EFECTOS DE ULTRASONIDO DE BAJA FRECUENCIA EN ALGUNAS PROPIEDADES DE

FIBRINGENO Y SU PLASMOLISIS
Eugene A Cherniavsky1, Igor S Strakha1, Igor E Adzerikho2 and Vladimir M
Shkumatov1*
ABSTRACTO
FONDO
La trombolisis farmacolgica con estreptoquinasa, uroquinasa o activador tisular del
plasmingeno (t-PA), y las intervenciones mecnicas son utilizadas con frecuencia en
el tratamiento tanto arterial y venoso de enfermedades trombticas. Se ha informado
anteriormente de que la aplicacin de ultrasonidos como un adjunto a la terapia
tromboltica ofrece un potencial nico para mejorar la eficacia. Sin embargo, se sabe
poco sobre los efectos de los ultrasonidos en las protenas de la coagulacin
sangunea y la fibrinolisis. A continuacin, se investigaron los efectos de los
ultrasonidos sobre el fibringeno en los procesos de coagulacin y fibrinogenolisis en
un sistema in vitro.
RESULTADOS
Nuestro estudio demostr que la baja frecuencia de ultrasonido de alta intensidad de
pulso (25,1 kHz, 48,4 W / cm2, de trabajo del 50%) induce a la desnaturalizacin de
plasmingeno y t-PA y fibringeno agregados formacin in vitro. Los agregados se
caracterizan por la prdida de la capacidad de coagulacin y una mayor tasa de
plasminolisis de fibringeno nativo. Investigamos el efecto de los ultrasonidos en las
protenas individuales. En caso de plasmingeno y t-PA, el ultrasonido condujo a una
disminucin de la tasa de fibrinogenolisis, mientras que aument la tasa de
fibrinogenolisis en caso de fibringeno. Se ha demostrado que el tratamiento en
ultrasonido de fibringeno o fibrina mezcla con el plasmingeno, t-PA, o ambos, la
velocidad de la digestin proteoltica de fibrina (fibringeno) aumenta tambin. Se ha
demostrado que el efecto global sobre la degradacin de la fibrina (fibringeno)
proteoltica en las condiciones para el tratamiento de ultrasonido combinado se
determina exclusivamente por el efecto sobre la fibrina (fibringeno).
CONCLUSIONES
Los datos presentados aqu sugieren que entre las protenas del sistema fibrinoltico,
el fibringeno es una de las protenas ms sensibles a la accin de los ultrasonidos.
Se ha demostrado in vitro que el ultrasonido induce la formacin de agregados de
fibringeno, caracterizado por la prdida de la capacidad de coagulacin y una mayor
tasa de plasminolisis de fibringeno nativo en diferentes sistemas modelo y bajo
diferentes modos de tratamiento de ultrasonido. Bajo tratamiento con ultrasonidos de
plasmingeno y / o t-PA en presencia de fibrina (fibringeno) el efecto estabilizante
de la fibrina (fibringeno) sobre las protenas que se dio fue mostrado. Por otra parte,
se observ un aumento en la tasa de lisis de fibrina (fibringeno), debido tanto a la
modificacin de la estructura del sustrato y la promocin de la formacin de
complejos de protena-protena.
FONDO
Trombosis en el sistema cardiovascular es una de las principales causas de
mortalidad y morbilidad en el mundo.Las trombolisis farmacolgicas usando
estreptoquinasa, uroquinasa o activador tisular del plasmingeno (t-PA) y las
intervenciones mecnicas se emplean con frecuencia para tratar tanto arterial y

enfermedades trombticas venosas. Desafortunadamente, la reperfusin no siempre

se consigue y el xito de la terapia est limitada por la reoclusin [1]. Las
limitaciones a estos enfoques tambin incluyen complicaciones como sangrado,
derrame cerebral, cogulos de embolizacin y dao de la pared vascular [2]. Iniciales
estudios in vitro de los pacientes indica que la aplicacin de ultrasonidos (US) como
un adjunto a tromboltico terapia ofrece un potencial nico para mejorar la eficacia y
disminuir las complicaciones hemorrgicas. Cuatro enfoques bsicos para la
tromblisis por ultrasonidos han sido perseguidos - dos sin agentes farmacolgicos:
1) ultrasonido transductor externo catter-liberado
2) ultrasonido externo de HIFU transcutnea- liberado sin la administracin de
frmacos y de los ultrasonidos en relacin con las drogas y / o microburbujas
trombolticos u otros agentes
3) ultrasonido transductor de punta catter liberado de con administracin local de
frmacos
4) ultrasonido de baja frecuencia transcutnea-liberado con (intravenosa) de
suministro de frmaco concomitante sistmica para el sitio de aumento de
ultrasonido especficos
Basado en la informacin disponible, se han sugerido los mecanismos implicados en
el proceso fibrinoltico en alta frecuencia mejorada por ultrasonido de baja intensidad
fibrinlisis [15] para ser no [16] especficos de drogas, para no alterar los tamaos de
derivados plasmticos o degradacin productos [17] y no para ser causado por la
ruptura de cogulos [16]. El ultrasonido con una frecuencia de 1 MHz y las
intensidades de 2.5-3.1 W / cm2 ha tenido un impacto estadsticamente significativas
en la actividad biolgica de los activadores del plasmingeno: uroquinasa,
estreptoquinasa, alteplasa y reteplasa [18]. Existe una informacin limitada sobre el
efecto potencial de los ultrasonido sobre las protenas. Se ha demostrado que la alta
frecuencia (1 MHz) US con una intensidad de 6,92 W / cm2 caus cambios en el orden
estructural de citocromo c, lisozima, mioglobina, albmina de suero bovino,
tripsingeno y -quimotripsingeno A [19]. A baja intensidad de US acelera la
trombolisis enzimtica a travs de mecanismos no trmicos, que comprenden la
mejora en el transporte de drogas [8, 20], de forma reversible la alteracin de la
estructura de fibrina [1, 20] y el aumento de t-PA de unin a la fibrina [1]. Estudios
recientes indican que los ultrasonido a frecuencias ms bajas en el intervalo de 20 a
40 kHz y el modo de impulso con ciclos de trabajo de 1 a 50% tiene un efecto mayor
en la trombolisis con penetracin en el tejido mejorada y un menor calentamiento [1,
11, 21]. Alta intensidad de ultrasonidos interrumpe la formacin de cogulos en
pequeos fragmentos sin la administracin del activador de plasmingeno [1, 13]. El
principal mecanismo por el cual la lisis por ultrasonidos de trombos se produce se
denomina el "efecto de cavitacin." Durante la fase negativa de la forma de la onda
ultrasnica, las microburbujas (o cavidades) dentro del tejido expuesto a la fuente de
sonido. Durante la fase positiva de la onda, estos cavitaciones colapso, dando lugar a
una serie de ondas de choque que conducen a la interrupcin y la fragmentacin. Sin
embargo, a pesar de la eficacia documentada, an ms la aplicacin clnica de la
angioplastia de ultrasonido est restringido por la iniciacin de la embolizacin distal

de los escombros cogulo resultante [14]. Nuestro estudio demostr que

anteriormente en las condiciones de una cavitacin accin combinada y la
estreptoquinasa a altas intensidades de los ultrasonido, estreptoquinasa la
prevencin de la formacin de grandes conglomerados de escombros cogulo [22].
En base a esto, se supone que el uso de baja frecuencia (20-40 kHz) impulso (ciclo de
trabajo 1-50%) de intensidad leve (10-50 W / cm2) de ultrasonido en combinacin
con frmacos trombolticos har posible disminuir la riesgo de desarrollo de efectos
secundarios. La eficacia de este enfoque ha sido confirmada por nuestro estudio en
animales .
Con un nmero descrito anteriormente de mecanismos de destruccin de trombos
ultrasonido y fibrinlisis mejorada de ultrasonido mecanismos adicionales pueden
subyacer los efectos de anlisis de tromblisis de ultrasonido de los productos de la
destruccin del cogulo de plasma por el ultrasonido de baja frecuencia (27 kHz)
mostraron que a las intensidades de los ultrasonido por debajo 21,6 W / cm2, no hubo
extraccin de protenas de suero sanguneos situados en los poros de la red de
fibrina. El aumento de la intensidad del tratamiento ultrasnico se acompa de
protofibrillas desagregacin y la extraccin de las protenas del suero sanguneos
situados en el interior de las fibras de fibrina. Las protenas extradas del cogulo de
plasma se sometieron a la agregacin posterior, mientras que la interaccin entre
protofibrillas caus la formacin de partculas insolubles de fibrina [24]. Por lo tanto,
baja frecuencia y alta intensidad de ultrasonido junto con los trastornos macroscpica
del cogulo puede afectar a las propiedades estructurales-funcionales de las
protenas.
Se ha demostrado previamente que el uso de baja frecuencia de ultrasonido (26 kHz)
con una intensidad de hasta 15 W / cm2 no influye en las propiedades de la
estreptoquinasa y la antitrombina III. En los ultrasonido intensidad superior a 26 W /
cm2, estreptoquinasa activador del plasmingeno se somete a la agregacin
irreversible con el despliegue de la molcula de protena y la exposicin de nuevos
enlaces peptdicos susceptibles de ataque proteoltico por la plasmina [25]. El
objetivo de los estudios fue investigar los efectos de la baja frecuencia de impulsos
de alta intensidad de ultrasonido (25,1 kHz, 48,4 W / cm2, de trabajo del 50%) en la
protena clave de la coagulacin de la sangre - fibringeno, as como para investigar
los efectos de los US. en la fibrinlisis en un sistema in vitro. Se ha demostrado que el
ultrasonido inducida formacin dependiente del tiempo de los agregados de
fibringeno, que se caracteriza por la prdida de la capacidad de coagulacin y una
mayor tasa de plasminolisis de fibringeno nativo y la desnaturalizacin de
plasmingeno y t-PA. Bajo tratamiento de ultrasonido de plasmingeno y / o t-PA en
presencia de fibrina (fibringeno), se demostr el efecto estabilizador de fibrina
(fibringeno) sobre las protenas dadas. Por otra parte, se observ un aumento en la
tasa de lisis de fibrina (fibringeno), debido tanto a la modificacin de la estructura
del sustrato y la promocin de la formacin de complejos de protena-protena. Los
estudios en esta direccin son versan sobre la cuestin clave de cmo reducir al
mnimo los efectos secundarios e incrementar la eficacia de la trombolisis ultrasnica.

FIBRINOGENOLISIS
Fibrinogenlisis se llev a cabo en tampn de fosfato de sodio 0,05 M, que contiene
0,15 M de NaCl a pH 7,4. La protelisis se inici por adicin de 150 l de plasmingeno
(2 m / ml) y t-PA (0,2 mg / ml) a 15 ml de la solucin de fibringeno (3 mg / ml). A
continuacin, la mezcla de digestin se incub a 37 C y se recogieron muestras
despus de ciertos intervalos de tiempo para SDS-PAGE y la determinacin del
anlisis de pptidos solubles en TCA.
FIBRINLISIS
PREPARACIN DE COGULOS
El cogulo de fibrina se prepar por adicin de 300 l de 1 M de CaCl2 y 1.5 ml de
solucin de trombina (25 unidades / ml en 0,05 M Tris-HCl, 0,5 M de NaCl a pH 7,4) a
15 ml de solucin de fibringeno (3 mg / ml en el mismo tampn). La mezcla final se
incub durante 2 horas a 37 C. El cogulo resultante se sec entre las dos hojas de
papel de filtro.
LA LISIS DEL COGULO
El cogulo se coloc en el tubo de polipropileno con tampn, que contiene 15 ml 0,05
M Tris-HCl 0,5 M y NaCl a pH 7,4. Para la iniciacin de la fibrinlisis 150 l de la
solucin de plasmingeno (1,5 mg / ml en 0.025 M Tris-HCl, 50% de glicerol, pH 7,4) y
150 l rt-PA (10 mg / ml en 0,05 M Tris-HCl , se aadieron 0,5 M NaCl (pH 7,4)) a la
mezcla. La mezcla se incub a 37 C y durante 4 horas de hidrlisis se recogieron las
muestras. Las alcuotas se utilizaron para SDS-PAGE (una mezcla de desnaturalizacin
de la protena con o sin 2-mercaptoetanol se aadi directamente a estas alcuotas) y
la determinacin de pptido solubles en TCA. La unin de AP en la superficie Cdominio. Al mismo tiempo, D-regin tambin contiene sitios de unin latentes t-PA y
el plasmingeno. La exposicin de estos sitios es un resultado de la unin no
covalente D-D: E [34].
ABREVIATURAS
NOS:
ultrasonido
rt-PA:
activador del plasmingeno tisular recombinante
t-PA:
activador del plasmingeno tisular
SDS:
dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE:
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio
HIFU:
-Ultrasonidos de gran intensidad
TCA:
cido tricloroactico
-ME:
-mercaptoetanol.
t-PA:
activador tisular del plasmingeno