Anda di halaman 1dari 14

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN X
PEMURNIAN PROTEIN

OLEH :
NI KADEK LILIK HANDAYANI
NI WAYAN GALUNG ARYANI

(1508505008)
(1508505020)

I GDE PANDE ANINDHITA P.W.

(1508505030)

KELOMPOK VI
GOLONGAN A

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016

PERCOBAAN X
PEMURNIAN PROTEIN

I. TUJUAN
I.1 Mahasiswa memahami prinsip dasar pemurnian protein.
I.2 Mahasiswa mampu memahami dan melakukan fraksinasi protein dengan garam
amonium sulfat.
I.3 Mahasiswa mampu memahami metode SDS-PAGE protein.
II. DASAR TEORI
II.1

Pemurnian Protein

Protein, yang namanya berarti pertama atau utama merupakan makromolekul


yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lenih dari setengah berat kering pada
hamper semua organisme. Struktur protein yang terdiri dari polipeptida mempunyai rantai
yang amat panjang, tersusun atas banyak unit asam amino (Lehninger, 1982).
Terdapat banyak metode yang dapat digunakan dalam pemurnian protein toksin.
Metode pemurnian dapat ditentukan berdasarkan jenis protein yang akan diisolasi serta
tingkat kemurnian protein yang diinginkan. Tahap-tahap pemurnian yang akan dilakukan
harus disesuaikan dengan jenis protein, maksudnya apakah protein tersebut merupakan
protein ekstraseluler atau protein intraseluler (Scopes 1993).
Secara umum pemurnian protein selalu diawali dengan tahap isolasi protein
(pemisahan sel) hingga dihasilkan ekstrak kasar yang mengandung protein. Hal yang
membedakan pada protein intraseluler, terdapat tahap perusakan sel terlebih dahulu
sebelum dilakukan isolasi protein. Perusakkan sel dapat dilakukan secara kimia, fisika,
dan enzimatik (Koolman & Roehm 2005).
Isolasi protein dapat dilakukan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan yang tinggi
(5000-10000 rpm) atau presipitasi menggunakan garam seperti ammonium sulfat (Scopes
1993). Kedua metode tersebut bertujuan menghilangkan molekul atau partikel pengotor
dari sel seperti organel sel, karbohidrat atau lipid yang tidak diinginkan agar didapat
isolat protein yang murni. Tahap yang selanjutnya adalah memisahkan protein dari
senyawa yang berbobot molekul rendah yang berada dalam ekstrak sel dengan proses
dialisis. Selanjutnya dapat dilakukan pemisahan protein yang diinginkan berdasarkan
ukuran atau muatannya (Lehninger 1982). Metode yang sudah umum digunakan dalam
pemisahan protein berdasarkan ukurannya adalah filtrasi gel. Sementara itu pemisahan

berdasarkan muatan protein dapat dilakukan dengan metode kromatografi penukar ion
(Bollag et al 1996).
Tingkat kemurnian protein yang diinginkan umumnya dipastikan dengan metode
elektroforesis gel poliakrilamid natrium dedosil sulfat (SDS PAGE). Protein akan
terdenaturasi menjadi subunitnya, kemudian protein akan terpisah berdasarkan
ukurannya. Melalui metode elektroforesis SDS PAGE ini dapat diketahui apakah protein
yang diisolasi merupakan protein dengan bobot molekul yang diinginkan dan apakah
masih terdapat molekul protein nontarget (Koolman & Roehm 2005).
II.2

Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran

berdasarkkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah pengaruh medan
listrik. Cara elektroforesis telah diigunaakan untuk analisa virus, asam nnukleat, enzim,
dan protein lain, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti
asam amino (Westermeier, 2004).
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Elektroforesis (SDS- PAGE) adalah
teknik untuk memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya
untuk bergerak dalam arus listrik, yang merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida
atau berat molekulnya. Hal ini dicapai dengan menambahkan deterjen SDS dan
pemanasan untuk merusak struktur tiga dimensi pada protein dengan terpecahnya ikatan
disulfide yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidhihidril. SDS akan membentuk
kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negativ karena gugus-gugus
anionic dari SDS (Hemes,1998).
Prinsip penggunaan metode gel poliakrilamid ini adalah migrasi komponen
akrilamida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi kisi tersebut berfungsi sebagai saringan
molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk
mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk
menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor pemurnian protein
(Wilson dan Walker, 2000).
III. ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat
- Bio-Rad Mini Protein III
- Power supply
- Tabung eppendorf
- Gel loading tips

3.2 Bahan
- Akrilamid : bis-akrilamid (39:1)
- Tris-HCl pH 6,8 IM
- Tris-HCl pH 8,7 IM
- SDS 20%
- N, N, N-,N- -tetrametiletilendiamin (TEMED)
- Amonium persulfat 10%
- Running buffer ( 1 gr SDS 3,03 gr Tris, 14,4 gr glisin, ditambahkan air sampai
dengan 100 ml)
- Larutan staining ( 940 ml methanol, 15 ml asam asetat, 0,1 gr Coomasie blue,
ditambahkan air samapai dengan 100 ml)
- Larutan destaining (10 ml metanol, 7,5 ml asam asetat, ditambahkan air sampai 100
ml)
- 5 x Sample buffer (12,5 ml 1 M tris pH 6,8 20 ml , gliserol, 10 ml merkaptoethanol,
40 ml 10 % SDS, 15 mg Bromophenol Blue)
IV. CARA KERJA
4.1 Persiapan Gel
Dicampurkan semua larutan untuk separating gel denan urutan

Dituangkan (dengan menggunakan pipet) larutan kedalam gel sandwich


sampai kira-kira 1,5 cm dari bagian atas plate
Tambhakan air sampai ketinggian kira-kira 1-5mm

Diamkan sampai terjadi polimerisasi(30 menit)

Dicampurkan semua larutan untuk stacking gel dengan urutan penambahan

Dibuang air yag terdapat pada bagian atas separating gel

Dituangkan campuran stacking gel di atas separating gel dan sisipkan


comb

Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit)

4.2 Persiapan Sampel


Disiapkan larutan protein standar dan sampel protein

Ditambahkan 5 kali sampel buffer

Dididihkan selama 5 menit

Dinginkan dalam es selama 5 menit

4.3 Elektroforesis Gel


Dipasangkan gel sandiwich yang telah disiapkan ke alat elektroforesis

Dituangkan running buffer ke dalam tank elektroforesis

Dimasukkan sampel protein (10-20g) ke dalam tiap-tiap lubang gel


dengan pipet mikro (eppendorf)

Dipasakan alat elektroforesis

Disambungkan ke power supply dan lakukan elektroforesis pada voltase


tetap 200v

Dimatikan alat setelah blue dye tepat keluar dari gel (kira-kira 60 menit)

4.4 Staining dan Destaining


Dikeluarkan gel dari plate (gunakan sarung tangan)

Dimasukkan ke dalam larutan staining


(20 ml)

Dibiarkan selama 5 menit

Dipindahkan ke dalam larutan destaining (50 ml)

Dibiarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit-semalam)

V. HASIL PENGAMATAN
5. 1 Komposisi Zat Gizi
Sebelum dilakukan pemisahan protein dengan elektroforesis, terlebih dahulu
dilakukan analisis komposisi zat gizi makro susu kuda, Hasil analisis pH, protein, lemak,
dan abu pada susu kuda murni dan susu kuda kemasan (Gambar 1).

5. 2 Komposisi Asam Lemak


Terlihat pada Gambar 2, bahwa baik susu kuda murni maupun susu kuda dalam
kemasan dapat terdeteksi sebanyak 12 jenis asam lemak.

5. 3 Komposisi Asam Amino


Gambar 3 menunjukkan bahwa baik susu kuda murni maupun susu kuda dalam
kemasan dapat terdeteksi sebanyak 4 jenis asam amnio esensial, yaitu: histidin, treonin,
metionin, dan lisin.

5.4 Bioaktif Protein


Pada pengujian komponen bioaktif protein dalam susu dilakukan pemisahan protein
dengan elektroforesis (Gambar 4). Protein merupakan suatu molekul amfoterik yaitu
suatu molekul yang dapat bermuatan positif atau negatif. Muatan protein tergantung dari
pH medium di sekitarnya.

Tabel 1 menunjukkan bahwa kandungan bioaktif protein susu kuda mengandung zat
bioaktif dengan berat molekul yang rendah, yaitu Antara 14.400 kD (Lisosim) dan 21.000 kD
(anti tripsin).

VI. PEMBAHASAN
Berdasarkan jurnal yang diperoleh, diketahui bahwa dalam jurnal tersebut, pemurnian
protein dilakukan dengan metode elektroforesis. Dimana sampel yang digunakan adalah susu
kuda asal Sumbawa yang dibawa secara langsung dari Sumbawa, Nusa Tenggara Barat dan
susu kuda kemasan yang beredar di Bogor.
Sebelum melakukan analisis dengan metode elektroforesis, dilakukan preparasi sampel
terlebih dahulu. Dimana sampel susu kuda Sumbawa diambil sebanyak 1000 mL dan susu
kuda kemasan yang beredar di Bogor yang digunakan sebagai pembanding sebanyak 300 mL.
Setelah preparasi sampel, juga dilakukan analisis lainnya, seperti analisis protein dengan

metode mikro Kjeldahl, analisis lemak dengan metode sokhlet dengan modifikasi weibull,
analisis asam lemak dengan metode kromatografi gas, dan analisis asam amino dengan
metode Amino Acid Analyser.
Mekanisme pemurnian protein dengan metode elektroforesis memiliki prinsip dimana
protein-protein atau asam nukleat dapat dipisahkan satu dari yang lain atas dasar perbedaan
muatan listrik. Elektroforesis agarase dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat (atau
fragmennya) yang bermuatan negatif sesuai dengan arus listrik. Pada sistem elektroforesis,
agarose merupakan bahan media yang berfungsi sebagai alas/medium pemisah yang
diletakkan antara anode dan katode alat elektroforesis. Protein-protein dapat dipisahkan
berdasarkan berat molekul. Sampel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan
SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu
bermuatan negatif dan protein yang lebih besar mempunyai muatan negatif yang lebih besar.
Kompleks protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub negatif (katoda).
Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein.
Tabel 1 menunjukkan bahwa, bioaktif protein susu kuda mengandung zat bioaktif dengan
berat molekul yang rendah, yaitu antara 14.400 kD (Lisosim) dan 21.000 kD (inhibitor
tripsin). Lisosim memiliki aktivitas antibakterial. Enzim ini berfungsi dalam kaitannya dengan
laktofein dan imuno-globulin A (lgA). Lisosim efektif terhadap Escherischia coli bila bekerja
sama dengan lgA yang juga banyak terdapat pada susu. Dengan demikian, risiko sakit perut
atau diare akibat mengonsumsi susu kuda dapat dikurangi. Kemampuan lisosim dalam
membatasi migrasi neutrofil ke jaringan yang rusak memberikan kemungkinan untuk
menggunakan lisosim sebagai agen antiinflamatori (antiradang). Sedangkan enzim tripsin
yang ada dalam usus dimana fungsinya sebagai pemecah protein akan dihambat oleh faktor
antitripsin agar imunoglobin pelindung tidak akan dipecah oleh tripsin. Keunggulan lain dari
susu kuda adalah terdapatnya aktivitas anti mikroba yang sangat kuat, hal tersebut tidak
ditemukan pada susu sapi.
Susu kuda Sumbawa mempunyai keistimewaan, yaitu tidak mengalami penggumpalan
dan kerusakan meskipun tidak dipasteurisasi dan tanpa diberi bahan pengawet apapun.
Keunikan lainnya, susu ini tahan disimpan pada suhu kamar sampai 5 bulan. Sifat ini
memberi petunjuk bahwa dalam susu kuda Sumbawa terkandung zat yang dapat menghambat
pertumbuhan atau membunuh bakteri yang berupa senyawa antimikroba alami.

VII. KESIMPULAN
7.1 Berdasarkan jurnal yang didapatkan, pemurnian protein dilakukan dengan sampel
berupa susu kuda yang dibawa langsung dari Sumbawa dan susu kuda kemasan
yang beredar di Bogor sebagai pembandingnya.
7.2

Mekanisme pemurnian protein dengan metode elektroforesis didasarkan pada


prinsip perbedaan muatan listrik. Dimana sampel protein denaturasi dan dicampur
dengan SDS dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan
protein yang lebih besar mempunyai muatan negatif yang lebih besar. Kompleks
protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub negatif.

DAFTAR PUSTAKA

Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. 1996. Protein Methods. Ed ke 2. Michigan: WilleyLiss.
Hemes, B.D. 1998. Gel Electrophoresis of proteins. New York: Oxford university
press.
Koolman J, Roehm KH. 2005. Atlas of Biochemistry. Ed ke-2. New York : Thieme.
Lehninger, A.L..1982.Dasar-dasar biokimia Jilid 1.Jakarta: Erlangga
Scopes RK. 1993.

Protein Purification: Principles and Practice. Ed ke-3. New York:

Springer Press.
Westermeier, 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. NewJersey: John Wiley & Sons inc.
Wilson K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry Fifth Edition.
United Kingdom: Cambridge University Press

LAMPIRAN

TUGAS
1. Buat kurva kalibrasi protein standar
Jawaban :
2. Tentukan berat molekul protein sampel yang dianalisis
Jawaban :
PERTANYAAN
1. Jelaskan reaksi pembentukan polimerisasi poliakrilamid dan sebutkan fungsi biakrilamid,
TEMED, amonium persulfat dan merkstoetanol.
Jawaban: Akrilamida dapat membentuk rantai polimer panjang yang dikenal sebagai
poliakrilamida, yang juga karsinogenik. Polimer ini dipakai dalam pengental karena ia
akan membentuk gel bila tercampur dengan air. Dalam laboratorium biokimia,
poliakrilamida dipakai sebagai fase diam dalam elektroforesis gel (PAGE atau SDSPAGE). Ia dipakai pula dalam penanganan limbah cair, pembuatan kertas, pengolahan bijih
besi, dan dalam pembuatan bahan pengepres. Beberapa akrilamida dipakai dalam
pembuatan zat perwarna, atau untuk membentuk monomer lain. Bisakrilamid berfungsi
untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik. TEMED berfungsi sebagai
katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat
digunakan dalam pemisahan protein. Amonium persulfat berfungsi untuk menginduksi
pembentukan monomer bisakrilamid dan polimerisasi akrilamid. Merkstoetanol berfungsi
untuk mereduksi ikatan disulfida yang terdapat pada protein sehingga protein tidak
memiliki struktur tersier maupun sekunder dan akan lebih mudah dipisahkan dalam
analisis elektroforesis.

Gambar 5. Struktur Kimia Poliakrilamida


2. Jelaskan prinsip elektroforesis
Jawaban : Protein yang dipengaruhi oleh pemanasan, sinar ultraviolet, pengocokan yang
kuat (perlakuan mekanik), dan bahan bahan kimia tertentu dapat mengalami denaturasi.

3. Jelaskan bagaimana cara menvisualisasikan protein hasil pemisahan dengan SDS-PAGE


Jawaban : Fraksinasi dengan garam berdasarkan pada sifat-sifat garam seperti kelarutan
dan keefektifannya dalam mengendapkan protein. Garam-garam yang sangat efektif adalah
garam-garam yang mengandung anion yang bermuatan banyak seperti sulfat, fosfat dan
sitrat. Garam yang paling sering digunakan adalah garam amonium sulfat. Amonium sulfat
yang terlarut setelah proses fraksinasi dipisahkan dengan cara dialisis. Prinsip dialisis
adalah difusi garam amonium sulfat melalui membran semipermeabel. Penggunaan
amonium sulfat untuk salting out memiliki keuntungan antara lain harga relative murah,
kelarutannya tinggi, pH larutan tidak berubah secara ekstrem, dan tidak bersifat toksik.
Kerugiannya ialah konsentrasi garam yang tertinggal dalam produk tinggi dan kurang
efisien dalam menghilangkan pencemar.