Penentuan L Asam -Ascorbic di Tomato oleh kapiler elektroforesis

Abstrak
Dalam sebuah laboratorium berperan mahasiswa tingkat akhir bioanalisi, mahasiswa
menggunakan elektroforesis kapiler untuk mengukur L- asam askorbat (vitamin C) dalam sampel
makanan. Para mahasiswa bertugas untuk mempersiapkan standar, untuk mendapatkan kurva
kalibrasi, dan untuk menentukan kuantitas atau jumlah kadar L- asam askorbat komponen alat
elektroforesis kapiler, pengaruh variabel eksperimental, dan penggunaan strategi kalibrasi yang
berbeda juga diberikan. Percobaan telah diuji selama empat program, menunjukkan bahwa
kegiatan laboratorium membantu siswa belajar teknik instrumental.
KATA KUNCI: Kedua-Tahun Sarjana, analisis kimia, Instruksi Laboratorium, pembelajaran /
Manipulatif, Elektroforesis, Ilmu Pangan, Peralatan Laboratorium / Aparatur, Spektroskopi UV Vis, Vitamin
Pendahuluan
Kegiatan laboratorium memiliki peran yang relevan dalam Kurikulum ilmu, tetapi
keinginan atau pilihan hati dalam percobaan adalah penting untuk mendorong partisipasi dan
belajar siswa. Perhatian khusus diperlukan untuk berperan dalam percobaan karena hal tersebut
memakan waktu, mahal, dan mungkin terlibat siswa tidak akif. Solusinya adalah sebuah model
tipe pembelajaran penyeidikan dan metode analisis yang memenuhi syarat sehingga siswa dapat
mengembangkan kemampuan dan keterampilan seperti mengajukan pertanyaan yang berorientasi
ilmiah, membentuk hipotesis, merancang dan melakukan investigasi, merumuskan dan merevisi
penjelasan kimia, dan berkomunikasi dan membela argumen ilmiah.Hanya metodologi
instrument yang termasuk berperan paling berguna dalam sarjana kegiatan laboratorium untuk
mempersiapkan siswa untuk kehidupan mereka yang profesional.Contohnya adalah
elektroforesis kapiler (CE), yang penggunaannya telah meningkat dalam sepuluh tahun terakhir
di industri dan laboratorium penelitian.Percobaan berdasarkan CE telah diperkenalkan di
laboratorium sarjana untuk pemisahan obat,komponen dari minuman ringan, ion-ion dalam air,
pengawet makanan,dan asam benzoat.Sebuah review yang sangat baik dari metode CE dalam
percobaan sarjana telah baru-baru ini diterbitkan dalam jurnal ini.sebuah percobaan CE telah
dirancang untuk laboratorium para sarjana berdasarkan kriteria berikut. Pertama, siswa akan
mampu mewujudkan pengalaman mereka untuk karir profesional di masa depan, jika mereka
memahami analisis protokol. Kedua, analisis harus meliputi kegiatan mempromosikan
pembelajaran yang signifikan dari variabel yang paling penting dan efeknya dalam pemisahan
elektroforesis. Ketiga, motivasi mahasiswa tingkat akhir meningkat ketika sampel nyata
dianalisis,tetapi mahasiswa juga harus diingatkan akan pentingnya pretreatment darisampel.
Penentuan L asam askorbat atau vitamin C adalah dipilih sebagai contoh percobaan
instruktif. ini merupakan senyawa penting dalam proses fisiologis seperti metabolisme besi dan
sintesis kolagen. Studi bioteknologi telah dilakukan untuk meningkatkan kandungan L- asam

askorbat dalam sayuran dan buah-buahan, meningkatkan mereka nilai gizi. Namun, pemilihan
varietas yang cocok membutuhkan hasil yang akurat dari ratusan sampel. Selain itu, beberapa
metode CE telah dijelaskan untuk penentuan asam L-asam askorbat secara rutin di jus buah,
makanan,dan sayuran menggunakan absorbansi atau deteksi elektrokimia.Mereka telah
menunjukkan bahwa CE adalah pemisahan dengan teknik yang kuat yang mana memiliki
keuntungan menjadi sederhana, cepat, sangat efisien, dan selektif.Kegiatan didasarkan pada
prosedur ini diusulkan untuk berperan mahasiswa bioanalisis di laboratorium instrumen.Mereka
termasuk "diskusi berhenti" saat, Penyelidikan pemisahan variabel CE,penggunaan standar
internal (phthalate) diperbaiki untuk mode kalibrasi, dan penentuan asam L- asam askorbat
diterapkan dalam sampel makanan mengandung tomat (buah Lycopersicon).
Prosedur Percobaan
Pendahuluan
Instrumentasi, reagen, dan kalibrasi protokel,sampel pengobatan, CE-pemisahaan mereka
dijelaskan dalam informasi yang mendukung yang berisi instruksi untuk siswa dan instruktur.
Secara singkat, ekstrak L-asam askorbat dari beberapa sampel tomat dengan larutan asam fosfat
2%. ekstrak disentrifugasi dan disaring untuk menghilangkan gangguan dan dipindahkan ke
botol dengan larutan standar phthalate untuk penentuan dengan metode CE. Injeksi hidrodinamik
pada 1 psi dan digunakan 5 s. Pemisahan dilakukan pada -20 kV dan pada suhu25 C dengan
400 mM borat pada pH 8, dengan hexadimethrine 0,01% bromida sebagai larutan penyangga.
Analisis dilakukan dengan menggunakan detektor UV-VIS yang memungkinkan identifikasi dan
kuantifikasi analit dan standar internal.Kurva kalibrasi diperoleh dari solusi standar yang telah
disiapkan oleh mahasiswa.
Peserta/Mahasiswa
Metodologi yang diusulkan telah diuji dengan siswatahun kedua di laboratorium instrument
bioanalisis.Percobaan dilaboratorium dirancang untuk satu kelompok terdiri dari empat
mahasiswa, tetapi dianjurkan ukuran kelompok yang lebih kecil. Waktu percobaan
dilaboratorium adalah 3 jam. Mahasiswa data eksperimen dan hasil dari end-of-kursus survei
dianalisis untuk empat program akademik tahun (2007-2011).

BAHAYA
Asam fosfat adalah bersifat korosit dengan kulit, hexadimethrine bromida adalah
berbahaya jika tertelan, dan natrium tetraborat menunjukkan repro- toksisitas yang produktif.
Siswa bekerja dengan solusi diencerkan dahulu larutan dari reaktan berbahaya, mengenakan jas
lab, sarung tangan pelindung, dan perlindungan mata. Membuang limbah yang dibagikan dalam
wadah, mengikuti pedoman dari limbah berbahaya laboratorium pengelolaan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dirancang untuk menggabungkan berbagai analisis pertimbangan dan
beberapa pengalaman belajar-mengajar. Siswa diberi petunjuk laboratorium termasuk
Pengenalan bagian sebagai bacaan pre lab, tujuan pembelajaran, dan protokol eksperimental.
Aktivitas lab awal siswa adalah persiapan L -ascorbate dan phthalate standar dalam buffer borat
dan pengukuran ini solusi dengan spektrofotometri UV-vis.

Sebuah diskusi yang digagas tentang modus deteksi di Instrumen CE. Dalam kasus satupanjang gelombang deteksi, siswa memahami pentingnya memilih yang memadai yang
disebabkan oleh gelombang panjang untuk mendaftar elektroforegram tersebut. Hal ini layak
untuk menyebutkan bahwa phthalate menunjukkan absorbansi rendah pada deteksi terbaik
panjang gelombang L -ascorbate. Namun demikian, phthalate adalah cocok standar internal yang
diberikan sifat-sifatnya, seperti rendah-biaya, waktu stabilitas, dan struktur kimia yang mirip
dengan analit (yaitu, kelarutan, mobilitas elektroforesis). Dalam kasus dioda-array deteksi,
perbedaan antara profil penyerapan yang belajar untuk kemudahan identifikasi puncak CE
terhadap Kehadiran gangguan lainnya. Akhirnya, instruktur menekankan peran larutan
penyangga dalam profil penyerapan sebagai maksimum band askorbat digeser ke 256 nm di
larutan asam. Sebuah demonstrasi singkat dari instrumen CE adalah dilengkapi dengan protokol
tertentu untuk menggunakan instrumen perangkat lunak. Siswa bertanggung jawab dari
pemrograman injeksi, pemisahan, dan metode deteksi, dan mengendalikan akuisisi data yang
benar dari campuran standar. Itu pengguna laboratorium termasuk pertanyaan difokuskan pada
prinsip-prinsip dasar dari teknik dan praktis aplikasi. Nilai-nilai sastra untuk konstanta keasaman
dan massa molar dari kedua molekul (asam askorbat, p K a1 = 4.10; p K a2 = 11,80; M = 176 g /
mol dan asam ftalat, p K a1 = 2.76; p K a2 = 5,41; M = 166 g / mol) juga diberikan di manual
lab. Tujuannya adalah untuk mempromosikan diskusi tentang diharapkan elektroforegram dari
pemisahan CE berdasarkan kimia norma. Para siswa menyimpulkan bahwa campuran adalah
dipisahkan menurut biaya-to-mass ratio dan menyediakan mereka hipotesis tentang urutan elusi.
elecrophoretic yang mobilitas standar internal yang lebih tinggi dan siswa memperkirakan
migrasi yang lebih cepat ke arah anoda dibandingkan dengan analit. Pesanan ini diamati dalam
elektroforegram ditampilkan di Gambar 2A .

Identifikasi puncak secara eksperimental dibuktikan membandingkan dengan profil spektral

setiap molekul menggunakan deteksi diode-array. Kegiatan berikutnya adalah sebuah kuis lisan
tentang variabel eksperimental dan pengaruh mereka pada pemisahan CE. Faktor-faktor seperti
modus injeksi, ukuran sampel, tegangan, kapiler panjang, suhu, pH, atau penyangga konsentrasi
yang dibahas. Dalam konsultasi dengan instruktur, hipotetis elektroforegram tertarik untuk setiap
situasi eksperimental. Kegiatan ini diperkuat pengetahuan siswa spesifik ini teknik instrumental
dan menekankan pentingnya kimia norma dalam pemilihan metode analisis yang sesuai. Saya t
juga memungkinkan pembelajaran terus menerus bahkan selama operasi interval instrumen,
meningkatkan efisiensi penggunaan waktu. Dalam kegiatan berikutnya, campuran standar
dengan yang berbeda konsentrasi asam -ascorbic L, disiapkan oleh siswa, yang disuntikkan ke
CE untuk mendapatkan kurva kalibrasi. Meskipun, sebuah pemrosesan otomatis mungkin, lebih
disukai bahwa siswa dilatih dalam akuisisi dan data pengobatan. Efek dari parameter integrasi
(threshold, lebar puncak minimum, dll) dievaluasi. Sebuah diskusi dilakukan tentang seleksi dari
tinggi puncak (h, dalam satuan relatif absorbansi) dan daerah puncak (A, dalam satuan cm 2)
sebagai variabel analitis untuk kalibrasi konsentrasi askorbat (c, dalam satuan g / mL). Di bawah
dijelaskan kondisi eksperimental, kurva kalibrasi siswa h = (-239 70) + (58 7) c dengan R 2>
0,991 dan A = (-122 50) + (78 7) c dengan R 2> 0,996, masing-masing. Selain itu, kalibrasi
langsung dibandingkan dengan kalibrasi menggunakan dikoreksi sinyal dengan respon baku
internal (phthalate). Di sekitar 10% dari pemisahan, standar internal diperlukan untuk
memperbaiki kesalahan selama persiapan solusi oleh siswa, yaitu, mengisi termos atau selama
injeksi dalam instrumen CE. Perbandingan ini menunjukkan manfaat dari alat yang ampuh untuk
meminimalkan kesalahan eksperimental. Pada bagian pembahasan laporan mereka, siswa
terdaftar keuntungan dan keterbatasan dari kalibrasi berdasarkan intern standar dalam analisis
rutin. Angka-angka yang khas merit diperoleh untuk kelompok siswa yang berbeda ditunjukkan
pada Tabel 1. Parameter yang sangat baik diperoleh di semua program. Gambar 1. Spektrum UVvis larutan standar (10 mg / L untuk L - askorbat dan 20 mg / L untuk phthalate) di 400 mM borat
penyangga (pH = 8). Kegiatan selanjutnya adalah penentuan asam askorbat dalam makanan
dengan tomat. Aplikasi untuk produk komersial membantu merangsang minat siswa dan
mengajarkan pertimbangan tambahan diperlukan dalam analisis dunia nyata. 9 Sampel
pretreatment adalah berdasarkan homogenisasi, meremas, sentrifugasi, dan penyaringan. Asam

fosfat ditambahkan untuk menghindari degradasi L asam -ascorbic selama percobaan. Siswa
belajar tentang pentingnya homogenisasi dan penghapusan gangguan untuk mendapatkan hasil
yang representatif dan akurat karena sampel secara langsung disuntikkan dalam instrumen untuk
memperoleh hasil. Pengaruh matriks makanan juga dievaluasi karena sampel yang berbeda
(buah-buahan, jus, dan sup) yang bekerja (Gambar 2B -F). Setelah pemisahan CE, identifikasi
puncak didasarkan pada waktu migrasi dari standar internal dan analit dan dikonfirmasi oleh
spektrum UV yang terdaftar di puncak (detektor multiwavelength). Siswa benar ditugaskan
puncak di electropherograms sampel diekstraksi, bahkan Kehadiran gangguan, karena mereka
menerapkan strategi dibahas dalam kegiatan laboratorium awal. Pada titik ini, kelanjutan dari
diskusi tentang pemilihan phthalate sebagai standar internal yang akan bermanfaat. Instruktur
bisa menunjukkan bahwa koreksi handal kesalahan eksperimental hanya tercapai karena adanya
phthalate dalam sampel tomat, ekstraksi lengkap dengan protokol pengobatan yang diusulkan,
dan waktu migrasi penutupan di pemisahan elektroforesis. Kandungan asam askorbat dalam
sampel berkisar antara 0,7 dan 34,0 mg / g sampel. Ulangan yang sangat mirip dengan kesalahan
relatif kurang dari 10%. Delapan puluh tujuh persen dari siswa Hasil penelitian menunjukkan
kesepakatan yang sangat baik dengan nilai-nilai dari eksperimen instruktur. Siswa secara khusus
diminta untuk menggunakan unit konsentrasi yang benar dan untuk mengekspresikan hasil
mereka menurut kesalahan eksperimental (angka penting). Bagian dari tugas postlab, siswa
menyerahkan laporan ilmiah tentang penyelesaian percobaan termasuk beberapa pertanyaan di
memesan untuk mengevaluasi pengetahuan mereka tentang teknik CE dan penerapannya.
PERSEPSI MAHASISWA
Data dikumpulkan melalui observasi dan survei menunjukkan bahwa percobaan
memuaskan diterima oleh siswa. Siswa Survei opini dilakukan untuk masing-masing kelompok
di 5 minu (18- 20 kelompok tahun), termasuk pertanyaan Likert skala dan pertanyaan terbuka .
Dalam empat program, mayoritas siswa menunjukkan bahwa Percobaan membantu mereka
belajar teknik CE (83 5% dipilih setuju atau sangat setuju opsi). Mereka juga menunjukkan
bahwa percobaan dilakukan dengan waktu yang cukup distribusi (70 10%), tingkat kesulitan
(81 8%), dan Strategi dinamis (78 6%). Dalam pertanyaan terbuka, yang siswa ditunjukkan
percobaan menekankan aspek praktis di pemisahan CE dan pentingnya metode berperan
dalam biotek-laboratorium rutin.
KESIMPULAN
Pengalaman mengajar harus menunjukkan efektivitas dalam kelas, keuntungan untuk
mencapai hasil belajar, dan kuncinya poin untuk aplikasi mereka dalam mata pelajaran lain. yang
diusulkan Percobaan telah diuji selama empat tahun dan bekerja dengan baik setiap saat. Ini
menggambarkan beberapa konsep penting dan menyelesaikan beberapa tujuan instruksional dari
sarjana laboratorium analisis instrumental. Siswa mengkonsolidasikan teori yang mereka pelajari
di perkuliahan selama sesi laboratorium. Sepanjang kegiatan, siswa diingatkan akan pentingnya
sifat kimia analit dan bagaimana ini berkaitan dengan analisis (waktu migrasi, UV-spektrum).
Praktis pertimbangan instrumen CE, protokol, dan sampel aplikasi ditekankan. "Berhenti dan

mendiskusikan" momen memungkinkan pemanfaatan waktu sambil menunggu instrumen

tanggapan. Siswa mendiskusikan dan mengantisipasi hasil, serta mereka mampu untuk
menyimpulkan kemampuan dan keterbatasan Gambar 2. Electropherograms pada 265 nm
menunjukkan phthalate puncak (1) dan puncak L -ascorbate (2): (A) larutan campuran standar
dengan 100 mg / L L -ascorbate; (B) sampel sup tomat; (C dan D) sampel jus tomat; dan (E dan
F) buah tomat. Tabel 1. Angka Analytical of Merit dalam Kegiatan Kalibrasi Dihitung dari data
Laporan kuliah mahasiswa