UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL

CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
PRACTICA N 13
TOMA DE MUESTRAS DE MEDIO AMBIENTE CON EL USO DE EQUIPO SAS
(SURFACE AIR SYSTEM METHOD)
OBJETIVOS

1. Completar la practica anterior:

a. Identifique las caractersticas del crecimiento bacteriano en los medios de cultivo
para bacterias que biodegraden el petrleo. Lectura de caractersticas y coloracin
de Gram.
b. Lectura de pruebas bioqumicas de las bacterias inoculadas (identificacin por
Prueba IMVIC) y otras bioqumicas para descartar, tipos de bacterias e identificar
especficamente cada una.
2. Que el alumno aprenda a conocer las formas para determinar la cantidad de microorganismos
(bacterias y hongos) que pueden estar presentes en el ambiente (aire) de un lugar
determinado y aplicar los mtodos aprendidos para la identificacin de los microorganismos
aislados.
a. Especficamente conocer el mtodo SAS, (Surface Air System Method), para su
aplicacin en el recuento de los microorganismos encontrados en el aire de medio
ambiente, pueden ser aulas laboratorios, centros de comercializacin, salas de
operaciones, etc.
INTRODUCCION
El aire contiene en suspensin diferentes tipos de microorganismos, especialmente bacterias y hongos.
La presencia de uno otro tipo depende del origen, de la direccin e intensidad de las corrientes de aire
y de la supervivencia de microorganismos. Los virus son las formas de vida mas simples , que se
transmiten principalmente a travs del aire.
Estn constituidas nicamente por material gentico: ADN (cido desoxirribomucleico ARN (cido
ribonucleico y una cpside cubierta nucleica. Son parsitos obligados es decir precisan de un husped
para poder reproducirse . La infeccin la llevan a cabo inyectando su material gentico en las clulas del
husped. Una vez en su interior se sirven de la maquinaria biolgica del husped para producir copias de
si mismos hasta lograr su tota recomposicin y en un nmero tal que rompe las membranas celulares
pasando as a infectar nuevas clulas.
La bacterias son organismos ms complejos que los virus y a diferencia de ellos son capaces de vivir en
un medio adecuado, sin la necesidad de un husped para completar su desarrollo. Algunas bacterias
presentan esporas que son resistentes a condiciones adversas, stas pueden resistir aos en diferentes
temperaturas, sequedad, falta de nutrientes , recuperando su estado normal y capacidad infectiva al
entrar en contacto con un medio adecuado para su desarrollo.

Los hongos son formas complejas de vida que presentan una estructura vegetativa denominada Micelio
formado por hifas . La que surge de de la germinacin de sus clulas reproductoras esporas .
Las enfermedades transmitidas por el aire, producidas por bacterias, virus y hongos, son las respiratorias
(neumona, tosferina, tuberculosis, legionelosis, resfriado, gripe), sistmicas (meningitis, sarampin,
varicela, micosis) y alrgicas.
Un bioaerosol es aquello que se encuentra en suspensin en el aire que est o estaba vivo, o es producto
de algo vivo. Ejemplos de bioaerosoles son:
- Virus
- Bacterias
- Esporas de Hongos
- Algas
- Protozoos
- Polen
- caros del polvo
- Escamas de piel / pelo (animales o humanos)
NECESIDAD DEL ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE.
El aire es un vehculo que puede transportar esporas de hongos y tambin bacterias adheridas a partculas
de polvo o contenidas en gotitas microscpicas de lquido (aerosoles). Son los denominados bioaerosoles.
Estos microorganismos pueden alcanzar los alimentos que estn siendo procesados y alterarlos, por lo que
es necesario conocer cul es el nivel de riesgo que se est corriendo para aplicar medidas correctoras si
esto fuese necesario.
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE.
El anlisis microbiolgico del aire puede consistir en un recuento en placa de microorganismos aerobios
mesfilos (nmero de ufc por metro cbico de aire) que puede complementarse con una investigacin de
la presencia de determinados microorganismos patgenos.
Son dos las peculiaridades destacables del anlisis microbiolgico del aire sobre los anlisis de otros
tipos de muestras:

a) Las bacterias viables presentes en el aire suelen estar lesionadas debido a una
deshidratacin notable. Por lo tanto, no es conveniente recoger las muestras de aire sobre
medios selectivos, sino sobre medios que permitan la revivificacin de estos
microorganismos
b) Las tcnicas de toma de muestra son totalmente distintas.
PERMANENCIA
El tiempo que permanecen los microorganismos en el aire depende de la forma, tamao y
peso del microorganismo y de la existencia y potencia de las corrientes areas que los
sostengan y los eleven.
La sedimentacin de los microorganismos por gravedad slo es importante en el aire en
calma.

El impacto que sufren las partculas del aire cuando encuentran un obstculo,es mayor
cuando partculas grandes inciden a altas velocidades hacia objetos pequeos.
El lavado del aire por la lluvia termina rpidamente con el proceso de dispersin,siendo diez veces ms
eficiente que la sedimentacin y la impactacin.
Algunos microorganismos, incluidos bacterias, virus y hongos, son capaces de viajar grandes distancias
sin perder viabilidad.
Va de DISPERSIN muy importante para los microorganismos.
En el EXTERIOR los organismos predominantes son de origen edfico. - En el INTERIOR hay mas
organismos en el ambiente y provienen mayoritariamente del tracto respiratorio humano.
Adaptaciones especiales que favorecen la supervivencia y la dispersin: - ESPORAS
(Xenosporas):
MODOS DE DISPERSION

Corrientes de aire, Vientos Fuertes y hmedos

En aerosols y sprays
POr collision de gotas de lluviasAgua pilverizada
Toses y estornudos

MODOS DE DISPERSION ACTIVA:

Philobus
Esphaerobolus

AIRE en el interior de las construcciones:

Staphylococcus, STREPTOCOCCUS, Penicillium , Alternaria

RECUENTO DE BACTERIAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE AMBIENTES.

Con el uso de SAS (Surface Air System Method), es posible hacer un muestreo del medio ambiente
para poder analizar y ver la cantidad y el tipo de microorganismos presente en un ambiente
determinado.
El principio de SAS es que el aire es aspirado a una velocidad fija a travs de una cubierta con
hoyos, (que es la caracterstica del equipo), que cubre las placas con el medio de cultivo.
El flujo de aire que se crea es laminar y el diseo de la cabeza del equipo SAS es tal que los
microorganismos en el aire son impulsados por la velocidad y son depositados sobre una superficie
de agar de una placa de contacto.
Cada muestra puede ser ajustada para aspirar volmenes variables de aire para permitir un
muestreo del medio ambiente con un amplio rango de microorganismos concentrados.

MUESTREO

Antes de empezar a tomar la muestra con el equipo "SAS " ha de esterilizarse la cubierta del
aparato. sta puede llevarse a cabo por medio del autoclave. Tambin se puede efectuar limpiando
la cubierta del aparato con una solucin desinfectante.
A continuacin se coloca la placa Petri en el lugar indicado del aparato de muestreo. Para manejar
las placas Petri (conteniendo ya el medio de cultivo ) y el muestreador se recomienda hacerlo con
guantes estriles desechables. Despus de cada bloque de toma de muestras, limpiar la cubierta del
muestreador con una solucin desinfectante, teniendo la precaucin de que se haya secado
totalmente antes de tomar una nueva muestra.
Medios de cultivo
Agar Nutritivo
Se utiliza este medio de cultivo para efectuar el contaje de bacterias. Una vez tomada la muestra, se
trasladan las placas Petri al laboratorio, dejndolas en la estufa de cultivo a 37C durante 48 horas.
Agar-Sabouraud
Se utiliza este medio de cultivo para efectuar el contaje de hongos. Una vez tomada la muestra, se
trasladan las placas Petri al laboratorio dejndolas en la estufa de cultivo a 25C durante 5 das.
Recuento de colonias
Pasado el tiempo de incubacin, se observa el crecimiento de las colonias y se procede al recuento
de las mismas mediante un contador de colonias que proporciona el nmero de colonias formadas
por placa.
Este recuento es usado para calcular el nmero de microorganismos por metro cbico de aire.
Promedio de flujo de aire (que capta el equipo SAS es de : 180 litros por minuto
Unidades de aspiracin:
-

Una unidad es igual a 20 segundos con un flujo de 60 litros de aire.

Clculos
-

Una vez determinado el nmero de colonias, y sabiendo el flujo de aire y el tiempo de

muestreo que se ha aplicado, se puede calcular el nmero de unidades formadoras de
colonias por metro cbico de aire, aplicando la frmula siguiente:
siendo:

NC: nmero de colonias por placa

NU: nmero de unidades de tiempo empleadas en el muestreo
Las cpsulas de Petri una vez llevado a cabo el recuento se retiran del laboratorio
empleando un contenedor de residuos biolgicos.

Cuando el n de ufc/m3 hallado sea superior a 500 se recomienda efectuar la identificacin

de los grmenes existentes en el aire muestreado.
En ambientes considerados estriles el n de ufc/m3 debe ser 0.

AISLAMIENTO DE HONGOS DE FUENTES NATURALES.-

Los hongos son microorganismos que se encuentran normalmente en una variedad de hbitats
(suelo, agua, aire, plantas, animales, hombre o sobre cualquier sustancia orgnica en
descomposicin) de acuerdo a las exigencias nutricionales muchos de ellos, es fcil que se adapten
a la vida parasitaria causando enfermedades en las plantas, animales y en el ser humano.
Existen hongos que tiene hbitats especficos: acuticos, fitofilicos, antropofilicos.
METODOS
Prepara los siguientes medios de cultivo.
1. AGAR SABOURAUD GLUCOSADO
Peptona 10 g
Glucosa 40 g

Agar-agar 8 20 g
Agua destilada 1000 mL

2.
Preparacin.- Disolver el agar en agua por ebullicin luego agregar los dems
ingredientes; ajustar el pH 5.6-6.5. Repartir en recipientes adecuados y esterilizar a 121C
por 15 minutos.. Para mejorar el medio se puede agregar 3 a 5 gr. de extracto de levadura
para (1000 ml de agua).
3. AGAR PAPA DEXTROXA (PDA)
Papa 300 g
Agar-agar 20 g
Glucosa 20 g
Agua destilada 1000 mL
4.
Preparacin.- Las papas se cortan en cuadraditos se hierven en 1 litro de agua hasta
su reblandecimiento y desprendimiento de almidn, luego se filtra a travs de varias capas
de gasa. Al filtrado aadir agar y dextrosa, hervir para disolver el agar, enfriar y ajustar el
pH entre 5.6 y 6.5. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
5. AGAR ALMIDON DE ARROZ (AAA)
Arroz 40 g
Agar-agar 18 20 g

Agua destilada 1000 mL

6.
Preparacin.- Hervir el arroz 45 a 60 minutos luego filtrar en un tamiz de algodn
o gasa. Al filtrado agregar el agar, hervir y completar el volumen. A ajustar el pH entre 5.6
y 6.5. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
7. AGAR PAPA ZANAHORIA
Papa 150 g
Agua destilada 1000 mL
Zanahoria 150 g
Agar-agar 20 g
Glucosa 20 g

8.
9.
10. CUESTIONARIO
1. Indicar cual es el nmero aceptable de bacterias y hongos en ambientes cerrados como
hospitales, aulas, y laboratorios.
2. Explique sobre otros mtodos que se usa , para el control de calidad de Aire.
3. Haga una lista de bacterias y hongos presentes en diferentes tipos de ambiente: Aulas,
laboratorios, mercados, hospitales, oficinas y otros y el nmero aceptable de cada uno de ellos.
11.
12.
13.

14. UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA

15. PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL
16. CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
17.
18. PRACTICA N12
19.
20. BIODEGRADACION DE PETROLEO
21. (II PARTE)
22.
23. El petrleo ( "aceite de roca") es una mezcla homognea de compuestos orgnicos,
principalmente hidrocarburos insolubles en agua. Tambin es conocido como petrleo crudo o
simplemente crudo. Se produce en el interior de la Tierra, por transformacin de la materia
orgnica acumulada en sedimentos del pasado geolgico y puede acumularse en trampas
geolgicas naturales, de donde se extrae mediante la perforacin de pozos.
24. En condiciones normales es un lquido bituminoso que puede presentar gran variacin en diversos
parmetros como color y viscosidad (desde amarillentos y poco viscosos como la gasolina hasta
lquidos negros tan viscosos que apenas fluyen. Estas variaciones se deben a la diversidad de
concentraciones de los hidrocarburos que componen la mezcla.
25. Es un recurso natural no renovable y actualmente tambin es la principal fuente de energa en los
pases desarrollados. El petrleo lquido puede presentarse asociado a capas de gas natural, en
yacimientos que han estado enterrados durante millones de aos, cubiertos por los estratos
superiores de la corteza terrestre.
26. El petrleo est formado principalmente por hidrocarburos, que son compuestos de hidrgeno y
carbono, en su mayora parafinas, naftenos y aromticos. Junto con cantidades variables de
derivados saturados homlogos del metano (CH4). Su frmula general
27. El crudo de petrleo se caracteriza por ser un lquido negro, viscoso y con una composicin
qumica sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, bsicamente de la
familia de los hidrocarburos.
28.
29. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la
composicin), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales ms

importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos

ambientales.
30. Adems de hidrocarburos, el petrleo contiene otros compuestos que se encuentran dentro del
grupo de orgnicos, entre los que destacan sulfuros orgnicos, compuestos de nitrgeno y de
oxgeno. Tambin hay trazas de compuestos metlicos, tales como sodio (Na), hierro (Fe), nquel
(Ni), vanadio (V) o plomo (Pb). Asimismo, se pueden encontrar trazas de porfirinas.
31.

32.
33.
34.

35.
36.
37.
38. Biorremediacin del Petrleo usando diversos microorganismos
39.
40. La biorremediacin es la adicin de materiales a ambientes contaminados para
producir una aceleracin del proceso natural de biodegradacin.
41.
42. La elevada complejidad de la composicin del crudo de petrleo y derivados, implica la
existencia de una amplia capacidad enzimtica si se quiere conseguir una degradacin
significativa del crudo.
43.
44. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas
individuales o con la combinacin de diferentes cepas aisladas.
45.
46. En la mayora de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los
componentes ms abundantes del crudo de petrleo. No obstante en algunos casos, estas cepas
tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alqulicas de ciertos HAPs alquilados,
compuestos abundantes en el crudo.
47.
48. La alternativa a la utilizacin de cepas individuales es la obtencin y utilizacin de cultivos
mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos.
49. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinacin de cepas aisladas con
capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre s.
50. Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de
enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminacin y por lo
tanto no son el resultado de una combinacin de cepas previamente aisladas.
51.
52.

53.

54.

55.
56.
57.

58.
59.
60.
61. BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETROLEO
62.
63. Acinetobacter
64. Lactobacillus
65. Actinomyces
66. Leumthrix
67. Alcaligenes
68. Moraxella
69. Arthrobacter
70. Nocardia
71. Bacillus
72. Peptococcus
73. Beneckea
74. Pseudomonas
75. Achrornobacter
76. Sarcina
77. Brevebacterium
78. Spherotilus
79. Coryneformes
80. Spirillum
81. Erwinia
82. Streptomyces
83. Flavobacterium
84. Vibrio
85. Klebsiella
86. Xanthomyces
87.
88.
89.
90. HONGOS DEGRADADORES DE PETROLEO
91.
92. Hongos degradadores de PD
93. Oidiodendrum
94. Allescheria
95. Paecylomyses
96. Aspergillus
97. Phialophora
98. Aureobasidium
99. Penicillium
100.
Botrytis
101.
Rhodosporidium
102.
Candida
103.
Rhodotorula
104.
Cephalosporium
105.
Saccharomyces
106.
Cladosporium
107.
Saccharomycopisis
108.
Cunninghamella
109.
Scopulariopsis
110.
Debaromyces
111.
Sporobolomyces
112.
Fusarium
113.
Torulopsis
114.
Gonytrichum
115.
Trichoderma
116.
Hansenula
117.
Trichosporon
118.
Helmintrosporium
119.
120.
Mucor
121.
122.
123.
124.
La acumulacin de contaminantes genera la dispersin de estos compuestos en el aire, el
suelo, las aguas superficiales, con la consecuente filtracin de los mismos hacia las aguas
subterrneas, que constituyen la reserva de agua para consumo humano.
125.

Cmo se puede solucionar este problema?

126.
Una respuesta a esta pregunta es la remediacin, que consiste en el uso de procesos de
degradacin, biolgicos o qumicos, para eliminar sustancias contaminantes que han sido vertidas
en el medio ambiente.

127.
Microorganismos que limpian el medio ambiente
128.
En sus procesos metablicos, los microorganismos transforman los nutrientes que obtienen del
ambiente en sustancias ms simples, y en este proceso obtienen materia y energa que utilizan
para su subsistencia.
129.
El hombre ha aprendido a aprovechar estos procesos metablicos de los
microorganismos para obtener diferentes productos de utilidad. De esta forma, los
microorganismos que pueden degradar compuestos txicos para el ambiente y convertirlos en
compuestos inocuos o menos txicos, se aprovechan en el proceso de biorremediacin. Existen,
por ejemplo, microorganismos capaces de nutrirse a partir de hidrocarburos, detergentes o
bifenilos policlorados, de manera que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el
medio
ambiente.
La gran diversidad de microorganismos existente ofrece muchos recursos para limpiar el medio
ambiente y, en la actualidad, esta rea est siendo objeto de intensa investigacin. Se han aislado
de la naturaleza varios tipos de microorganismos que consumen vertidos de petrleo y otras
sustancias txicas
130.

Desarrollos actuales y futuros

131.
A continuacin se mencionan algunos de los desarrollos biotecnolgicos que se estn
llevando a cabo para el mejoramiento de los microorganismos empleados en la biorremediacin:
132.133.
Bacterias Pseudomonas transgnicas que son capaces de degradar compuestos txicos

que contienen cloro (como el vinilcloruro) en compuestos menos nocivos.

134.135.
Bacterias capaces de degradar algunos de los componentes del petrleo, con la

perspectiva de llegar a conseguir microorganismos que, liberados en una marea negra, limpien
el agua contaminada.
137.138.
Bacterias capaces de reducir las formas altamente txicas de mercurio en otras menos

txicos y voltiles.
140.141.
Bacterias que transforman metales del suelo en formas menos txicas o insolubles. Por

ejemplo: la reduccin de cromo (Cr).

142.143.
Microorganismos capaces de degradar TNT, un explosivo de gran potencia y muy

agresivo para el entorno.

145.146.
Bacterias que pueden eliminar el azufre de los combustibles fsiles, como en el caso

del carbn o del petrleo, con el fin de favorecer combustiones ms limpias.

148.149.
La utilizacin de la bacteria Deinococcus radiodurans para eliminacin de elementos

radiactivos presentes en el suelo y aguas subterrneas. Este microorganismo es un extremfilo

que resiste condiciones extremas de radiacin, sequedad, agentes oxidantes y diversos
compuestos mutagnicos.
150.151.
Cianobacterias a las que se le han introducido genes de bacterias Pseudomonas con

capacidad de degradar diferentes hidrocarburos o pesticidas.

153.154.
Bacterias transgnicas que se usan para extraer metales valiosos a partir de residuos de

fbricas o de minas, o para eliminar los vertidos de petrleo, o el sulfuro causante de la lluvia
cida que producen las centrales energticas de carbn.
155.
156.
MATERIALES
157.

Placas Petri de Agar BHI con diferentes concentraciones de petrleo.

Asa y porta-asa microbiolgica
Mechero
Pruebas bioqumicas
Coloracin de Gram
Microscopio

158.
159.

PROCEDIMIENTO

Lectura de los caracteres macroscpicos de las colonias de bacterias desarrroladas en la

placa.
Lectura de las caractersticas microscpicas de cada una de las bacterias desarrolladas en
cada medio

160.
161.
162.

EJEMPLO DE RESULTADOS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS

163.

164.
Bac
illus spp

165.

167.
Mo
rfologia

168.
Bac
ilos
cortos,espo
racentral
nodeforma
nte
172.

169.

176.
itivo

177.
itivo

171.
Dis
posicion
175.
Tin
cion
GRAM
179.
Cat
alasa
183.
Cre
cimiento en
caldo
187.
Re
duccin de
NO3
191.
OF
Glucosa
195.
Roj
o Metilo
199.
VP
203.
Hid
rlisi
de

Pos

173.

Pos

166.
Pse
udomona
spp.
170.
Bac
ilos
medianos
no
esporulado
s
174.
Ais
lados
de
ados
178.
Ne
gativo

180.
Pos
itivo
184.
Pel
cula,
turbidez y
crecimiento
188.

181.

189.

182.
Pos
itivo
186.
Pel
cula,
turbidez y
crecimiento
190.

192.

193.

194.

196.

197.

198.

201.
205.

202.
206.

200.
204.

+
+

185.

almidn
207.
Ind
l
211.
Cal
do Glucosa
215.
Cal
do Maltosa
219.
Hid
rlisis
de
gelatina
223.
224.
225.

208.

209.

210.

212.

213.

214.

216.

217.

218.

220.

221.

222.

CUESIONARIO

Haga una relacin de microorganismos con los que se haya trabajado en petrleos en el
Per.
2 Explique que microorganismos se aislaron y cuales sirven para la biorremediacin.
3 Explique sobre otros mtodos que se use para la degradacin de petrleo e indique los
beneficios y desventajas de cada uno de ellos.
4 Explique a que se refiere la accin emulsificante de las bacterias degradadoras de
petrleo.
5 Explique a que se refiere la actividad degradativa de las cepas bacterianas de petrleo.
226.
227.