Anda di halaman 1dari 7

PRAKTIKUM 6

PEMBUATAN SEDIAAN HISTOLOGI


PEWARNAAN HEMATOXYLIN-EOSIN

TUJUAN
1. Mahasiswa mampu untuk membuat sediaan histologi jaringan yang dapat dianalisa
lanjut dengan mikroskop
2. Mahasiswa mampu untuk melakukan berbagai macam pewarnaan hematoxylin-Eosin
(HE) dalam proses pembuatan sediaan histologi.

PENDAHULUAN
Metode pembuatan sajian preparat jaringan dari spesimen tertentu melalui suatu
rangkaian proses hingga menjadi preparat histologi yang baik dan siap untuk dianalisis
dinamakan histoteknik. Spesimen dapat berasal dari manusia, hewan maupun tumbuhan.
Preparat yang baik dapat digunakan untuk mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan
fisiologis atau patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada
penelitian, dan penegakan alat bantu diagnosis penyakit.
Pembuatan preparat histologi dapat dilakukan menggunakan metode parafin dan
teknik pengecatannya dapat dilakukan dengan pewarnaan HE (Haematoxylin-Eosin) dan
MT (Mason Trichome). Pada umumnya pembuatan preparat histology banyak menggunakan
pewarnaan HE dengan harapan sudah cukup baik untuk menampilkan secara jelas strukturstruktur jaringan, karena secara teoritis Haematoxylin dapat mewarnai inti sel dan
memperlihatkan bagian dalam inti sel, sedangkan Eosin dapat mewarnai sitoplasma.
Salah satu langkah penting dalam pembuatan preparat histology adalah pewarnaan .
Pewarnaan dilakukan agar unsur jaringan menjadi kontras dan dapat diamati dibawah
mikroskop. Munculnya warna pada sediaan terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul
tertentu yang terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang
gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya mikroskop yang
dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan. Zat
warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu
sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.

Adapun Pewarnaan yang dapat digunakan adalah Hematoxylin Eosin (HE) digunakan
untuk

memberikan

efek

warna

pada

inti

sel

dan

sitoplasma

serta

jaringan

penyambungnya.Pada pewarnaan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu hematoksilin yang


berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik), eosin merupakan
counterstaining hematoksilin digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan
penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda.
Hematoxylin Eosin (HE)
Adapun beberapa larutan hematoksilin yang digunakan sebagai berikut.
a.

Hematoksilin Erlich
Hematoksilin Erlich ini mudah berdiferensiasi dan warnanya relative tahan lama.
Waktu inkubasi yang digunkan sekitar 30 menit dengan counterstaining eosin dalam
air sekitar 0.5 -1% Formula Hematoksilin Erlich adalah sebagai berikut

Hematoksilin .................... 6 gram


Alkohol absolut ................ 300ml
Akwades ........................... 300ml
Glycerol ........................... 300 ml
Glacial acetic acid ............. 30 ml
Potassium alum .......... berlebihan

b. Hematoksilin Delafield
Hematoksilin Delafield ini tahan disimpan dalam bertahun-tahun dan dapat digunakan
3 hari setelah pembuatan. Waktu inkubasi yang digunakan sekitar 15-20 menit menit
dengan counterstaining eosin dalam air sekitar 0.5 -1%.
Formula Hematoksilin Delafield adalah
Hematoksilin kristal ............. 6 gr
Alkohol absolut ................. 50 ml
Ammonium alum ............... 55 gr
Aquades ........................... 600ml
Glycerol ............................ 150ml

c. Hematoksilin Mayer
Hematoksilin Mayer ini membutuhkan waktu inkubasi yang sekitar 10-15 menit menit
dengan counterstaining eosin dalam air sekitar 0.5 -1%.

Larutan ini hanya tahan

disimpan dalam hitugan bulan.


Formula Hematoksilin Mayer sebagai berikut.
Hematoksilin kristal ............................. 1gr
Aquades ............................................ .... 1000ml
Sodium iodate ...................................... 0.2 gr
Ammonium/potassium alum ................ 50gr
Citric acid ............................................. 1gr
Chloral hydrate ..................................... 50gr

d. Hematoksilin Harris
Larutan pewarna Hematoksilin Harris membutuhkan waktu inkubasi 15-20 menit
dengan counterstaining eosin 0.5-1% larutan eosin.
Formulanya Hematoksilin Harris sebagai berikut.
Kristal hematoksilin .......................... 5.0 gr
Alkohol 100% ................................... 50 ml
Ammonium/potassium alum ........... . 100 gr
Distilled water ............................... 1000 ml
Merkuri oksida ................................. 2.5 gr
Larutan Counterstaining
Pewarna yang digunakan sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin,
safranin dan phloxine.
1. Larutan Eosin
Larutan eosin yang digunakan terdiri dari larutan stok (Stock solution) dan larutan kerja
(working solution). Larutan kerja (working solution) dibuat sesaat sebelum digunakan dan
perlu penambahan asam asetat glasial 0.5 ml per 100 ml larutan.
Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut
1% Stock Alkohol-Eosin
Eosin Y, water soluble ................... 1.0 gr

Distilled water .............................. 20 ml


Larutkan dan tambahkan
Alkohol 95% ................................ 80 ml
Working Eosin Solution
Eosin stock solution ................. 1 bagian
Alkohol 80% .............................. 3 bagian

2. Larutan Phloxine
Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution dan
larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut
Stock Eosin
Eosin Y water soluble................... 1 gram
Distilled water .............................. 100ml
Stock Phloxine
Phloxine B .................................... 1.5 gr
Distilled water .............................. 100ml
Working Solution
Stock Eosin .................................. 100ml
Stock Phloxine ................................. 10ml
Alkohol 95% ............................... 780ml
Asam asetat glasial ......................... 4ml
2% Alkohol Safran
Safran du Gatinais ...................... 2 gram
Alkohol 100% ............................ .. 100ml

ALAT DAN BAHAN


1. Spesimen
2. Canada balsam
3. Hematoksilin
4. Eosin
5. object glass
6. deck glass
7. aquades

8. mikroskop
9. alcohol/ etil alcohol
10. xylol
11. asam pikrat

PROSEDUR KERJA
Persiapan
1.

Larutkan pewarna hematoksilin dalam alkohol, kemudian tambahkan zal lainnya

2. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik
3. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan dengan
menyaringnya menggunakan kertas saring
4. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan
dalam wadah yang sesuai
5. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan
6. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol yang akan
menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
I. Pulasan Mayer hematoksilin-eosin
Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut
1. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)
2. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) 95% (2min) 90% (2 min)
80% (2 min) - 70% (2min) Distilled water (3min)
3. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min
4. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit
5. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir
selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah
selanjutnya
6. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga
2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan
7. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70%
hingga 100% masing-masing 2 menit.
8. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min
9. Tutup dengan balsem kanada

Hasil/ Interpretasi adalah

Inti sel bewarna biru

Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada


komponen tertentu

II. Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin


Protokol pulasan hematoksilin Harris eosin adalah sebagai berikut
1. Deparafinisasi dalam xylol
2. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70%
3. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min
4. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat
5. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi
warna di bawah mikroskop
6. Bilas dalam air mengalir secara singkat
7. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga
potongan bewarna biru cerah
8. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal
jaringan sulit terwarna oleh Eosin
9. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit
10. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan,
masing-masing selama 2 menit
11. inkubasi dalam xylol 2x2menit
12. Tutup dengan kaca penutup
Hasil/Interpretasi hasil pulasan

Inti sel bewarna biru

Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna


pada komponen tertentu

III. Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran


Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut
1. Deparafinisasi dalam xylol
2. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70%
3. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit

4. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang


5. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit
6. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit
7. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit
8. Basuh dengan air selama 5 menit
9. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali
10. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit
11. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali
12. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit
13. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada
Hasil/interpretasi

Inti bewarna biru

Sel darah merah bewarna vermillion pink

Tulang bewarna kuning

Tulang rawan bewarna hijau kekuningan

Otot bewarna merah

Serat kolagen bewarna kuning

Anda mungkin juga menyukai