Histotecnologa I

Fijacin Tisular
Fijacin: su propsito es mantener la morfologa del tejido lo mas parecida
posible a la que este tenia antes de hacer la extraccin o interrumpir los
procesos de degradacin que aparecen tras la muerte celular, tratando de
conservar la arquitectura y composicin tisular; es decir, con este paso se
evita la alteracin del tejido lo que permite poder estudiarlo al microscopio
como si estuviera vivo. La fijacin puede ser de dos tipos: fijacin
qumica y fijacin fsica.
El fijador tiene un coeficiente de penetracin en el tejido: entonces a
mayor tamao del tejido, mayor ser el tiempo de fijacin y mayor la cantidad
de fijador utilizado; sin embargo hay que tener en cuenta que los trozos o
fragmentos de tejido que se manipulan
deben ser preferiblemente
pequeos, no solo porque disminuye el tiempo de fijacin, sino porque el
fijador penetra mas rpido al tejido logrando mantener la morfologa normal.
Las cualidades que debe tener un fijador son:

La manera de actuar los fijadores varia con la composicin o naturaleza

de los mismos: coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol,
cido pcrico, yodo), formando combinaciones qumicas con las sustancias
orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las
mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido
osmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
Existen muchos tipos de fijadores, como Cloruro de mercurio (Hg2Cl2),
cido pcrico (C6H2OH(NO2)3), Bouin (mezcla de cido Pcricoformaldehdo- cido Actico), Zenker (mezcla de Dicromato de Potasio y
Cloruro de Mercurio), Carnoy (mezcla de Alcohol- Cloroformo-cido Actico),
Formaldehdo (disolucin de formol en solucin salina, al 10% con otras
mmm
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Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que

aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autolisis y putrefaccin).
Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta
en las capas profundas de la pieza a fijar.
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo
la morfologa celular y tisular; impidiendo una distorsin celular significativo,
previniendo la difusin (movimiento) de las sustancias intra y extracelulares,
desnaturalizando (cambiando) las enzimas lisosomales (organelo) que
tienden a hidrolizar (degradar) los constituyentes celulares (organelas)
Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su
observacin ulterior (ejecucin de cortes y fijacin).
Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o
despus de ella.
No provoca o impide la produccin de estructuras artificiales.
No retrae excesivamente los tejidos, ni volverlos friables o quebradizos.
Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefaccin

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sustancias qumicas y amortiguadores (Buffers)).

El formaldehdo es el medio de fijacin ms empleado, debido a que
establece enlaces cruzados (efecto conocido como cross-linking o formacin
de puentes cruzados) entre los aminocidos de molculas adyacentes; estos
enlaces covalentes estabilizan las interacciones con las protenas
reaccionando con los grupos amino, carboxilo e indol de las protenas, y
produce entonces uniones de metileno no solo dentro de una misma protena
sino que adems lo hace con otras molculas proteicas adyacentes como
los cidos nucleicos. Este fenmeno sigue ocurriendo a lo largo del tiempo y
deteriora progresivamente la estructura molecular de los tejidos, en especial
de las protenas, dificultando el acceso de los anticuerpos hacia sus epitopes
blanco, fenmeno usualmente conocido como enmascaramiento antignico.
Esto es reversible en un comienzo a travs de una corta digestin enzimtica
de las protenas o con microondeado, que rompen parte de los puentes
cruzados entre las protenas.
Si la fijacin se prolonga a lo largo del tiempo ms all de las 36 horas
comienzan los fenmenos de sobrefijacin que son progresivamente
irreversibles. Por otra parte el formaldehdo reacciona con los hidratos de
carbono formando hemiacetales inestables que pueden ser eliminados por
lavado prolongado. Esto puede explicar porqu los epitopes ricos en
polisacridos son generalmente resistentes a la fijacin en formol.
El
formaldehdo, establece enlaces covalentes entre aminocidos
(especialmente con la lisina), de molculas adyacentes, estabilizando las
interacciones entre protenas y entre estas y los cidos nucleicos. El
formaldehdo no reacciona con los lpidos y, por lo tanto, es un mal fijador de
las membranas. El formaldehdo preserva un mayor nmero de estructuras
requiere un perodo de fijacin relativamente corto y puede ser usado para
almacenamiento de muestras a largo plazo, penetra rpida y regularmente
sin producir endurecimiento del tejido.

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Para conservar los lpidos neutros, como los de las clulas adiposas,
deben utilizarse cortes de congelacin de tejido fijado en formalina y
colorantes que se disuelven en las grasas: para conservar estructuras de la
membrana hay que usar fijadores especiales como metales pesados, por
ejemplo permanganato y osmio, que se unen a los fospolpidos. El empleo
de rutina de Tetrxido de osmio como fijador en la microscopia electrnica es
la razn principal del excelente estado conservacin de las membranas en
las fotomicrografas electrnicas.
Recuerda: el formol solo no es recomendable como un agente fijador,
dando a los artefactos que ocasiona. Debe ser preparado al 10% neutro o
tamponado. El formaldehdo no buferado con pH bajo (cido, debido al
cido frmico diluido) puede producir depsitos en el tejido de
pigmento de formalina que al mezclarse con la sangre produce un
precipitado (hematena cida).
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Composicin qumica de las muestras histolgicas:

Los componentes que perduran tras la fijacin son principalmente
molculas grandes que no se disuelven con facilidad, en especial despus
de aplicar el fijador. Estas molculas grandes, en particular las que forman
complejos
con
otras
semejantes
para
producir
compuestos
macromoleculares son las que mejor se conservan en un corte histolgico.
Los siguientes son ejemplos de estos grandes complejos macromoleculares:
Nucleoprotenas, formadas por cidos nucleicos unidos a protenas.
Protenas intracelulares del citoesqueleto en complejo con otras
protenas.
Protenas extracelulares en grandes aglomeraciones insolubles, en
donde molculas vecinas similares se unen a travs de enlaces
cruzados, como ocurre en la formacin de las fibras colgenas.
A pesar de que los cidos nucleicos, las protenas y los fosfolpidos en su
mayora se conservan
en los cortes histolgicos, tambin muchos se
pierden. Las protenas y los acido nucleicos pequeos, como los ARN de
transferencia, en general se pierden durante la preparacin del tejido.
Tambin pueden perderse molculas
grandes, por ejemplo, al ser
hidrolizadas como consecuencia del pH desfavorable de las soluciones
fijadoras. Ejemplos de macromolculas que se pierden durante la fijacin de
rutina en fijadores acuosos:

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Glicgeno, carbohidrato de almacenamiento intracelular comn en el

hgado y las clulas musculares.
Proteoglucanos y glucosaminoglucanos (carbohidratos complejos
extracelulares hallados en el tejido conjuntivo)
Estas molculas, sin embargo, pueden conservarse si se utilizan fijadores
no acuoso para el glicgeno o si a soluciones fijadoras se le aaden agentes
ligadores especiales que preserven las molculas extracelulares ricas en
carbohidratos.

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