kloning bertujuan untuk mendapatkan DNA sehingga memiliki sifat copy number tinggi Sedangkan vektor ekspresi bertujuan untuk mendapatkan protein sehingga memiliki komponen tambahan untuk proses downstream/pemurnian 3. Contoh prokariot yang biasa digunakan untuk ekspresi adalah bakteri Bacillus cereus yang termasuk bakteri gram positif dan bakteri Escherichia coli yang merupakan bakteri gram negatif yang dapat menghasilkan protein periplasmik. 4. Promoter pada Pichia pastoris adalah AOX1 yang diinduksi oleh metanol 5. Gambarkan skema vektor ekspresi eukariot dan sebutkan bagian-bagiannya! Satuan transkripsi Promoter (p) Sisi kloning (MCS) Sinyal terminasi transkripsi & poliadenilasi (t) Marker seleksi eukariot (ESM) E. coli (Ampr) ori E. coli eukariot
Pemurnian protein Pemisahan berdasarkan perbedaan sifat kimia dan fisika protein dgn molekul lain Ukuran Afinitas
Pemurnian protein
Pemisahan berdasarkan ukuran
Pemurnian protein Pemurnian 1.000 10.000 x Protein rekombinan: Hexa-His: mengikat ion logam (Ni2+, Cu2+ GST (glutation S- transferase): mengikat glutation
Pemurnian protein
SDS-PAGE
SDS terikat pada
bagian hidrofobik dari protein
Protein terdenaturasi Muatan protein menjadi negatif
Elektroforesis dua dimensi
Western blotting / immunoblotting
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Penentuan urutan asam amino dengan
alat MS/MS Mass spek I Protein diberi perlakuan dengan protease Massa masing-masing peptida ditentukan
Mass spek II Peptida ditembak dengan atom-atom gas berenergi tinggi Ikatan peptida putus, terbentuk fragmen-fragmen yang masingmasing berbeda 1 aa Fragmen-fragmen peptida dipisahkan dan massanya ditentukan
Urutan asam amino ditentukan berdasarkan perbedaan massa
antara peptida Bila massa aa jauh lebih tinggi, berarti ada modifikasi pasca translasi
