Ao de la consolidacin del Mar de Grau

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

E.A.P DE MEDICINA HUMANA

CURSO

: Patologa General y Laboratorio clnico.

DOCENTE

: Dr. Juan Carlos Rodrguez Balden.

TEMA

:tcnicas histolgicas .

ALUMNO

: Arsenio flores Vsquez

DEDICATORIA
El presente trabajo va dedicado a Dios y a mi familia, por
ser mi fortaleza en el da a da en este arduo y largo
camino que es la medicina.

AGRADECIMIENTO
Al Dr. Juan Carlos Rodrguez Balden y a todos los docentes de la
facultad de medicina humana, por sus grandes enseanzas, y su
insistencia en la constante lectura, las cuales contribuyen a nuestra
formacin acadmica como futuros mdicos.

NDICE

I.

INTRODUCCINPag.1

II.

OBJETIVOS.Pag.2

III.

MARCO TERICO.Pag.3-14
3.1 obtencin de la muestra
3.2 fijacin
3.3 inclusin
3.4 microtoma
3.5 coloracin o tincin
3.6 montaje
3.7 conclusiones

IV.

CONCLUSIONES.pag.15

V.

BIBLIOGRAFAPag.16

I. INTRODUCCION

Se llama tcnica histolgica a la serie de pasos que han de darse para obtener un
preparado observable con el microscopio ptico. Es un proceso largo que abarca desde el
momento en que se toma el material hasta que el preparado puede observarse. El
examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la
luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, despus de haber pasado por las
distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro rgano visual. Por esa causa, debe ser
reducido a lminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una
serie de procedimientos.

II. OBJETIVOS
-Generales
-conocer la importancia de las tcnicas histolgicas bsicas y las preparaciones que se realizan en
el laboratorio de patologa.
-Especficos
-Conocer los diferentes procedimientos para la obtencin de muestras y la conservacin de la
estructura para ser estudiadadas en el microscopio ptico.
- reconocer los equipos y materiales necesarios en cada uno de los procedimientos realizados la
oratorio de anatoma patolgica.

III. MARCO TERICO

3.1 Obtencin de la muestra
La calidad y la fidelidad con que una clula o un tejido muestren una imagen al microscopio, con
las caractersticas morfolgicas que posean cuando estaban con vida, dependen esencialmente de
la prontitud y el cuidado que se aplic para obtener la muestra.
Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras de tejidos y rganos para
conseguir preparaciones histolgicas de buena calidad. Estos son:
3.1.1

Mediante la biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visin), consiste en la toma de un
fragmento de tejido u rgano de un ser vivo. realiza a travs de una operacin
quirrgica hecha exprofesamente o durante la intervencin quirrgica efectuada en
pacientes y corroborar as un diagnstico de una determinada lesin. La biopsia puede
ser.
Incisional
Excisional
Por sacabocados
Biopsia incisional
Por puncin y absorcin
Por raspado
Por trepanacin.
3.1.2 mediante la necropsia: las muestras se obtienen de seres muertos, En este caso es
recomendable que los tejidos y rganos se obtengan inmediatamente despus de
producida la muerte.
3.1.3 Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas,
generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de
investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica.
3.2. Fijacin
la fijacin es una operacin destinada a matar las clulas, conservndolas, cuanto sea posible en
el estado en que estn durante
la vida. Es un procedimiento
cuya finalidad, al aplicarlo es
Detener la vida de las clulas e
impedir las modificaciones post
morten que pueda sufrir la
clula (procesos autolticos),
manteniendo la estructura
morfolgica de clulas y tejidos
sin que ocurran cambios

notables en ellos. Esto se consigue inmovilizando (por coagulacin o precipitacin) las molculas
protenicas e inhibiendo principalmente las enzimticas hacindolas insolubles. Esta accin
garantiza la integridad de las clulas y tejidos; se efecta por mediante agentes qumicos
denominados fijadores.

3.2.1 Clasificacin de los fijadores

. Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos
- Oxidantes: el tetraxido de osmio (cido smico), el bicromato de potasio, cido crmico,
bicloruro de mercurio o sublimado corrosivo, cido pcrico, cido actico.
-Reductores: el formaldehdo, el glutaraldehdo, el alcohol etlico, el alcohol metlico.
La accin oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las clulas ciertas condiciones que
posibilitan una mejor aplicacin de las sustancias colorantes, por ejemplo: el alcohol etlico
absoluto conserva el glucgeno, el bicloruro de mercurio provoca que las anilinas coloreen de
manera ms brillante a las fibras colgenas, el bicromato de potasio facilita la coloracin de las
mitocondrias, el cido actico permite una mejor tincin de los ncleos, el cloruro de calcio
conserva e insolubiliza parcialmente a los lpidos.
-Condiciones de un buen fijador

Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos

agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.).

Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas
profundas de la pieza a fijar.
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.

Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin

posterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.).
Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella. 6.
No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

3.2.2. Las soluciones fijadoras suelen ser

Fijadores simples
constituidos por una sola sustancia qumica

Formol o formalina. Est considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los
laboratorios que realizan tcnica histolgica. El formol comercial consiste en una solucin
acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se presenta como un lquido claro, incoloro, que
emite vapores sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa respiratoria. Su
accin fijadora se ejerce coagulando las protenas. Es un fijador que posee un buen poder
de penetracin y difusin. Mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la
coloracin posterior de los componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras.
Conserva bastante bien a las grasas. Se le emplea en una solucin al 10% (10 del formol
comercial y 90 partes de agua).
Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.
Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula
sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.)
cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras
celulares.
Bicromato de potasio al 3-5%

Fijadores compuestos
Una sola sustancia fijadora difcilmente rene todas las condiciones para ejercer una buena
fijacin, por lo tanto es aconsejable usar mezclas fijadoras a travs de las cuales se acrecientan las
cualidades de un fijador y se atenan sus defectos y desventajas.
Formol - fosfato (formol tamponado):
solucin de formaldehdo (37% a 40%) --------------------100 ml
agua destilada ---------------------------------------------- 900 ml
fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4 - H2O) -----4.0 gr
fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4) ---------------------6.5 gr

Suele emplearse como un fijador de rutina, al igual que el formol al 10%. Posee un pH de 6.8 a 7.0
aproximadamente. Es ligeramente hipotnico.

Formol - bicloruro de mercurio.

solucin de formaldehdo (37% a 40%)--------------150 ml agua
destilada------------------------------------------------850 ml bicloruro
de mercurio------------------------------------------------------50 gr
Formol - cloruro de calcio
solucin de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml
cloruro de calcio--------------------------------------------10 gr - agua
destilada--------------------------------------------------------900ml

Lquido fijador de Boin

solucin acuosa saturada de cido pcrico-------------750 ml solucin de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml

cido actico glacial-------------------------------------------- 50 ml

Lquido fijador de Zenker ( Solucin madre o stock)

bicloruro de mercurio--------------------------------------------50 gr
bicromato de potasio---------------------------------------------25 gr
agua destilada ----------------------------------------------------------1000 m

La solucin madre se puede guardar durante mucho tiempo. Cuando a ella se le aade cido
actico forma el
Lquido de Zenker (solucin de trabajo)
- solucin madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml - cido actico glacial-----------------------------------------5 ml
En cambio, si a la solucin madre de Zenker se le agrega formol comercial se convierte en:
Lquido fijador de Helly
solucin madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml
solucin de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 ml

Fijador de Carnoy
- alcohol etlico absoluto------------------------------------60 ml
- cloroformo--------------------------------------------------30 ml
- cido actico glacial---------------------------------------10 ml

Posee un excelente poder de penetracin y de difusin. Las muestras delgadas de tejidos y

rganos se fijan en dos o tres horas. Produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuado cuando
se desea demostrar glucgeno y la tincin de ncleos y especialmente cromosoma.

3.3 INCLUSIN
Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente para que, de ellos,
se obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden de algunas milsimas de milmetro (5 a
10 um), se conseguirn cuando los tejidos se infiltren con sustancias denominadas de inclusin y
adquieran tal dureza que sometidos al filo de una navaja produzcan secciones, cortes o lminas
sumamente delgados y transparentes.
Existen una serie de sustancias de inclusin que se han empleado o se utilizan actualmente.
Solubles en agua: gelatina, carbowax, glicol metacrilato.
Solubles en solventes organicos: parafina, celoidina, resinas epxicas.
3.3.1

Inclusin en parafina

Despus de la fijacin y el lavado de las muestras, stas se encuentran embebidas en agua o en

alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con parafina, medio de inclusin insoluble en
agua y alcohol. Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser incluidos en parafina se requiere
deshidratarlos e infiltrarlos con el solvente de la sustancia de inclusin
Los pasos a seguir para la inclusin de las muestras en parafina son:
3.3.2

DESHIDRTACIONS

Significa extraer o remover el agua de los tejidos fijados. La deshidratacin debe ser completa
porque, de lo contrario, el solvente no acta de forma adecuada y el bloque de inclusin no
alcanza la dureza requerida. Para tal fin se utilizan lquidos deshidratadores en los cuales se
sumergen los tejidos. Los deshidratadores ms usados son el alcohol etlico, el alcohol isoproplico,
el dioxano y el cloroformo.

En el caso de la inclusin en parafina, las muestras se deshidratan en baos sucesivos en

soluciones de concentracin crecientes de alcohol etlico. El procedimiento de rutina es el
siguiente:
1) alcohol etlico al 70 % ---------------------------- 12 horas
2) alcohol etlico al 70 % ---------------------------- 12 horas
3) alcohol etlico al 95 % ----------------------------- 1 hora
4) alcohol etlico al 95 % ----------------------------- 1 hora
5) alcohol etlico al 100 % (absoluto) ---------------1 hora
6) alcohol etlico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas
Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuando
los frascos que contienen las muestras
3.3.3

diafanizacion

Las muestras deshidratadas se encuentran totalmente embebidas en alcohol etlico absoluto; pero
la parafina tampoco es soluble en alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que
sean capaces, simultneamente, de mezclarse con el alcohol y disolver la parafina. Estas se
denominan lquidos diafanizadores o intermediarios. Ejemplos: xilol, tolueno, benceno, y el
cloroformo.
El procedimiento de diafanizacin se realiza de la siguiente manera:
7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%) --------1 hora
8) xilol--------------------------------------------------1 hora
9) xilol--------------------------------------------------1 hora
Nota: las muestras deben agitarse continuamente para
Permitir la renovacin de los lquidos.
Inclusin y formacin del bloque de parafina
La penetracin de la parafina al interior de los tejidos se efecta cuando sta se encuentre en
estado lquido. En el comercio las parafinas se expenden en forma de bloques discoidales,
escamas, tabletas rectangulares o en forma de grumos pequeos. Las parafinas, se disuelven

usando estufas que las mantienen en ese estado. Las estufas permanecen a una temperatura
constante, generalmente de 2 o C a 4o C por encima del punto de fusin de la parafina a emplear.
La parafina diluida se coloca en tres recipientes dentro de la estufa. El primero, con una capacidad
de 1000 a 1500 cc, recibir a las muestras embebidas en xilol; la parafina reemplazar el xilol de
las muestras y se infiltrar al interior de las mismas. Los otros dos recipientes son ms pequeos
(500 cc. de capacidad) y, de manera consecutiva recibirn a los tejidos. El ltimo de ellos servir
para contener a las muestras antes del proceso de formacin de los bloques de parafina. En el
interior de la estufa debe existir otro recipiente conteniendo parafina lquida pura, que se
emplear para la formacin de los bloques. El tiempo que permanezcan las muestras dentro de
los recipientes de parafina depender de la naturaleza del tejido y el tamao de las muestras. Se

sugieren los siguientes lapsos:

10) Primer bao de parafina------------------1 a 1.5 horas

11) Segundo bao de parafina----------------1 a 1.5 horas
12) Tercer bao de parafina-----------------30 a 60 minutos
Nota: agitar las muestras con cierta frecuencia

3.4. MICROTOMIA (OBTENCIN DE LOS CORTES)

Las secciones delgadas o cortes se obtienen utilizando instrumentos mecnicos
diseados para que en forma ms o menos automtica, seccionen el bloque de parafina
en cortes delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se denominan micrtomos.

El sistema de funcionamiento de los micrtomos consta de cuatro mecanismos principales:

sujecin del bloque de parafina

sujecin de la navaja.
El que permite que el filo de la navaja seccione al bloque en cortes delgados y de grosor
uniforme.
El de avance del bloque en un nmero determinado de micrmetros despus que se ha
obtenido un corte.

Los micrtomos se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque que contiene el
tejido incluido; as, existen:
Micrtomo de rotacin tipo Minot.
Mediante una manivela circular denominada volante, el mecanismo que sujeta al bloque de
parafina se desplaza frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y viceversa en un movimiento
vertical

Microtomo de deslizamiento.
El movimiento que se realiza para obtener los cortes es horizontal, es decir de atrs hacia adelante
y viceversa. Generalmente el mecanismo que sujeta al bloque de parafina es el que se desplaza y a
la navaja permanece esttica
3.4.1 Obtencin de los cortes
1. Sujetar firmemente el bloque con el sistema de abrazaderas y la muestra orientada
correctamente.

2. Alinear el sistema de sujecin de la navaja y el filo de la misma, con la superficie de corte

del bloque.
3. Desgastar la superficie del bloque de parafina hasta alcanzar el tejido y se tenga la certeza
de abarcar toda el rea que se desea seccionar.
4. Marcar en el dial del microtomo, el nmero de micrmetros de grosor que deben alcanzar
los cortes.
5. Accionar la manivela que desplaza la abrazadera con el bloque de parafina para obtener
los cortes (aislados o seriados). Obtenidos los cortes se recogen cuidadosamente con unas
pinzas o pinceles finos).

3.4.2

Extensin y adhesin de los cortes al portaobjetos

Las secciones se extienden aisladas o formando cintas, estas se recogen y adhieren al portaobjetos
de la misma forma; en el caso que se requiera recoger los cortes aislados, extendidos previamente
como una cinta, deben separarse utilizando las mismas pinzas finas o agujas de diseccin.
Para garantizar una mejor adhesin de los cortes a los portaobjetos, se recomienda incorporar
sustancias adherentes al lquido extendedor o, en ciertos casos, al portaobjetos. Estas sustancias
suelen emplearse de dos maneras:

A)Extensin previa de la sustancia adherente a

una de las superficies de la lmina
portaobjetos, por ejemplo, la albmina de
Mayer, constituida por partes iguales de
glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le
aaden algunos cristales de timol como
ingrediente conservante. La mezcla se filtra y
se guarda en refrigeracin. Se le utiliza
extendiendo una gota de la mezcla en el
portaobjetos y se deja secar. Los cortes se
recogen cuidadosamente sumergiendo, por
debajo de ellos, el portaobjetos en forma
oblicua. Otra sustancia adherente que se
emplea de la misma manera es la poliL-lysina
(solucin de 25 miligramos de la sustancia en
25 ml de agua destilada). Una gota de la
solucin se extiende en el portaobjetos y stos
se secan a 50o - 55o C. durante toda la noche y
est lista para su uso.

Al lquido de flotacin se le aaden sustancias

adherentes. Uno de los procedimientos ms
sencillos es el que consiste en disolver, en el agua
ya caliente del bao de flotacin (dos litros) 0.5 g
de gelatina. En otros casos se emplea una solucin
que posee los ingredientes siguientes: agua destilada --------------------------------- 1,000 ml bicromato de potasio----------------------0.2 gramos
gelatina -----------------------------0.2 gramos
El agua destilada se calienta a 60 C para disolver
en ella la gelatina y el bicromato de potasio,
sucesivamente. Se filtra y est lista para su uso.
Este lquido previamente filtrado se puede utilizar
varias veces. (se recomienda guardarlo en el
refrigerador).

3.5

COLORACIN O TINCIN

El procedimiento de coloracin o tincin consiste en que una estructura celular o tisular adquiere
especficamente un color bajo la accin de una sustancia colorante. Se considera que una
estructura se ha coloreado o teido cuando al ser lavada con el lquido que disuelve al colorante,
no se decolora.
Los colorantes son cuerpos qumicos disueltos en agua destilada o a veces el alcohol. La parafina
no se mezcla con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de las clulas estas no podrn ser
teidas.
Desparafinacin de los cortes
Para realizar la desparafinacin de los cortes los mismos son introducidos en un frasco de boca
ancha que contenga xileno. Lo ideal es hacer dos baos de aproximadamente 10 min. c/u, de esta
forma se asegura una perfecta desparafinacin de los cortes. El xileno puede utilizarse varias veces
En los pasos siguiente el xileno debe ser eliminado porque sino la hidratacin del corte ser
imposible. Se elimina mediante el alcohol etlico. Se realizan sucesivos lavados en alcohol 100.96
y 70.
Una vez realizados los baos con alcohol se puede proceder a la hidratacin de los cortes. La
hidratacin es una operacin necesaria. Debe eliminarse el resto de alcohol que hay en el corte. Se
realiza sumergiendo los mismos en un frasco que contenga agua destilada, durante dos o tres min.
De esta forma el corte estar listo para comenzar algn proceso de coloracin.

3.5.1

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

ACIDOS. son sales cuya parte bsica es incolora y el componente cido posee color. As, en el
colorante eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se debe al cido eosnico y no a la
base, el sodio.
BASICOS Son sales que poseen la base coloreada e incolora la porcin cida; por ejemplo, el azul
de metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe su propiedad colorante a la base azul de
metileno y no al cido clorhdrico que es incoloro.
Neutros Son sales en las que tanto la parte bsica como la parte cida proporcionan color. Por
ejemplo el eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur de metileno.
Indiferentes o forman sales. Son compuestos no inicos incapaces de la disociacin electroltica.
Son insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos como el alcohol y tambin en las
grasas o lpidos y, aunque ellos poseen color, en realidad estrictamente hablando no son

colorantes. Basndose en que son solubles en las grasas, estas sustancias se utilizan para
demostrar la presencia de ellas en clulas y tejidos, pues tien selectivamente a los lpidos. Los
ejemplos son: El sudan negro, el sudn III y el sudn IV, El rojo oleoso.

3.5.2. Coloraciones
Coloracin de hematoxilina y eosina:

Desparafinar los cortes: realizar dos baos de xileno de 10 a 15 min. c/u.

Eliminamos el solvente por sucesivos baos en: alcohol de 100, 96, 70 de 1 a 2 min. c/u.
Hidratacin de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min. Tincin nuclear: en
hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada. Viraje de la
hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.).
Lavado en agua destilada o corriente.
Coloracin citoplasmtica: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5%
durante 15 a 30 seg.
Lavado en agua destilada.
Deshidratar, aclarar y montar.
Los pasos de la deshidratacin pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37
por 15 a 20 ministo para comenzar algn proceso de coloracin.

6. MONTAJE
Tiene por objeto mejorar la observacin, facilitar el manejo y aumentar la duracin de los
preparados histolgicos. La coloracin deja totalmente embebido en agua al preparado y debe ser
eliminada. Esta parte de la Tcnica Histolgica consta de 4 pasos:
a) Deshidratacin: A travs de alcoholes en forma creciente 70, 80, 96, 100.
b) Homogenizacin (aclaracin o diafanizacin): Con benzol o xilol, adicionando cido carbnico o
fnico, muy vidos de agua.
c) Colocacin del cubreobjeto: Para proteger la preparacin, se recubre con una laminilla de vidrio
muy fina y de diversos tamaos. Para adherir el cubreobjeto al porta, quedando entre ambos el
corte, se utiliza Blsamo de Canad, sustancia soluble en benzol o xilol, de modo que difunde bien
en el corte aclarado. Adems su ndice de refraccin es semejante al del vidrio, lo cual evita la
desviacin de los rayos luminosos.

d) Fijacin de la coloracin: Solo en el caso de usar colorantes lbiles, poco estables, como por
ejemplo los colorantes bsicos de anilina

Resumen de tcnicas de estudio en histologa

IV CONCLUSIN
Los mtodos para la obtencin de preparaciones histolgicas ocupadas en los estudios de
microscopia ptica, se engloban en la Tcnica Histolgica. La Tcnica Histolgica abarca
varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se
conocen, montados bajo un cubre objeto con imgenes de estructuras contrastadas, para su
estudio bajo microscopia ptica o electrnica. Las tcnicas histolgicas son de gran importancia en
el estudio de patologa para diferencias las estructuras histolgicas que estn integradas y las que
se encuentran cambios patolgicos en su estructura.

V. BIBLIOGRAFA

ROSS, M. H. y W. PAWLINA Histologa, tcnicas de citologa, Ed. Panamericana, 6 ed., 2013.

WELSCH, U. Histologa /Sobotta Ed. Panamericana, 3 ed., 2014.

J.D. Bancroft and A. Stevens, "Theory and Practice of Histological Techniques", Churchill
Livingstone, Edimburg, 1990.

http://www.monografias.com/trabajos11/intecnic/intecnic.shtml#ixzz4Jlo8fosC
http://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/tecnicas-corte.pdf